全 文 ：浙江大学学报(农业与生命科学版)　37(3):332～ 337 , 2011
Journal of Zhej iang University(Agric.&L ife Sci.)
文章编号:1008-9209(2011)03-0332-06 DOI:10.3785/j.issn.1008-9209.2011.03.015
　　收稿日期:2010-07-19
基金项目:浙江南湖菱壳抗胃癌活性成分的提取纯化资助项目(2009AY2032).
作者简介:宁颖(1986—),女 ,山东邹平人 ,硕士研究生 , 主要从事功能食品开发方面的研究.E-mai l:ningying0613@163.com.
通信作者:沈生荣 ,男 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事植物有效成分的提取及其生物学活性和天然产物的安全性评价研究.Tel:
0571-86971926;E-mail:shrshen@zju.edu.cn.
均匀设计法优选菱壳中抗胃癌成分的半仿生提取工艺
宁 颖1 , 于海宁2 , 周新妹3 , 王 维4 , 蒋 风4 , 潘晓燕3 , 沈生荣1
(1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院 ,浙江杭州 310058;2.浙江工业大学药学院 ,浙江 杭州 310014;
3.嘉兴学院医学院 ,浙江 嘉兴 314001;4.杭州华东医药集团康润制药有限公司 ,浙江 安吉 313301)
摘　要:以 SGC7901 胃癌细胞存活率为指标 , 运用半仿生提取方法回收菱壳中的抗胃癌活性成分 , 考
察提取时间 、料液比 、胃蛋白酶用量 、胰蛋白酶用量对提取物抗胃癌活性的影响 ,并运用均匀设计法确定
其最佳提取工艺.结果表明:菱壳与 pH≈2 提取液按料液质量体积比 1∶10 ,不加入胃蛋白酶 , 37 ℃提
取 30 min 后 ,离心收集沉淀 ,添加 4%胰蛋白酶 ,菱壳与 pH≈8 提取液按料液质量体积比 1∶10 , 37 ℃
提取 30 min ,可获得最佳抑制效果 , 细胞存活率仅为 45.52%.本实验表明 , 采用半仿生法提取菱壳中的
抗胃癌活性成分是可行的.
关　键　词:菱壳;抗胃癌活性;半仿生提取;均匀设计
中图分类号:TS 201.4　　　文献标志码:A
NING Ying 1 , YU Hai-ning 2 , ZHOU Xin-mei3 , WANG Wei4 , JIANG Feng4 , PAN Xiao-yan3 , S HEN
Sheng-rong1(1 .S chool of Biosystems Engineering and Food Science , Zhej iang University , Hangz hou
310058 , China ;2 .College o f P harmaceutical Science , Zhe jiang University o f Technology ,
Hangz hou 310014 , China;3 .School o f Medicine , J ia xing College , J ia xing , Zhejiang 314001 ,
China;4 .Hangz hou Huadong Medicine Group Kangrun Pharmaceutical Co.Ltd ., An ji , Zhej iang
313301 , China)
Optimal process for semi-bionic extraction of bioactive compounds against gastric cancer fromwater chestnut
shell by uniform designation.Journal o f Zhejiang Unive rsity(Agric.& Life Sci.), 2011 , 37(3):332-337
Abstract:The viability rate of SGC7901 ga st ric cancer cells w as used as an index , the anti-gastric cancer
ingr edients f rom the wa te r chestnut shell we re reclaimed by semi-bionic ex traction.The effects o f
ext raction time , ratio of w ater to wa te r che stnut shell , amount o f pepsin and t rypsin on ex traction anti-
gastric cancer activity wer e investig ated , and the unifo rm designation was employed to de te rmine the
optimum ex traction conditions.The results showed that when 1 g shell pow der was added to 10 mL
so lv ent(1∶10 ratio o f powder to pH≈2 so lv ent)in the absence o f pepsin , ex tracting for 30 min a t 37
℃, and then being centrifuged to co llec t precipitate , adding 10 mL pH ≈8 solvent and 4% trypsin ,
ext racting fo r 30 min at 37 ℃, the ext racts had the highest activity ag ainst g astric cancer and the cell
viability was the lowest , i.e.45.52%.Also , this experiment confirmed that water chestnut shell extracts still
had a high activity of inhibiting the grow th of gastric cancer cells through semi-bionic ex traction.
宁 颖 ,等:均匀设计法优选菱壳中抗胃癌成分的半仿生提取工艺
Key words:w ater chestnut shell;anti-ga str ic cancer activity;semi-bionic ex traction;unifo rm designa tion
　　菱角(Trapa natans)原产于欧洲和亚洲的
温暖地区 ,为一年生蔓性水生草本植物 ,在我国
已有 3 000多年的栽培历史.目前我国菱角的种
植面积约 40 000 hm2 ,年产量约 24万 t.菱角出
壳率在 30%左右 ,据统计每年产出的鲜菱壳可
达 71 000 ～ 72 000 t.但是迄今为止大量菱壳并
没有得到有效利用 ,不仅污染环境 ,也造成极大
浪费.近年来 ,我国有学者[ 1-4] 研究发现菱壳中含
有生物碱 、黄酮类 、多糖类等功能性成分 ,且菱壳
的水提物具有抗癌活性尤其是抗胃癌活性.胃癌
是消化道最常见的恶性肿瘤之一 ,在我国不少地
区的恶性肿瘤死亡统计中 ,胃癌居第 1或第 2
位[ 5] .天然产物治疗癌症的机制多为诱导细胞调
亡 ,因此开发天然的抗癌物质 ,通过细胞凋亡治
疗癌症已成为新目标[ 6] .据《本草纲目》记载 ,菱
能补脾胃 ,民间用菱角治疗溃疡 、胃癌 、食道癌等
疾病有一定的功效.已有实验证实菱壳的提取物
具有促进肝癌细胞凋亡的功能[ 7] .植物源抗癌成
分一般有黄酮类 、生物碱类和多糖类等 ,目前菱
壳源抗胃癌活性成分的提取研究多以这些常规
物质为指标[ 8-12] .半仿生提取是以提取物的生物
活性为导向模拟口服给药及药物经胃肠道转运 ,
为经消化道给药的中药制剂设计的一种新型的 、
更有效的提取方法[ 13] .半仿生提取的方法已经
用于桂枝甘草汤 、杜仲降压药等的提取[ 14-15] .菱
角类应用半仿生法提取以及用细胞模型作为活
性指标的研究尚未见报道.本文以对胃癌细胞的
存活率为活性导向 ,考察了菱壳抗胃癌活性成分
半仿生提取的各因素 ,并采用实验次数少 、简便
准确的均匀设计法 ,优化半仿生提取工艺.
1　材料与方法
1.1　材料 、试剂与仪器
　　南湖菱角壳(嘉兴南湖);SGC7901胃癌细
胞(中国科学院上海生命科学研究院生物化学
与细胞生物学研究所).
　　RPM I 1640 培养基(GBICO 生物技术公
司);标准新生牛血清(杭州四季青生物试剂公
司);四甲基偶氮噻唑蓝(MTT ,上海生物工程有
限公司);二甲基亚砜(DMSO ,上海生物工程有
限公司);胃蛋白酶(活力 3 000 ～ 3 500 NF U
mg
-1 ,北京宝顺科技公司);胰蛋白酶(活力≥
250 NF U mg-1 ,北京宝顺科技公司);其他试剂
均为国产分析纯.
　　CO2 培养箱(Shellba ,美国);真空冷冻干燥
机 (CHRIST RZ6 , 德 国 );酶 标 仪
(MD29Spect raMax 190 , 芬兰);高速离心机
(Biofuge f rescoD-37520 Osterode ,德国).
1.2　方　法
1.2.1　原材料预处理 　南湖菱菱壳经干燥 、粉
碎至 50 ～ 200目 ,干粉于低温 、低湿度 、避光保存.
1.2.2　半仿生法提取菱壳中抗胃癌活性成分
及其细胞活性筛选
1.2.2.1　提取.干燥的南湖菱菱壳粉用胃蛋白
酶在 pH ≈2的条件下经 37 ℃水浴提取 ,过滤
去上清 ,滤渣用胰蛋白酶在 pH≈8的条件下经
37 ℃水浴提取 ,过滤取上清 ,13 000 r min-1离
心 30 min ,去除杂质 ,真空冷冻干燥.
1.2.2.2　细胞活性筛选.冻干提取物用高纯水
回溶 ,溶液用经辐照灭菌的孔径为 0.22 μm 的
无菌滤头过滤除菌;24 h 胃癌细胞的 MT T 实
验中用无菌样品溶液处理细胞 ,比较不同处理
下胃癌细胞的存活率.
1.2.3　半仿生提取抗胃癌活性成分的单因素
实验　　以菱壳提取成分对 SGC7901细胞的
抑制活性为指标 ,其他条件保持不变 ,分别考察
不同提取时间(30 ～ 360 min)、料液质量体积比
(1∶10 ～ 1∶50)、胃蛋白酶用量(原料质量分数
1%～ 5%)、胰蛋白酶用量(原料质量分数2%～
10%)对胃癌细胞生长的影响.
1.2.4　均匀设计实验方案　　以提取时间 、料
液质量体积比 、胃蛋白酶用量 、胰蛋白酶用量为
考察因素 ,提取物对胃癌细胞的抑制活性为指
标 ,进行均匀实验设计(表1),筛选菱壳中抗胃癌
活性成分的半仿生提取最佳工艺.选用U10(1010)
表进行各因素水平实验 ,按照U10(1010)设计表
(表2)分别将 A(胃蛋白酶用量)、B(胃蛋白酶提
取时间)、C(胰蛋白酶用量)、D(胰蛋白酶提取时
间)、E(料液比)5因素安排在 1 、2 、3、5 、7列[ 16] .
333　第 3期
浙江大学学报(农业与生命科学版)
表 1　因素水平表
Table 1　Factors and levels table
因素 水　　平
1 2 3 4 5
A胃蛋白酶用量(原料质量分数/%) 0 0.5 1 2 3
B 胃蛋白酶提取时间/min 30 50 60 70 90
C胰蛋白酶用量(原料质量分数/%) 4 5 6 7 8
D 胰蛋白酶提取时间/min 30 50 60 70 90
E 料液比(质量体积比) 1∶10 1∶20 1∶30 1∶40 1∶50
表 2　U10(1010)均匀设计水平表
Table 2　Uniform designation of U 10(1010)
试验号 列　　号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
2 2 4 6 8 10 1 3 5 7 9
3 3 6 9 1 4 7 10 2 5 8
4 4 8 1 5 9 2 6 10 3 7
5 5 10 4 9 3 8 2 7 1 6
6 6 1 7 2 8 3 9 4 10 5
7 7 3 10 6 2 9 5 1 8 4
8 8 5 2 10 7 4 1 9 6 3
9 9 7 5 3 1 10 8 6 4 2
10 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
1.2.5　MT T 实验 　　取对数生长期细胞接
种于 96孔板 ,每孔 190 μL ,细胞密度约为 1×
105孔-1 ,每孔设只加培养液不加细胞的平行对
照 ,培养 15 h 后 ,每孔加入不同提取条件下的
样品 10 μL ,并根据考察因素分别设置阴性对
照(提取时间及料液比为菱壳空白对照 ,胃蛋白
酶及胰蛋白酶用量为酶空白对照 ,均匀设计为
培养液对照),每种处理设 6个重复.加样后继
续培养 24 h ,去掉孔内液体后每孔加入 20 μL
MT T ,放入 CO2 培养箱继续培养 3 h.取出 96
孔板 ,每孔加入 150 μL DMSO ,迅速用水平振
荡器摇动 ,使孔内紫色结晶物充分溶解 ,但时间
不得超过 30 min ,然后用酶标仪读取 492 nm
的吸光度值.每孔的吸光度值减去并列平行孔
的吸光度值 ,得到绝对吸光度值 ,将阴性对照组
细胞的存活率设为 100%,各样品处理的绝对
吸光度值与阴性对照绝对吸光度值之比为各样
品处理后的胃癌细胞存活率[ 17-18] .
2　结果与分析
2.1　不同提取时间对提取物抑癌活性的影响
　　保持提取温度 37 ℃, 胃蛋白酶用量为
1%,胰蛋白酶用量为 1%,料液比 1∶6 ,研究不
同提取时间对提取物胃癌细胞抑制活性的影
响.在 30 ～ 360 min的不同提取时间(胃蛋白酶
提取时间∶胰蛋白酶提取时间=1∶1)下 ,所得
提取物均抑制胃癌细胞生长 , 存活率范围为
49.50%～ 62.02%(图 1).与对照相比 ,差异均
具有统计学意义(P <0.05).提取时间为 60
min 时 , 提取物抑制活性最强 , 存活率仅为
(49.50±4.05)%.提取时间为 120 min时 ,提
取物的抑制活性变弱 ,推测菱壳中糖类等成分
溶出积累 ,促进了细胞生长[ 19] .240 min提取时
也有较好的细胞抑制作用 ,但基于工业化大生
产效率 ,取 60 m in为优.
图 1　不同提取时间对提取物抑癌活性的影响
Fig.1　Ef fect s of dif feren t ext raction t ime on ant icancer
activi ty of ext racts
334 第 3 7卷　
宁 颖 ,等:均匀设计法优选菱壳中抗胃癌成分的半仿生提取工艺
2.2　不同料液比对提取物抑癌活性的影响
　　保持提取温度 37 ℃,提取时间为 60 min ,
胃蛋白酶用量为 1%,胰蛋白酶用量为 1%,研
究料液比对提取物胃癌细胞抑制活性的影响.
不同料液比条件下提取物均抑制胃癌细胞生
长 ,细胞存活率范围为 45.89%～ 54.76%(图
2).与对照相比 ,差异均具有统计学意义(P <
0.05).当料液比为 1∶20 ,1∶30时 ,提取物对
胃癌细胞抑制活性较高.料液比为 1∶20的抑
制活性最强 ,存活率仅为(45.89±9.44)%.
图 2　不同料液比对提取物活性的影响
Fig.2　Effect s of di ff erent ratios of powder to solvent on
th e an tican cer activi ty of ext ract s
图 3　胃蛋白酶不同用量对提取物活性的影响
Fig.3 　 Effect s of diff erent amoun t of pepsin on the
ant icancer activi ty of ex t racts
2.3　胃蛋白酶不同用量对提取物抑癌活性的
影响
　　保持提取温度 37 ℃,提取时间为 60 min ,
料液比 1∶20 ,胰蛋白酶用量为 1%不变 ,研究
胃蛋白酶不同用量对提取物胃癌细胞抑制活性
的影响.在胃蛋白酶不同用量条件下提取物均
抑制胃癌细胞生长 , 细胞存活率范围为
47.33%～ 81.52%.与对照相比 ,差异均具有统
计学意义(P <0.05)(图 3).胃蛋白酶用量为
1%时抑制活性强 , 存活率仅为(47.33 ±
3.82)%.胃蛋白酶用量为 5%时 ,存活率较高 ,
推测提取物中溶出生物碱等物质改变了体系的
酸碱度 ,使胃蛋白酶失活 ,促进了细胞生长 ,降
低了提取物的细胞抑制活性[ 20] .
2.4　胰蛋白酶不同用量对提取物抑癌活性的
影响
　　保持提取温度 37 ℃,提取时间为1 h ,料液
比 1∶20 ,胃蛋白酶用量为 1%,研究胰蛋白酶
不同用量对提取物胃癌细胞抑制活性的影响.
在胰蛋白酶不同用量条件下提取物均抑制胃癌
细胞生长 ,存活率范围为 55.78%～ 72.82%.
与对照相比 , 差异均具有统计学意义(P <
0.05)(图 4).胰蛋白酶用量为 8%的处理抑制
活性强 ,细胞存活率仅为(55.78±5.44)%.胰
蛋白酶用量增加或降低时 ,提取物的抑制活性
均变弱.所以胰蛋白酶用量为 8%为最佳水平.
图 4　胰蛋白酶不同用量对提取物活性的影响
Fig.4 　 Effect s of dif ferent amoun t of t rypsin on the
ant icancer activi ty of ex t racts
2.5　半仿生提取菱壳抗胃癌活性成分的均匀
实验设计结果
　　综合分析单因素实验结果 ,分别选择胃蛋
白酶用量 、胃蛋白酶作用时间 、料液比 、胰蛋白
酶用量 、胰蛋白酶作用时间 5个因素 ,每因素均
取 5个水平进行均匀实验设计 ,均匀实验设计
结果见表 3 ,利用 SAS 软件回归分析法处理数
据 ,得到回归系数和回归方程(表 4).由表 4数
335　第 3期
浙江大学学报(农业与生命科学版)
据可获得回归方程:y∧ =0.286 83+0.003 76B+
5.112 23C +0.002 62D -2.275 04E , P =
0.027 7<0.05 ,回归方程显著.由此可知 ,胃癌
细胞存活率与 A 因素无显著关系;其随因素
B 、C和D 的减小而减小 ,且与因素 C呈极大正
相关;随因素 E 的减小而增大.当 A=0;B =
30;C=4%;D =30;E=1∶10 时 , y∧ =45.52%,
为最小值 ,此时胃癌细胞存活率最低 ,故最优条
件为胃蛋白酶用量(原料质量分数)为 0%,胃
蛋白酶提取时间为 30 min ,胰蛋白酶用量(原
料质量分数)为 4%,胰蛋白酶提取时间为 30
min ,料液质量体积比为 1∶10.
表 3　均匀设计方案及结果
Table 3　Uni form designation and resu lt s
试验号
列号与因素
1胃蛋白酶用量
(原料质量分数/%)
A
2胃蛋白酶提取
时间/min
B
3胰蛋白酶用量
(原料质量分数/%)
C
5胰蛋白酶提取
时间/min
D
7料液比
(质量体积比)
E
胃癌细胞
存活率/%
1 1(0) 2(50) 3(6) 5(90) 7(1∶20) 99.72
2 2(0.5) 4(70) 6(4) 10(90) 3(1∶30) 89.95
3 3(1) 6(30) 9(7) 4(70) 10(1∶50) 85.20
4 4(2) 8(60) 1(4) 9(70) 6(1∶10) 64.52
5 5(3) 10(90) 4(7) 3(60) 2(1∶20) 103.56
6 6(0) 1(30) 7(5) 8(60) 9(1∶40) 72.63
7 7(0.5) 3(60) 10(9) 2(50) 5(1∶50) 97.92
8 8(1) 5(90) 2(5) 7(50) 1(1∶10) 76.54
9 9(2) 7(50) 5(9) 1(30) 8(1∶30) 99.00
10 10(3) 9(70) 8(6) 6(30) 4(1∶40) 91.40
表 4　均匀设计回归分析结果
Table 4　Reg res sion analysis resul t of uniform designation
变量 常数 B C D E
回归系数 0.286 83 0.003 76 5.112 23 0.002 62 -2.275 04
3　讨　论
　　均匀设计实验次数少 ,操作方便且结果具
有均匀分散 、整齐可比的优点.实验用均匀设计
法优选半仿生提取工艺 ,结果表明用提取物处
理的细胞存活率仅为 45.52%,可见经均匀设
计优化提取工艺后 ,提取物表现出更强的活性.
提取工艺简单 ,易于控制 ,适合于工业化生产 ,
对于菱壳中抗胃癌活性成分的开发具有指导
意义.
　　目前 ,对菱壳中活性成分的研究多集中于
黄酮类 、多糖类等单一化合物 ,例如菱壳黄酮提
取及活性 ,菱壳没食子酸或粗多糖的抗肿瘤活
性研究等.中药的配伍思维是混合组分活性优
于单一组分 ,仅针对单一成分的研究是不足的.
将某一活性成分含量作为指标提取植物化合
物 ,化合物的活性并不一定得到最有效发挥.半
仿生提取是以提取物的生物活性为导向模拟口
服给药及药物经胃肠道转运 ,为经消化道给药
的中药制剂设计的一种新型的 、更有效的提取
方法.将半仿生提取法用于菱壳中抗胃癌活性
成分的提取 ,并且将直观的体外细胞活性筛选
模型作为活性导向 ,使提取工艺达到最佳.
　　传统半仿生提取采用选定 pH 的酸性水和
碱性水依次连续提取 ,将提取温度设为可变因
素 ,但人体消化系统是恒温体系 ,且含有消化酶
等辅助消化的酶类.实验采用的工艺经过改善传
统半仿生理念使提取体系更接近人体消化系统 ,
设定 37 ℃的恒温条件以及模拟胃肠主要消化器
官 ,分别在 pH ≈2条件下加入胃蛋白酶 , pH ≈8
条件下加入胰蛋白酶进行仿生提取.实验证实菱
336 第 3 7卷　
宁 颖 ,等:均匀设计法优选菱壳中抗胃癌成分的半仿生提取工艺
壳提取物经半仿生提取后保留着较高的抗胃癌
细胞生长活性 ,这对于菱壳半仿生提取物抑癌机
制的研究和相关产品开发等具有重要意义.
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