全 文 ：　 2009年 2月第 28卷　第 2期
绵阳师范学院学报
JournalofMianyangNormalUniversity
Feb., 2009
Vol.28　No.2　
收稿日期:2008-12-10
基金项目:四川省教育厅项目(2003A175),绵阳市科技攻关项目(2005BN002-3)
作者简介:周梦春 (1983-　),男 ,硕士研究生,主要研究方向:植物生态与组织培养。
＊通讯作者:苏智先 (1956 -),男 ,教授 ,博士生导师 zxsu@mnu.edu.cn
三种柚叶悬浮培养愈伤组织黄酮类
有效成分的比较研究
周梦春 1, 2 ,苏智先 2, ＊ ,胡进耀 2 ,齐刚 1, 2 ,曾艳1, 2 ,刘美 1
(1.西华师范大学环境科学与生物多样性保护省级重点试验室 ,四川南充　637002;2.绵阳师范学院 ,四川绵阳　621000)
摘　要:用 MS+ 2, 4-D1.0mg/L+6%蔗糖培养基诱导三种柚叶片愈伤组织 , 悬浮培养法扩大培养 ,进行
有效成分分析。结果表明沙田柚含有较高黄酮物质 、柚皮苷和野漆树苷 , 琯溪蜜柚次之 , 江津柚含量最低 , 约为沙
田柚的 50-60%。柚苷元在三个品种愈伤组织中含量相似 。该结果为柚类进一步遗传转化和改良提供了基础数
据。
关键词:柚子;愈伤组织;柚皮苷;黄酮
中图分类号:Q943　　文献标识码:A　　文章编号:1672-612x(2009)02-0051-05
柚(CitrusgrandisL.),为芸香科柚属的一个重要的经济果树 ,柚原产中国 ,具营养 、保健 、医疗 、加工和
绿化等综合利用价值.目前我国柚类栽培面积和产量均居世界第一位 ,面积已达 19.93万 hm2 ,占我国柑桔
总面积的 11.9%,产量 128万 t,占全国柑桔总产量的 11.7%[ 1] 。
琯溪蜜柚原产福建平和县 。是栽培柚类的名品 。琯溪蜜柚果大无核质优 ,适应性强 ,高产 ,商品性佳 ,
可谓柚中之冠 ,但在发展中要特别注意防止溃疡病的传播 ,同时该品种有内裂的缺点 [ 2] 。沙田柚 ,数广西
容县沙田所产最为出名。沙田柚是广西最名牌的水果之一 ,沙田柚现已扩种至广西浔江 、龙江 、桂江 、漓江
和红水河流域等地 ,广东 、湖南 、四川 、浙江 、江西亦先后引种 [ 3] 。江津柚是四川本地柚子品种 ,适应四川的
气候和土壤 ,但品质低于琯溪蜜柚和沙田柚。
由于柚是多年生木本果树 ,传统的育种手段在改良柚品质 、培育新种质上显得效率低且不易操作。生
物技术的应用为快速改良沙田柚提供了一个新的手段 。一个高效离体再生体系的建立对于柚的遗传转化
非常重要[ 4] 。本文结合以前的研究结果 ,用三种柚子叶片诱导愈伤组织 ,再进行悬浮扩大培养 ,分析了其
中黄酮类物质 、柚皮苷 、野漆树苷 、柚苷元等物质的含量 。为柚子遗传转化和品质鉴定 、改良提供了理论依
据和数据积累。
1　材料和方法
1.1　实验材料
琯溪蜜柚 ,沙田柚和江津柚幼嫩茎段均采自成都市郊的柚子种植园 ,经询问和专家鉴定。
1.2　实验方法
1.2.1　愈伤组织诱导　将幼嫩叶片剪下 ,在 75%乙醇中浸 30 s,然后用 0.1% HgCl2消毒 25 min,无菌水冲
洗三次 ,剪成约 1cm×1cm方片 ,接种于培养基上 。培养基按黄涛等 [ 3]的方案 ,蔗糖浓度为 6%,琼脂为 0.
7%,添加 2, 4-D1.0mg/L, 0.1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP40), pH5.8。培养室恒温 25℃,培养光照为 100
μmol· m-2· s-1 ,光照时间为 12 h/d。
1.2.2　愈伤组织悬浮培养　30天后将叶沿长出的愈伤组织粉碎接种于含 2, 4-D1.0 mg/L, 3%蔗糖的液
体 MS培养基中 ,悬浮震荡培养 30天 。摇床频率为 1周每秒 ,恒温 25℃,培养光照为 100 μmol· m-2·s-1 ,
DOI :10.16276/j.cnki.cn51-1670/g.2009.02.011
光照时间为 12h/d。
1.2.3　总黄酮含量测定 [ 5] 　由于柚叶总黄酮成分种类与其果皮有异 ,野漆树苷含量较高 ,不宜沿用果皮
总黄酮测定方法 ,经光谱扫描 ,样品溶液和野漆树苷对照品溶液光谱图相似 ,在 304nm处均有吸收峰 ,故确
定 304nm为测定波长。
(1)对照品溶液的制备:精密称取经 110℃干燥至恒重的野漆树苷对照品 21.1mg,置 100 ml量瓶中 ,
加甲醇溶解并加至刻度 ,摇匀 ,即得。
(2)样品溶液的制备:取愈伤组织约 1 g,精密称定 ,置索氏提取器中 ,加石油醚(60℃ -90℃)100 ml,
水浴回流提取 2.5h,弃去石油醚提取液并挥尽样品残存的石油醚 ,加甲醇 100ml再置水浴锅中回流提取 4
h,放冷 ,滤过 ,滤液转移至 100ml量瓶中 ,甲醇定容至刻度 ,制得样品溶液 。
(3)标准曲线的绘制:分别精密量取对照品溶液 0.5、1、1.5、2、2.5、3 ml至 25 ml量瓶中 ,然后分别加
入 100g/L硝酸铝溶液 1ml,加甲醇至刻度 ,摇匀 ,放置 15min;另取 100g/L硝酸铝溶液 1ml置 25ml量瓶
中 ,加甲醇至刻度 ,作为空白对照溶液 ,于 304nm处测定吸光度 ,得直线回归方程为:Y=18.972 X+0.
0048。
(4)样品含量测定:将各样品分别按上述方法制备 ,依法测定吸收度 ,代入回归方程 ,计算 ,即得。
1.2.4　柚皮苷含量测定 [ 6] 　
(1)色谱条件:流动相为甲醇∶水∶乙酸(体积比为 35∶61∶4),流速为 1.0 ml/min;柱温为 25℃;色谱柱
为 KromasilODS-1柱(250mm×4.6 mm);检测波长为 283nm。
(2)对照品溶液的制备:精密称取柚皮苷 20 mg,置 100 ml量瓶中 ,加甲醇溶解并加至刻度 ,再精密量
取 30ml置于 50 ml量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 ,作为对照品溶液 。
(3)样品溶液的制备:取愈伤样品约 1 g,精密称定 ,置索氏提取器中 ,加石油醚(60℃ -90℃)100 ml,
水浴回流提取 2.5 h,弃去石油醚提取液并挥尽样品残存的石油醚 ,加甲醇 100 ml回流提取 4 h,放冷 ,滤
过 ,滤液移至 100ml量瓶中 ,甲醇加至刻度 ,再准确量取 1 ml于 10 ml量瓶中 ,加甲醇稀释至刻度 ,作为样
品溶液 。
(4)标准曲线的制备:取柚皮苷对照品分别配成 0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 mg/ml,分别
进样 10μL,按上述条件进行测定 ,以柚皮苷量为横坐标 ,峰面积积分值为纵坐标 ,绘制标准曲线。求得柚皮
苷的回归方程为 Y=227.85X– 0.4667。
(5)样品测定:取各样品溶液分别进样 10μL,依法测定 ,外标峰面积法计算含量 ,代入回归方程 ,计算 ,
图 1　柚叶片愈伤组织
Fig1　CallusfromCitrusgrandisleaves
A:叶片边沿产生的愈伤组织 , B:悬浮培养获得的愈伤组织
即得。作为对照品溶液。
1.2.5　指纹图谱研究 [ 5] 　
(1)色谱条件:流动相为 A:甲醇 , B:水 -乙酸
(按一定比例配比),梯度洗脱;色谱柱为 Kromasil
ODS-1柱 (250 mm×4.6 mm);流速为 1.0 ml/
min;检测波长为 283nm,柱温为 25℃。
(2)供试品溶液的制备:取柚叶愈伤 1g作为供
试品 ,精密称定 ,置索氏提取器中 ,加石油醚(60℃
-90℃)100ml,水浴回流提取 2.5 h,弃去石油醚
提取液并挥尽样品残存的石油醚 ,加甲醇 100 ml回
流提取 4 h以上 ,提取至无颜色 ,放冷 ,滤过 ,甲醇少
量分数次洗涤容器及滤纸 ,合并滤液和洗涤液 ,浓缩
并转移至 10 ml量瓶中 ,甲醇加至刻度 ,即得。
(3)对照品溶液的制备:(a)柚皮苷对照品的制
备:准确称取经干燥(105℃)至恒重的柚皮苷对照
品 ,加甲醇溶解 ,制成 6.2 g/L溶液 ,作为对照品溶
液 。(b)野漆树苷对照品的制备:准确称取经干燥(105℃)至恒重的野漆树苷对照品 ,加甲醇溶解 ,制成 0.
816g/L溶液 ,作为对照品溶液。
(4)柚皮苷元对照品的制备:准确称取经干燥(105℃)至恒重的柚皮苷元对照品 ,加甲醇溶解 ,制成 0.
·52· 绵阳师范学院学报(自然科学版) 第 28卷
088g/L溶液 ,
(5)测定方法:准确吸取对照品溶液与供试品溶液各 10μL,注入高效液相色谱仪中 ,按照高效液相色
谱法进行试验 ,以对照品为参照物 ,测定并记录色谱图。
2　结果与讨论
2.1　愈伤组织悬浮培养的建立
柚叶片的愈伤诱导比较困难 ,但在适当的生长素和蔗糖浓度配比下可以诱导愈伤(适当添加 PVP以防
止褐变)[ 3] 。结合前人研究结果和我们的摸索 ,发现 1.0 mg/L2, 4-D与 6%蔗糖处理的叶片愈伤组织诱
导率最高 ,可达 80%。用幼嫩的叶片作为外植体 , 30天后可在叶片边沿产生少量愈伤(图 1-A)。但继代
培养后增殖很慢 ,很难用于丛生芽诱导。所以 ,我们采用悬浮震荡培养的方式扩大培养 。将蔗糖浓度降至
3%, 30天后可以看到培养基颜色变绿 ,产生大量小颗粒状愈伤组织(图 1-B)。悬浮培养的愈伤组织收集
后用于有效成分提取 。
2.2　三个品种叶片愈伤中黄酮和柚皮苷的含量差异
由表 1可见柚皮苷和总黄酮类物质的含量沙田柚最高 ,琯溪蜜柚略低 ,而江津柚只有沙田柚的近乎
60%。这与直观的品种品质正相关。沙田柚和琯溪蜜柚是大规模种植的优良品种 ,而江津柚果实大小 、果
肉细腻程度 、糖度都较低。柚皮苷(图 2)和黄酮的检测发现它们的差别不仅表现在果实品质上 ,优良品种
次生代谢也比较旺盛 。
表 1　三种柚子品种叶片愈伤中黄酮和柚皮苷的含量
Table1　Totalflavonoidsandnaringincontentsofleafcallifrom3 Citrusgrandiscultivars
品种 黄酮含量 (mg· g-1) 柚皮苷含量 (mg· g-1)
江津柚 48.2±2.3 7.1±1.8
琯溪蜜柚 61.7±2.8 11.3±1.6
沙田柚 79.4±3.2 13.6±1.4
与标准样品对照得知图中的主峰显示柚皮苷的含量;
A为江津柚;B为琯溪蜜柚;C为沙田柚。
图 2　叶片愈伤中柚皮苷含量 HPLC分析
Fig2　HPLCanalysisofnaringinfromleafcalus
　　由于叶为植物的营养器官 ,可为其他器官(包括果实)提供
糖份等营养物质 ,而黄酮类成分等次生代谢物质的形成也必须
以糖代谢为前提 ,作为糖原形成的主要器官 ,叶中成分的变化
应会影响果实中相应成分的变化 [ 6] 。所以叶片愈伤组织的次
生代谢产物含量一定程度上可以代表果实的品质。也正因为
次生代谢产物含量与糖含量正相关 ,所以含糖量低的本地种 —
江津柚的柚皮苷和黄酮类物质较少。
2.3　三个品种叶片愈伤指纹图谱分析
指纹图谱法是现阶段建立中药质量标准新台阶的重要方
法 ,该法能较好地体现中药有效物质群的变化 [ 7] ,本试验率对
三种柚子品种先进行了动态指纹图谱的研究(图 3)。根据前人
研究结果[ 6]和标准样图谱 ,我们确定指纹图谱中三个主峰分别
是柚皮苷 、野漆树苷和柚苷元(分别在图中给予了标注)。与前
面测定结果类似 ,柚皮苷 、野漆树苷在琯溪蜜柚和沙田柚中较
高 ,其中沙田柚最高 ,而江津柚只有另外两个品种的大约一半 。
但柚苷元的含量与柚皮苷和野漆树苷不同 ,所有品种中差异不
显著。可能说明几个品种苷类次生代谢的初始产物含量相似 。
此外 ,可以明显观到察到沙田柚 10 -15分钟范围内波峰减少 ,
具体原因不明 ,有待深入研究。
·53·第 2期 周梦春等:三种柚叶悬浮培养愈伤组织黄酮类有效成分的比较研究
图 3　叶片愈伤 HPLC指纹图谱分析
Fig3 HPLCfingerprintsanalysisofleafcalus
3　意义和展望
柚类传统繁殖方式存在种子播种发芽率低 ,需要解除限制因素等弊端 ,且其遗传性状易产生较大变
异 ,扦插成活率低 ,嫁接成活率较高但成本太高.所以不能适应市场上对柚类良种大规模发展需要。通过
组织培养进行良种柚快速繁殖可以克服传统方法费工费时的缺点 ,又能获得具有高度一致和优良表型的
群体;而且高效 、稳定的快速繁殖体系是后继育种的基础(如为苗木繁育 、诱变育种和遗传转化 [ 8]等创造条
件.柚类属多年生木本植物 ,其组织培养的难度远比草本植物大 ,尤其是成年树的组织进行离体培养时 ,诱
导愈伤和根系的分化方面难度更大;目前仅有沙田柚 、文旦柚和蜜柚等有少量研究 [ 2, 3, 9 -11] ,组培以后植化
检测更少见报道 [ 12] 。我们对三种柚子品种进行了愈伤诱导和悬浮培养 ,掌握了分析柚叶愈伤次生代谢产
物的技术 ,为柚类的遗传转化提供了基础数据支持和方法经验积累 。
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AComparativeStudyoftheEffectiveComponentsofflavonoidsfrom
Suspension-culturedCalusAmongThreeCitrusgrandisCultivars
ZHOUMeng-chun1, 2 , SUZhi-xian2, ＊ , HUJin-yao2 , QIGang1, 2 , ZENGYan1, 2 , LIUMei1
(1.KeyLaboratoryofEnvironmentScienceandBiodiversityConservation, XihuaNormalUniversity,
Nanchong, Sichuan　637002;2.MianyangNormalUniversity, Mianyang, Sichuan　621000)
Abstract:LeafcaliofthreeCitrusgrandiscultivarsareculturedwithMS+2, 4-D1.0 mg/L+6%su-
crose.Thenthecaliareamplifiedbywayofsuspensionculturetoanalyzetheefectivecomponents.Theresults
showthat:TheShatian-Yucultivarhasthehighestlevelofflavonoids, naringinandrhoifolin, whiletheGuanxi
-Miyucultivarhasalitlelowerlevel, andtheJiangjin-Yucultivarhasthelowestlevel(about50-60%ofthe
Guanxi-Miyucultivars).Thenaringenincontentsintheleafcalifromthethreecultivarsareaboutthesamelev-
el.OurresultspresentsomebasicdataforfurthergenetictransformationandimprovementofCitrusgrandis.
Keywords:CitrusgrandisL.;calus;naringin;flavonoid
(上接第 50页)
StudyonExtractionandDeterminationofβ -caroteneinFreshVegetables
LIUXiao-yan1 , CHENZhang-xin2 , JIANGLi1
(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering, MianyangNormulUniversity, Mianyang, Sichuan　621000;
2.SchoolofLawandSociology, MianyangNormalUniversity, Mianyang, Sichuan　621000)
Abstract:β -caroteneindiferentfreshvegetableshasbeenextractedbythreediferentmethodsinthisar-
ticleandthecontentofβ -caroteneindiferentfreshvegetableshasbeendetermined.Theresultindicatesthat
thebestmethodforextractingβ -caroteneistosaponifythetestspecimenonehourwith4% NaOHmethylalco-
holsolutionin60-70candthentoseparatewith3:7(v/v)acetone-benzinecomponentsolventasextraction
solvent, MgOastheabsorbent, theacetone-benzineastheeluent.Extractedsolventhasbeendeterminedin
thecolordishcondition(1cm)byultravioletspectrophotometerat447nm.Theresultshowsthattheβ -carotene
incarrotis0.134 mg· g-1 , 0.0863 mg· g-1 inredpepperand0.0426 mg· g-1 inspinach.This
methodissimpleandwithhighextractionrate.
Keywords:vegetable;β -carotene;extraction;determination
·55·第 2期 周梦春等:三种柚叶悬浮培养愈伤组织黄酮类有效成分的比较研究