全 文 ：现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2011, Vol.27, No.7
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蚕蛹蛋白酶解制备抗氧化肽的初步研究

李高扬，崔堂兵，陈亮
（华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006）
摘要：将蚕蛹通过粉碎和丙酮脱脂后，得到蚕蛹蛋白粉。用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶酶解蚕蛹
蛋白粉，以DPPH清除能力为指标对酶解过程进行分析，结果表明胃蛋白酶对蚕蛹蛋白有较好的酶解效果。然后通过正交优化胃蛋白酶的
酶解条件，并研究水解产物多肽的体外抗氧化活性。
关键词：蚕蛹蛋白；酶解；抗氧化；肽
文章篇号：1673-9078(2011)7-810-814
Preliminary Study of Enzymatic Hydrolysis of Silkworm Pupa Protein for
Production of Antioxidant peptide
LI Gao-yang, CUI Tang-bing, CHEN Liang
(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 51006, China)
Abstract: Silkworm pupa was crushed and defatted by acetone, giving silkworm pupa powder. Then the powder was hydrolyzed with five
proteases (Alkali protease, neutral protease, pepsin, papain, trypsin). Among the tested enzymes, pepsin was confirmed as an optimal enzyme
preparation to prepare silkworm pupa polypeptide in terms of DPPH· scavenging activity of hydrolysates. The enzymatic hydrolysis procedure was
optimized using orthogonal array method and the corresponding product was subjected to further analysis of antioxidant activity, such as reducing
power and O2·, ·OH and DPPH·scavenging activities.
Key words: silkworm pupa protein; enzyme hydrolysis; antioxidation; peptide

生物活性肽(bioactive peptides)是指来源于细菌，真
菌，植物，动物等，对生物机体的生命活动有益或具有
生理作用的肽类化合物，是蛋白质中天然氨基酸以不同
组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构
的不同肽类的总称[1]。自Brnatl等[2]证明牛乳蛋白酶解后
的产物具有阿片肽活性以来，科学家发现蛋白的多肽链
内部可能普遍存在着功能区，选择适当的蛋白酶水解这
些多肽，有可能将其释放出来，从而制备各种各样的生
物活性肽。随之，人们开展了酶解动植物蛋白以获取特
定生物活性肽的研究，随后这一领域的工作迅速成为动
物营养学和生理学界的研究热点。
蚕蛹蛋白是一种优质蛋白质资源，含有18种氨基酸，
其中8种人体必需氨基酸含量超过氨基酸总量40%，其蛋
白含量约为50%，是一种比大豆蛋白更具营养价值的优
质蛋白质资源[3~4]。本实验拟以蚕蛹蛋白为原料，采用酶
水解法制备蚕蛹蛋白肽，对水解产物的抗氧化活性进行
探讨。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
收稿日期：2011-03-08
1.1.1 材料
蚕蛹为商品用蚕蛹；胃蛋白酶，购至于北京普博欣
生物科技有限公司；胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，碱性蛋白
酶，中性蛋白酶，购至于广州市齐云生物技术有限公司。
1.1.2 试剂
正己烷、丙酮、乙酸乙酯、邻苯三酚、罗丹明 B、
氢氧化钠、盐酸、硫酸亚铁、H2O2、乙睛、四硼酸纳、
醋酸、醋酸钠、硫酸亚铁、H2O2、磷酸二氢钠、磷酸氢
二钠、铁氰化钾、氯化铁、抗坏血酸（Vc）、卵黄卵磷
脂、β-巯基乙醇、四硼酸纳、十二烷基硫酸钠（SDS）
等均为国产分析纯。DPPH、EDTA 购自美国 Sigma 公司。
1.2 实验仪器与设备
UV2800 紫外可见分光光度计，电子天平，pH 计
PB-10，超纯水系统，台式大容量高速离心机，HH-S 型
水浴锅，旋转蒸发仪，真空冻干机。
1.3 实验方法
1.3.1 蚕蛹粉的制备及前处理
将蚕蛹通过 40 目粉碎，然后用丙酮以等体积混合
40 ℃脱脂，得到脱脂蚕蛹粉。
预处理方法优化：
（1）超声细胞破碎法：取 10 g 蚕蛹粗蛋白粉，加
DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2011.07.015
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入 100 mL 去离子水，于 80 HZ，间隔 2 sec，破碎 10 min。
5000 r/min 离心 10 min，凯氏定氮法测定上清液中总氮。
（2）去离子水浸泡法：取 10 g 蚕蛹粗蛋白粉，加
入100 mL去离子水浸泡10 min，5000 r/min离心10 min，
凯氏定氮法测定上清液中总氮。
（3）微波破碎法：取 10 g 蚕蛹粗蛋白粉，加入 100
mL 去离子水，于低火，微波 10 min。5000 r/min 离心
10 min，凯氏定氮法测定上清液中总氮。
1.3.2 最佳水解酶的筛选[5]
在底物浓度为 5%，酶用量[E/S]6000 U/g，温度为
40 ℃，各酶的最适水解 pH 值下（胃蛋白酶：pH 2.0，
胰蛋白酶：pH 8.0，木瓜蛋白酶及中性蛋白酶：pH 7.0，
碱性蛋白酶：pH 9.0），水解 1、2、4、8、12 h 分别取样，
测定酶解液 DPPH·清除能力及多肽含量变化。
水解工艺流程如下：
蚕蛹蛋白粉加水→调节 pH→加酶恒温水解→沸水浴 15 min
灭酶
1.3.2.1 酶解液 DPPH·清除能力参照[6]
1.3.2.2 多肽含量的测定[7]
将 2 mL 酶解液加 2 mL 15%三氯乙酸沉淀静置 10
min，5000 r/min 离心 10 min；取上 1 mL 上清用双缩脲
法[4]测多肽含量。
1.3.3 蛋白酶对蚕蛹蛋白水解度的影响
采用邻苯二甲醛分光光度法(OPA 法)[8]。
1.3.4 胃蛋白酶水解工艺参数优化
反应温度、起始 pH、底物浓度、酶用量和反应时间
是蛋白酶水解的重要工艺参数。以反应起始 pH、反应温
度、底物浓度、酶用量和反应时间为试验因素，以
DPPH·清除能力为主指标，以水解度为辅指标对蚕蛹蛋
白的胰蛋白酶水解参数作了正交优化试验 L16(45)，试验
设计见表 1。
表1 胃蛋白酶水解蚕蛹蛋白的正交实验设计
Table 1 Orthogonal experiment design for pepsin hydrolyzing
silkworm pupa protein
水平
因素
A(温度
/℃)
B(起始
pH)
C[E/S
/(U/g)]
D(酶解时
间/h)
E(底物浓
度/%)
1 40 1.5 2000 2 1
2 45 2.0 4000 4 2
3 50 2.5 6000 6 3
4 55 3.0 8000 8 4
水解度(DH)的测定参照 1.3.3，酶解液 DPPH·清除能
力参照 1.3.2.1。
1.3.5 酶解液体外抗氧化活性研究
1.3.5.1 超氧阴离子（O2-·）自由基清除能力测定参照[9]
1.3.5.2 羟自由基（·OH）清除能力测定参照[10]
1.3.5.3 还原力的测定参照[11]
1.3.5.4 抑制脂质过氧化实验参照[12]
2 结果及讨论
2.1 蚕蛹蛋白粉的制备及前处理
表2 不同破碎方法对蚕蛹蛋白浸出的影响
Table 2 Effect of different disruption methods on protein
extraction from silkworm powder
方法 上清液蛋白含量/%
超声细胞破碎 12.125
微波破碎 8.265
去离子水浸泡 1.884
实验过程中发现，超声细胞破碎的蚕蛹上清液呈乳
黄色，而微波破碎法提取的蚕蛹上清液为澄清的浅棕色
溶液，水提法的上清则颜色更淡。
由表 2 可见，超声波作用作用于蚕蛹蛋白，能够获
得较多的可溶性蛋白质和多肽，利于下一步的酶解，在
以后的试验中，采用超声波 100 Hz，间隔 2 s，破碎 10
min，对蚕蛹蛋白粉进行预处理。
2.2 最佳水解酶的筛选
2.2.1 酶解液 DPPH·清除能力

图1 酶种类和水解时间对蚕蛹蛋白水解液DPPH·清除率的影响
Fig.1 Effects of enzymes and hydrolytic time on
DPPH· scavenging efficiency of silkworm protein hydrolysat
不同蛋白酶在不同水解时间对蚕蛹蛋白的DPPH·清
除率影响如图 1。图 1 表明以胃蛋白酶水解效果最好。
而 5 种蛋白酶对乌骨鸡蛋白水解液的水解结果是不同
的，但总体趋势都是羟自由基清除率先增加然后减少。
可能是一开始大分子肽在蛋白酶的作用下水解成小分子
肽，同时将具有抗氧化活性的肽段释放出来，但也有具
有抗氧化活性的肽段被水解成无活性的肽段或氨基酸，
到后期由于酶的部分失活导致后期水解液活性基本上不
变化，所以呈现出先是对 DPPH·增加然后逐渐减小的过
程。虽然现发现的抗氧化肽绝大多数都是小于 20 个氨基
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酸残基的，但是并不是所得肽分子量越小，抗氧化活性
越高，影响抗氧化活性的关键在于氨基酸的组成及排列
次序。
2.2.2 酶解液多肽含量的测定
不同蛋白酶在不同水解时间对蚕蛹蛋白水解肽含量
的影响如图 2。图 2 表明，多肽含量是随着水解时间的
延长而增加的，胃蛋白酶水解产物的多肽含量与其它酶
的相比增加较为明显，对 DPPH·的清除率来说多肽含量
并不是越高越好，这可能是由于水解后期抗氧化肽被水
解成更小的肽或氨基酸而导致羟自由基的清除能力反而
下降了。

图2 酶种类和水解时间对蚕蛹蛋白水解液中肽含量的影响
Fig.2 Effects of enzymes and hydrolytic time on peptide content of
silkworm protein hydrolysat
2.2.3 蛋白酶对蚕蛹蛋白水解度的影响

图3 蚕蛹蛋白水解度的变化
Fig.3 Changes of DH of silkworm protein
不同蛋白酶在不同水解时间对蚕蛹蛋白的水解度的
影响如图 3。图 3 表明，水解度随着水解时间的延长都
是略微有所增加的，在 4 h 后不再变化，由于这时蛋白
酶失活比较严重。
综合考虑蛋白酶对蚕蛹蛋白 DPPH·清除能力、多肽
含量和水解度变化的影响，选择胃蛋白酶作为进一步优
化的酶来提高蚕蛹蛋白抗氧化的能力。
2.3 胃蛋白酶水解蚕蛹蛋白的条件优化
反应温度、起始 pH、底物浓度、酶用量和反应时间

是蛋白酶水解的重要工艺参数。以反应起始 pH、反应温
度、底物浓度、酶用量和反应时间为试验因素，以
DPPH·清除为指标，水解度为辅指标，对蚕蛹蛋白的胃
蛋白酶水解参数作了正交优化试验 L16(45)，试验结果见
表 3。
表3 胃蛋白酶水解蚕蛹蛋白的正交实验结果
Table 3 Orthogonal experiment results of pepsin-catalyzed
hydrolysis of silkworm pupa protein
编号 A B C D E 清除率/% DH/%
1 1 1 1 1 1 60.1 20.4
2 1 2 2 2 2 51.4 21.4
3 1 3 3 3 3 59.5 22.2
4 1 4 4 4 4 70.3 25.2
5 2 1 2 3 4 75.2 25.6
6 2 2 1 4 3 58.2 19.3
7 2 3 4 1 2 53.1 21.1
8 2 4 3 2 1 58.2 26.5
9 3 1 3 4 2 60.4 20.8
10 3 2 4 3 1 61.2 21.6
11 3 3 1 2 4 71.2 25.2
12 3 4 2 1 3 60.3 24.3
13 4 1 4 2 3 68.4 21.5
14 4 2 3 1 4 70.1 24.3
15 4 3 2 4 1 50.6 18.6
16 4 4 1 3 2 53.4 20.5
K1 60.3 66.0 60.7 60.9 57.5
K2 61.1 60.2 59.3 62.3 54.5
K3 63.2 58.6 62.0 62.3 61.6
K4 60.6 60.5 63.2 59.8 71.7
R 2.95 7.42 3.87 2.45 17.12
五个因素对 DPPH·清除率影响顺序依次是：底物浓
度>起始 pH>加酶量>温度>酶解时间，最优水解条件为：
50 ℃，pH 1.5，加酶量为 8000 U/g，酶解时间 6 h，底物
浓度为 4%。
2.4 酶解液体外抗氧化活性研究
2.4.1 酶解液对超氧阴离子（O2-·）自由基的清除能力
邻苯三酚在碱性条件下会发生自氧化，生成有色中
间产物和超氧阴离子自由基(O2-·)，中间产物的积累在滞
后30~45 s后与时间呈良好的线性关系，一般维持4 min，
随后减慢。其自氧化产物在 320 nm 呈现最大吸收，超
氧阴离子自由基对自氧化有催化作用，抗氧化肽对邻苯
三酚自氧化的抑制率可作为它对超氧阴离子自由基的清
除率的表征，通过抑制自氧化速率较少中间产物的积累，
据自氧化速率变化来计算抗氧化肽对 O2-·的清除率。
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图4 蚕蛹蛋白水解液及Vc对O2-·的清除效果
Fig.4 O2-· scavenging capabilities of silkworm protein hydrolysate
and Vc
由图 4 可知蚕蛹蛋白水解液能明显降低邻苯三酚自
氧化的速率，呈剂量关系，随着水解液浓度增加，抑制
率迅速增高，但随着浓度增加到一定值后，抑制率不再
随浓度增大而继续大幅度提高，而在清除 O2-·能力上，
蚕蛹蛋白水解液比 Vc 相对要弱。
2.4.2 酶解液对羟自由基（·OH）的清除能力
Fenton 反应是生物体内产生·OH 的主要反应，简单
表示为：Fe2++H2O2→·OH+Fe3++OH-。本方法采用 Fenton
反应产生羟基自由基，加入显色剂罗丹明 B，所产生
的·OH 与罗丹明 B 作用后使体系吸光度降低，利用吸光
度的变化间接测定所产生的·OH。该方法稳定，可作为
一种简便的筛选抗氧化剂的方法

图5 蚕蛹蛋白水解液及Vc对·OH的清除效果
Fig.5 ·OH scavenging effects of silkworm protein hydrolysate and
Vc
图 5 表明蚕蛹蛋白水解液对·OH 有较强的清除能
力，在高浓度时其清除能力比 Vc 更强。相同浓度的肽
清除·OH 自由基的能力比清除超氧阴离子能力高，可能
跟·OH 自由基极强的氧化能力及肽类能与 Fe2+鳌合在一
起有关。由于·OH 极强的氧化能力能将所有的有机质都
氧化了，从而使肽类易于被氧化，并且肽类也有可能与
Fe2+鳌合在一起从而减缓了 Fenton 反应产生·OH。
2.4.3 酶解液对还原力的影响

图6 Vc的还原能力
Fig.6 The reductive activity of Vc

图7 蚕蛹蛋白水解液的还原能力
Fig.7 The reductive activity of silkworm protein hydrolysate and
Vc
还原能力是表示抗氧化物质提供 H·的重要指标,抗
氧化物质通过提供 H·可使自由基变为稳定的分子，从而
失去活性。许多研究已经证实抗氧化活性同还原能力是
密切相关的。以普鲁士蓝[Fe4(Fe(CN)6)3]的生成量作为指
标，将 K3Fe(CN)6还原成 K4Fe(CN)6，K4Fe(CN)6再利用
Fe3+形成普鲁士蓝，由 700 nm 处吸光值变化测定还原力
大小，样品在 700 nm 处的吸光值越大，其总还原能力
越强，而样品的抗氧化能力也就越强。图 7 表明蚕蛹蛋
白水解液在 10 mg/mL 时的还原力与浓度为 0.1 mg/mL
的 Vc 相当。由此可见蚕蛹蛋白水解液具有一定的还原
力。
2.4.4 酶解液对脂质过氧化的影响

图8 蚕蛹蛋白水解液及Vc对脂质体氧化的影响
Fig.8 Effects of silkworm protein hydrolysate and Vc on the
liposome oxidation
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在生物体系中，细胞膜和细胞器膜含有大量不饱和
脂肪酸侧链，极容易引起脂质过氧化，很多疾病和衰老
现象都与脂质过氧化有关。多不饱和脂肪酸在自动氧化
过程中最终产物是丙二醛(MDA)，在较低的 pH(p=H3.0
左右)和高温下，它可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成
一种粉红色物质，该物质在可见光区 532 nm 处有特征
吸收，因此常用此法检验多不饱和脂肪酸的过氧化程度。
图 8 表明，蚕蛹蛋白水解液对脂质体氧化有一定的抑制
作用，但与 Vc 相比，抗氧化效果不明显。
4 结论
蚕蛹通过丙酮脱脂，用 5 种不同的酶进行酶解，筛
选出胃蛋白酶对蚕蛹蛋白有较好的酶解效果，得到的酶
解液有较高的抗氧化活性。用正交优化胃蛋白酶的水解
条件为：50 ℃，pH 1.5，加酶量为 8000 U/g，酶解时间
6 h，底物浓度为 4%。本文并未进行多肽的的分离纯化，
接下来建议通过制备型的 HPLC 进一步纯化抗氧化肽，
并通过质谱确定抗氧化肽的序列以作进一步深入研究。
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