全 文 ：胆木(Nauclea officinalis)， 别名又叫乌檀、 黄
杨木等， 属茜草科(Rubiaceae)乌檀属植物， 是一
种被国家林业部门确认为重点保护的稀珍野生植物
树种之一[1-3]。 在海南岛主要分布于保亭、 琼中等
市县的山区。 该树种适生于热带半落叶季雨林中，
种群数量少。 胆木原为民间药， 始载于 《常用中草
药手册》 和 《全国中草药汇编》 等书籍， 后 《中国
药典》 也收载。 胆木其性味苦、 寒， 其全株含有黄
酮苷、 酚类等化学物质， 具有清热泻火之功效。 目
前以胆木为原料已经生产出相关一系列药物， 国内
目前临床应用比较广泛的有胆木针、 胆木浸膏片等
中成药。 临床用于治疗外感发热、 急性扁桃体炎、
咽喉炎、 支气管炎、 肺炎、 肠炎、 痢疾、 急性黄疸、
胃痛等， 具有非常广泛的药用开发价值[4-6]。 国内
外广大学者广泛深入研究胆木的药用价值， 主要集
中于生物碱、 三萜类、 黄酮类、 酚类、 甾醇类等化
合物的研究和提取， 先后从皮、 枝干、 花、 果实中
分离得到了50余种生物碱[7-12]。 胆木植物碳水化合
物营养也齐全， 17种氨基酸中只有胱氨酸未检出，
人体必需的氨基酸含量为 4.72%， 占氨基酸总量的
胆木愈伤组织与悬浮细胞培养研究①
王和飞 1)② 梁 柳 1) 张 燕 1) 刘进平 2)③
(1 琼州学院生物科学与技术学院 海南五指山 572200；
2 海南大学农学院 海南儋州 571737)
摘 要 通过组织培养技术， 利用胆木(Nauclea officinalis)种子无菌实生苗的茎段、 叶片、 叶柄等进行愈伤组
织的诱导及悬浮细胞的培养。 结果如下： (1)以 WPM为基本培养基， 获得愈伤组织高诱导率的激素种类及浓度
为①0.5mg/L2,4-D、 ②0.5～1.5mg/LIBA＋(0.0， 0.5mg/L)6-BA， 诱导率达到 100%； (2)在外植体的差异
上 ， 茎段和叶片出现愈伤组织的时间较早 、 增殖系数最大 ， 可达 15倍 ； (3)在培养基 1/2WPM＋0.5 mg/L
2,4-D＋30g/L蔗糖中， 继代周期为 14～17d， 胆木细胞悬浮培养增殖率可达 30.16%。
关键词 胆木 ； 愈伤组织 ； 悬浮培养 ； 增殖系数
分类号 Q946
Callus Induction and Cell Suspension Culture of Nauclea officinalis
WANG Hefei1) LIANG Liu1) ZHANG Yan1) LIU Jinping2)
(1 College of Bioscience and Technology, Qiongzhou University, Wuzhishan, Hainan 572200;
2 College of Agriculture, Hainan University, Danzhou, Hainan 571737)
Abstract Callus induction and suspension culture of Nauclea officinalis were conducted using stem
segments, leaves, petioles, etc. of in vitro seedlings as explants. The results showed that the best
combinations of plant growth regulators for callus induction on WPM were ①0.5 mg/L 2, 4-D, and ②
0.5-1.5 mg/L IBA+(0.0, 0.5 mg/L) 6-BA, with frequencies of callus induction being 100%. The better
explants were stem segments and leaves since calli appeared earlier on them and their multiplication
coefficients were up to 15. The proliferation rate of cell suspension culture of Nauclea officinalis on
1/2WPM+0.5 mg/L 2,4-D+30 g/L sugar was up to 30.16 for a subculture period of about 14-17 days.
Keywords Nauclea officinalis ; callus ； suspension culture ； multiplication coefficient
① 基金项目： 海南省教育厅高校科研资助项目 “胆木微繁体系建立的研究” (No.Hjkj2010-44)。
收稿日期： 2011-04-25； 责任编辑/黄 艳； 编辑部E-mail： rdnk@163.com。
② 王和飞(1977～)， 男， 海南澄迈人， 讲师， 主要从事作物遗传育种研究。
③ 通讯作者： 刘进平(1970～)， 男， 山西沁县人， 博士， 副教授， 研究方向为作物遗传育种。
Vol．31, No．6
2011年6月 热 带 农 业 科 学
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL AGRICULTURE
第31卷第6期
June． 2011
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2011年6月 第31卷第6期热带农业科学
表 1 不同激素组合对胆木愈伤组织诱导培养的影响
处理
激素组合/（mg·L-1) 盐分
倍数
活性
炭
愈伤组织
2,4-D IBA 6-BA 出现时间/d 诱导率% 增殖系数 质地、 长势
1 0.5 1无 6.6 100 5.5颜色灰白， 疏松， 较小
2 0.5 1/2无 4.6 100 12
整个外植体膨裂， 由绿转白色， 疏
松状、 增殖速度快
3 0.5 1/4无 7.6 100 6颜色灰白， 疏松， 较小
4 0.5 1无 9.4 100 5
从顶端切口膨大， 致密， 颜色较
深， 增殖速度一般
5 0.5 1/2无 8.6 100 7.6
从顶端切口膨大， 致密， 颜色较
深， 增殖速度较快
6 0.5 1/4无 10.3 100 5.2
从顶端切口膨大， 致密， 颜色较
深， 增殖速度一般
7 1 无 10 100 5颜色灰白， 疏松， 较小
43.92%[13]。
由于胆木为大型乔木， 生长速度慢， 而作为一
种具有很好药用价值的植物， 随着企业对药材原料
需求量的增大， 野生的胆木木材必定受到了严重的
破坏， 使原本有限的胆木资源会更加急剧减少， 因
此， 保护和发展胆木树种已经迫在眉睫。 为了有效
地保护和利用这种珍贵的生物资源， 有必要进行愈
伤组织的诱导和悬浮细胞的培养， 从细胞培养物中
提取药用活性物质来作为药物生产来源。 这样可以
在面临野生资源枯竭， 人工种植无法满足市场对胆
木药源需求的情况下， 利用胆木悬浮细胞培养技术
来工业化生产药用次生代谢产物。 本实验对胆木愈
伤组织诱导和悬浮细胞培养进行研究， 为下一步生
产药用活性物质打下技术基础。
1 材料和方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
利用胆木种子无菌实生苗的各部分作为外植体。
1. 1. 2 培养基
1. 1. 2. 1 愈伤组织诱导培养基
以WPM为基本培养基， 添加6g/L琼脂＋30g/L
蔗糖， 分别附加不同种类的生长调节物质 2,4-D、
IBA、 6-BA， 浓度均设置为 0.0、 0.1、 0.5、 1.0、
1.5、 2.0、 2.5mg/L等 7个浓度梯度， 大量盐分含
量设定为 1、 1/2、 1/4等 3个倍数梯度 ， pH为
5.8～6.0。
在相应的培养基中多添加3g/LAC作为对比实验。
1. 1. 2. 2 悬浮细胞培养基
1/2WPM＋0.5mg/L2,4-D＋30g/L蔗糖。 pH为
5.8～6.0。
1. 2 方法
接种 ①在超净工作台上将无菌实生苗的茎段、
主根系切成1.5cm左右小段， 叶片则切成1.5cm×
1.0cm的小块接到相应愈伤组织诱导培养基上； ②
在超净工作台上从形成愈伤组织的培养瓶中， 挑取
质地松弛、 生长旺盛的、 容易碎裂的浅色愈伤组织
放到盛有50mL液体培养基的小三角瓶中， 用镊子
轻轻捏碎愈伤组织。
测定细胞鲜重量来分析细胞悬浮培养的效果，
具体操作方法为： 将材料放在已知重量的尼龙丝网
上过滤， 并用水洗去培养基， 抽滤以除去细胞上沾
着的水滴， 再直接在电子天平上称重。
培养 对愈伤组织诱导： 接种后进行 0～10d
不等的暗培养， 再在温度(25±2)℃、 光照 12h/d、
光照强度为40～60μmol·m-2·s-1的条件下培养。 每
次接种30瓶， 重复 3次。 细胞悬浮培养： 每瓶接
入约2g重的愈伤组织， 置于使用速度为 100～120
r/min的振荡床上暗或弱光振荡培养。 每次接种20
瓶， 重复3次。
2 结果与分析
2. 1 培养基成分对胆木愈伤组织诱导的影响
无菌实生苗各部位接种后第4天开始观察， 连
续观察一个月， 6周后取出各愈伤组织进行鲜重称
量。 试验得到相关数据统计如表1。
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王和飞 等 胆木愈伤组织与悬浮细胞培养研究
说明： “盐分倍数” 一栏中留空表示愈伤组织在1～1/4倍生长情况基本一样； “活性炭” 一栏中留空表示是否有加活性炭对愈
伤组织影响不大。
续表 1 不同激素组合对胆木愈伤组织诱导培养的影响
处理
激素组合/（mg·L-1) 盐分
倍数
活性
炭
愈伤组织
2,4-D IBA 6-BA 出现时间/d 诱导率% 增殖系数 质地、 长势
8 1 0.5 无 10.6 100 7.5顶端愈伤组织增殖明显
9 1.5 无 10.3 100 6在顶端切口处， 淡黄色、 致密、 小
10 ＜0.5 0-2.5 ＞9 ＜40 <2.6颜色较深， 致密， 小， 生长速度慢
11 ＞1.5 0-2.5 ＞9 ＜38 ＜2.3颜色较深， 致密， 小， 生长速度慢
12 ＜0.5 0-2.5 ＞9 ＜27 ＜2.0颜色较深， 致密， 小， 生长速度慢
13 ＞1.5 0-2.5 ＞9 ＜31 ＜2.2颜色较深， 致密， 小， 生长速度慢
根据表1中数据， 以诱导率≥50%， 增值系数≥
5.0的培养基影响效果作图 1分析。 在时间出现的
先后上： ①1/2WPM＋0.5mg/L2,4-D出现最快， 大
概只用 4.6d左右， 而且所形成的愈伤组织为整个
外植体都发生， 外植体由绿转黄， 愈伤组织颜色浅黄
质地较松软， 增殖速度最大， 增殖系数高达12， 诱
导率高达 100%。 ②0.5～1.5mg/LIBA， ③0.5mg/L
2,4-D， ④1.0 mg/L IBA＋0.5 mg/L 6-BA在 1倍～
1/4倍大量盐分含量的培养基中也都能很好的诱导
愈伤组织的发生， 诱导率也可达到100%， 但诱导系
数相对较低， 只有5～7.5， 较①1/2WPM＋0.5mg/L
2,4-D而言还是稍劣。 即本实验过程中等偏低浓度
的生长素(2,4-D、 IBA)能很好的诱导愈伤组织的形
成， 而生长素＜0.5 mg/L或＞1.5 mg/L单独或与
6-BA组合， 诱导率和增值系数都很小。
在WPM大量盐分含量上， 通过观察， 3种盐分
含量的基本培养基类型对增值系数影响效果强弱为
1/2WPM＞1WPM≈ /4WPM， 即适当降低大量盐分含
量能很好促进愈伤组织的出现、 增殖。
2. 2 不同外植体类型对胆木愈伤组织诱导的影响
本实验无论是叶片、 茎段还是根系， 在上述培
养基都可以很好的诱导出愈伤组织， 不过由于组织
部位不同， 其生理活性不同， 在愈伤组织出现的时
间、 部位和质地上也是各有区别的。 茎段和叶柄出
现时间比较早， 一般暗培养 4～5d的时候就很明
显的在切段端渐膨大： 茎段在培养基上面的切口出
现膨大， 产生浅黄绿色的愈伤组织， 15d后愈伤组
织增大8～15倍， 增殖速度较快， 质地较松软， 不
好切割成型； 叶柄是整个外植体开裂出现愈伤组
织， 质地相对较干硬的， 15d后增大率较小。 叶片
大概是在 15d的时候在叶脉处出现膨大， 启动时
间较茎段和叶柄晚， 20d的时候在叶片背面有明显
的愈伤组织。 叶片愈伤组织虽然诱导出现时间较
晚， 但在较短时间内出现的生物量较大， 增殖速度
最快， 几乎几天内整个叶脉上都布满愈伤组织， 而
且诱导部位最好的是靠近叶柄端的叶片， 颜色较
浅， 愈伤组织质地松散、 颜色淡黄。 根部出现愈伤
组织时间最晚， 颜色泛黄褐色， 在根系上成念珠
状， 增殖频率最小， 继续培养几乎没有什么实质性
的变化。
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2011年6月 第31卷第6期热带农业科学
3 结论与讨论
利用 1/2WPM添加单独生长素(0.5mg/L2,4-D或
0.5～1.0mg/LIBA)， 或同时附加生长素和较低浓度的
细胞分裂素(1.0mg/LIBA＋0.5mg/L6-BA)上均可获得较
好的胆木愈伤组织的诱导。 这和海南益智、 龙血树
0.000
5.000
10.000
15.000
20.000
25.000
30.000
35.000
5
增殖率/%平均重/d
8 11 14 17 20 23
取样时间/d
图 2 愈伤组织悬浮培养增殖效
围(①0.5mg/L2,4-D、 ②0.5～1.5mg/LIBA)的培养基中加
入AC的效应是抑制愈伤组织的形成， 而在其他相
应激素和浓度中没有明显抑制作用。
2. 5 胆木悬浮细胞培养
从开始培养第5天开始观察记录， 每隔 3d随
机取5瓶对细胞鲜重进行称量， 得到数据见表3。
从表3中数据和分析图2的曲线走向， 细胞生
长曲线呈现 “Ｓ” 型， 但其滞后期较长， 至少5～
8d， 即在 8d前， 细胞质量增重缓慢,这可能是由
于细胞对环境的适应需要一个过程,不能很好的吸
收营养物质； 而8～14d这段时间， 曲线表现直线
向上升高， 说明此时细胞处于分裂的高峰期即增生
期， 这是细胞增值最旺盛的阶段， 细胞分裂相增
多。 从 14～17d这段时间， 细胞重量保持在较高
水平， 细胞进入生长平稳期， 生物量不再增加； 当
超过 17d后， 细胞重量出现逐渐减少， 这是由于
培养基中养分耗尽或者是有害物质的积累所造成，
导致细胞分裂停止甚至死亡。
从表 2数据表明， 在愈伤组织诱导中，
在诱导时间早晚和愈伤组织生物量上和暗培
养时间有关： 暗培养4～6d， 愈伤组织出现
的时间较早， 大概 4～5d就可观察到愈伤
组织的出现， 且后续长势较好。 0～4d暗培
养的外植体愈伤组织出现时间较晚， 在第9
天左右出现， 而且长势不如暗培养时间长得
质地好和增殖率高。 实验表明： 暗培养对愈
伤组织出现并非必需， 接种后完全光照培
养， 也能观察到愈伤组织的发生(如表 2处理 1， 光下
培养增殖系数为 4.5)， 但经过黑暗培养可显著提高愈
伤组织产生的生物量， 并且呈现出暗培养时间和愈
伤组织增殖系数呈现钟形曲线(如表2处理 5～7， 增殖
系数高达 10.3～12.1)， 而一般暗培养超过1周后愈伤
组织增殖系数就开始呈下降趋势。
2. 4 活性炭对胆木愈伤组织诱导的影响
在无AC的愈伤组织诱导率 100%的相应培养基
中添加 3g/LAC， 则愈伤组织的诱导率降低很明
显， 达不到 30%； 而在其他无明显诱导率的无 AC
培养基中添加 AC对诱导率没有明显的差异。 即在
本实验胆木愈伤组织诱导中在添加一定激素浓度范
表 3 愈伤组织悬浮培养增殖情况
取样
时间/d
不同培养时间愈伤组织重量
各瓶中愈伤组织重/g 平均重/g增殖率%
5 2.010 2.005 2.004 2.001 2.001 0.06
8 2.047 2.065 2.048 2.061 2.054 2.68
11 2.465 2.256 2.125 2.156 2.297 14.84
14 2.658 2.456 2.398 2.684 2.582 29.08
17 2.562 2.712 2.671 2.615 2.603 30.16
20 2.651 2.412 2.365 2.325 2.485 24.27
23 2.561 2.354 2.298 2.284 2.390 19.48
1.986
2.047
2.482
2.712
2.456
2. 74
2.451
表 2 暗培养时间对愈伤组织诱导的影响
处理
编号
暗培养
时间/d
出现
时间/d
增殖
系数
长势
1 0 10.6 4.5颜色较深， 较干松
2 1 9.0 5.8颜色较深， 较干松
3 2 8.7 4.9颜色较深， 较干松
4 3 8.3 5.7颜色较深， 较干松
5 4 4.7 11.3
由黄转黄白，
质地疏松， 较湿润
6 5 4.3 12.1
由黄转黄白，
质地疏松， 较湿润
7 6 5.0 10.3
由黄转黄白，
质地疏松， 较湿润
8 7 9.0 5.4颜色较深， 较干
9 8 10.3 5.7颜色较深， 较干
2. 3 暗培养对胆木愈伤组织诱导率的影响
以种子无菌实生苗茎段作为接种外植体， 接种
在1/2WPM＋0.5mg/L2,4-D无AC培养基上， 通过改
变暗培养时间， 观察愈伤组织诱导效果。 接种3周
后， 取出愈伤组织进行鲜重称量， 统计数据如表2。
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王和飞 等 胆木愈伤组织与悬浮细胞培养研究
等药用植物的愈伤组织的诱导上有所区别[14-16]。 在培
养条件上， 先进行4～6d暗培养， 比较有利于胆木
愈伤组织的形成和后续生长。 暗培养对愈伤组织的促
进作用在其他植物的愈伤组织诱导一致[17-19]。 3g/L
AC存在的情况下， 茎段主要是促进芽苗和根系的
出现， 愈伤组织诱导率很小， 以及形成的愈伤组织
很小、 硬、 色深， 而没有活性炭主要是诱导愈伤组
织的， 并且发生率可达100%。
本研究显示， 以胆木种子无菌实生苗的茎段、
叶片、 叶柄为外植体， 在 1/2WPM＋0.5mg/L2,4-D
或 1/2WPM＋0.5～1.5mg/LIBA＋(0.0， 0.5mg/L)
6-BA可获得较好的胆木愈伤组织诱， 而胆木细胞
悬浮培养可在 1/2WPM＋0.5mg/L2,4-D＋30g/L蔗
糖中获得较好增殖。 下一步我们将研究不同理化因
子对胆木愈伤组织及悬浮细胞培养药物活性成分积
累的影响， 利用现代细胞培养技术诱发细胞由单纯
的细胞增殖和营养生长向次生代谢产物的生产转
化， 为今后利用植物生物反应器方法工业化生产胆
木药用成分奠定基础。
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