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桑根的反式二苯乙烯对 HepG2细胞的抑制作用
玄永浩1 ,金英善 2＊ ,金允哲 3 ,朴姬玉3
(1.扬州大学广陵学院 ,江苏 扬州 225127;2.扬州大学生物科学与技术学院 ,江苏 扬州 225009;3.吉林
省龙井市林业局 ,吉林 龙井 133400)
　　摘要　目的:探讨桑根中提取分离的 2, 5′-二羟基-4, 3′-二(β-D-吡喃糖氧基)-反式二苯乙烯(DGTS)对 HepG2
肝癌细胞的抑制增殖和诱导凋亡的作用。方法:应用台盼蓝排斥法检测不同质量浓度 DGTS对 HepG2细胞的增殖
抑制作用;琼脂糖凝胶电泳测定细胞 DNA的片段化;应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:DGTS作用 72 h后 ,
HepG2细胞的增殖明显受到抑制。不同浓度 DGTS作用 48 h后 ,出现 HepG2细胞凋亡特征性的 DNA梯度降解。
经 DGTS作用 24、48、72 h后 , HepG2细胞的凋亡率分别为 0.96%、2.05%、 3.29%。结论:DGTS能明显抑制 HepG2
细胞增殖 , 并存在剂量-效应关系和时间-效应关系。
关键词　2, 5′-二羟基-4, 3′-二(β-D-吡喃糖氧基)-反式二苯乙烯;HepG2细胞;凋亡
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2009)11-1726-03
收稿日期:2008-11-19作者简介:玄永浩(1971-),男,讲师 ,博士 ,主要从事植物生理活性研究;Tel:0514-87993984, E-mail:xuanyonghao@hanmail.net。＊通讯作者:金英善 , Tel:0514-87991556-8688, E-mail:ysjin@yzu.edu.cn。
　　肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病 ,同时
也是凋亡异常的疾病 。细胞凋亡受抑 ,存活期延长 ,
死亡率下降 ,细胞数目增加 ,表现出生长优势 ,是肿
瘤发生的一个重要基础〔1〕。桑是药食兼用的植物 ,
在东西方都作药用。 2, 5′-二羟基 -4, 3′-二(β-D-吡
喃糖氧基)-反式二苯乙烯 [ 2, 5′-Dihydroxy-4, 3′-di
(β-D-glucopyranosyloxy)-trans-stilbene, DGTS]是从
桑根中提取出来的一种反式二苯乙烯 〔2〕。体外实
验证明 , DGTS具有明显的抗氧化活性和抑制过氧
化脂质的作用 〔3〕。动物实验证明 , DGTS对四氯化
碳引起的急性肝损伤有肝保护作用;对链脲佐菌素
引起的糖尿病大鼠有抗糖尿病作用〔2-5〕。本研究以
体外培养的人肝癌 HepG2细胞株为对象 ,观察不同
质量浓度的 DGTS对 HepG2细胞的抑制增殖和诱
导凋亡作用 ,为将其开发为新一代抗肿瘤药物提供
实验依据。
1　材料
1.1　细胞株及其细胞培养　HepG2细胞引自韩国
细胞株银行。该细胞株培养于含 10%新生小牛血
清的 RPMI-1640培养液中 ,置 37 ℃、 5% CO2培养
箱 ,每 3d传代 1次。所有实验用的细胞均处于对
数生长期 。
1.2　DGTS样品制备　按照文献〔2〕的方法提取分
离。取 100 g干燥样品 ,以 2 L的 80%甲醇溶液提
取 1 h。滤液浓缩后用 500 mL蒸馏水溶解 ,经 MCI
gelCHP20P色谱柱 (2.5 cm×40 cm)分离 , 20%甲
醇和 30%甲醇部分收集浓缩后 ,溶于 10 mL的 70%
甲醇 ,经 SephadexLH-20凝胶柱分离 ,再用 UV-VIS
和 HPLC在 326 nm处得到单一物质(DGTS)。
1.3　主要试剂　RPMI-1640、小牛血清为 Gibco公
司产品;RNaseA为 NEC公司产品;annexinV/PI双
染色试剂盒为美国 ADL公司产品。
2　方法
2.1　细胞存活率计数　采取台盼蓝排斥法检测。
·1726· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 11期 2009年 11月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2009.11.030
以 1×106个细胞接种于 100 mL培养瓶 ,细胞贴壁
后换液 ,加入 DGTS使其终质量浓度分别为 5、20、
80 μg/mL。设无药物干预的细胞为阴性对照组 ,加
入紫杉醇 0.5 μg/mL进行药物干预的细胞为阳性
对照组 。各组少许细胞混悬液 0.4%台盼蓝混匀 2
min,按白细胞计数法在光镜下计数蓝染细胞。
2.2　流式细胞仪分析　采用流式细胞仪以 Annex-
inV-FITC/PI(Propidiumlodide)双标记染色法分析
细胞凋亡情况。将细胞以每瓶 2 ×105接种于 50
mL培养瓶 ,置 37℃、5%CO2培养 24h后 ,弃上清 ,
按照 “ 2.1”项中分组加入相应作用物 ,每组设 3个
复瓶 ,分别培养 24、48、72 h后 ,收集培养细胞 , PBS
洗两次 ,重悬于 200 μL的结合缓冲液 。加 FITC标
记的 AnnexinV10 μL和 PI5μL,轻轻混匀 , 4 ℃反
应 30min,加入 300 μL结合缓冲液 ,立即在流式细
胞仪上检测 。每次检测取 1 ×104 个以上细胞 ,
CELLQuest软件分析细胞凋亡率。
2.3　凋亡细胞 DNA的琼脂糖凝胶电泳　收集经
5、10、20、40、80、200 μg/mLDGTS作用 48 h后细胞
1 000×g离心 15min,重悬细胞于 100μL裂解缓冲
液 (10 mmol/LTris-HCl, pH=7.4, 含 10 mmol/L
EDTA及 0.5% TritonX-100)中 ,置 4 ℃下 20 min,
12 000×g离心 30 min。上清液中加入 RNaseA后 ,
37 ℃保温 1 h加入 2 mol/LNaCl20 μL和异丙醇
120μL,混合物置 -20 ℃过夜 。次日 15 000×g离
心 20 min,弃上清 ,加 TE溶解 。 1.5%琼脂糖凝胶
(含 0.5 g/mL溴化乙啶)电泳(100 V, 45min),紫外
透射光观察并记录。
2.4　统计学处理　应用 SPSS10.0软件进行 t检
验 。
3　结果
3.1　DGTS对 HepG2细胞增殖活性的影响　阴性
对照组 HepG2细胞随着培养时间的延长 ,有一定程
度的增殖;终质量浓度分别为 5、20、 80 μg/mL的
DGTS作用的细胞随着培养时间的延长 ,受到一定
的抑制;DGTS作用 72 h后 , HepG2细胞的增殖明显
受到抑制 ,而紫杉醇(paclitaxel)0.5 μg/mL组的抑
制作用更强;且随着作用时间的延长 ,其抑制程度越
强 ,抑制率越高 ,见图 1。表明 DGTS对 HepG2细胞
增殖有明显的抑制作用 ,随着药物质量浓度的增大 ,
DGTS对 HepG2细胞的增殖抑制作用更加明显 。
3.2　DGTS对细胞凋亡的影响 　不同质量浓度
DGTS作用 48 h的 HepG2细胞 DNA电泳结果见图
2。用 DGTS干预处理 48 h后 ,出现凋亡细胞特征
性的 DNA梯度降解 ,显示清晰的阶梯状 DNALad-
der,每个条带都是相当于 180 ～ 200 bp的整数倍。
HepG2细胞 DNA随着 DGTS质量浓度的增加而明
显降解。
图 1　DGTS对 HepG2细胞增殖的抑制作用( x±s, n=3)
注:与空白对照比较 , ＊P<0.05
图 2　各组 DGTS干预处理 48h后 HepG2
细胞 DNA降解的电泳结果
M.Marker　1.5 μg/mL　 2.10 μg/mL　 3.20 μg/mL　
4.40μg/mL　5.80 μg/mL　6.200 μg/mL
3.3　AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术检测
HepG2细胞的凋亡　采用 AnnexinV-FITC/PI双染
法用流式细胞仪检测 HepG2细胞经 DGTS作用 24、
48、72h的细胞凋亡情况。结果显示:正常对照组
HepG2细胞的凋亡率为 0.05%;作用 24、48、72 h
后 ,其凋亡率分别为 0.96%、2.05%、3.29%, 与对
照比较 ,处理组凋亡率显著提高(P<0.05)。
4　讨论
在中国 ,桑入药可上溯到 《神农本草经 》,以后
历代本草均有记载。近年来研究表明 ,桑及其提取
物具有抗氧化 、保肝 、抗癌 、抗糖尿病等生物活性作
用〔2-5〕。
癌症或肿瘤是导致现代人群死亡的主要原因之
一。本研究发现 ,用不同质量浓度的 2, 5′-二羟基 -
4, 3′-二 (β-D-吡喃糖氧基)-反式二苯乙烯(DGTS)
作用于 HepG2细胞后 ,对细胞生长增殖有明显的抑
·1727·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 11期 2009年 11月
制作用 ,并且随着质量浓度的增大 ,这种抑制作用更
加明显 ,呈一定的剂量依赖关系(图 1)。为进一步
证实上述结论的可靠性 ,用 DNA梯度凝胶电泳法观
察 DGTS对 HepG2细胞凋亡的影响 ,发现 DGTS干
预组的细胞基因组 DNA电泳表现为特征性的梯形
条带 ,说明 DGTS参与了 HepG2细胞凋亡过程 。采
用 AnnexinV-FITC/PI双染法用流式细胞仪检测
HepG2细胞经 DGTS作用 24、48、72 h的细胞凋亡
情况。结果显示 , HepG2细胞的凋亡率随时间的延
长而提高。本实验结果提示 DGTS对 HepG2细胞
有明显的抑制增殖作用和诱导凋亡作用。有研究报
道预先用桑根水提取物孵育 K-562、B380人白血病
细胞和 B-16小鼠黑素瘤细胞 ,显示细胞毒活性 〔6〕。
桑花色素对 A-549人肺癌细胞有抑制作用 , 桑叶
80%甲醇提取物对 HL-60细胞有抑制作用 〔7〕。
桑中含有生物碱 、黄酮 、多糖蛋白等化学成分 ,
具有抗肿瘤 〔6, 7〕 、抗炎 〔8〕、抗动脉粥样硬化 〔9〕等生物
活性。 DGTS是笔者从桑根中提取出来的一种反式
二苯乙烯〔2〕。体外实验证明 , DGTS对 DPPH·自由
基和超氧化阴离子显示出明显的清除活性 ,并具有
抑制过氧化脂质的作用。本研究结果显示 ,从桑根
中提取分离的 DGTS对 HepG2细胞有明显的抑制
增殖与诱导凋亡作用 。活性氧是分裂信号 ,癌细胞
能持续不断地自发释放超氧化阴离子和过氧化氢 ,
不需外来刺激 ,这是癌细胞的特征 。Meada等 〔10〕发
现 66种蔬菜汁清除自由基能力与抗癌效果间呈正
相关。 DGTS对人肝癌细胞 HepG2的抑制增殖与凋
亡作用是否与 DGTS清除自由基能力相关 ,有待进
一步研究。
参 考 文 献
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·1728· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 32卷第 11期 2009年 11月