全 文 ：虎杖叶愈伤组织的诱导和白藜芦醇含量的测定
林若舟 (浙江绍兴文理学院生命科学学院，浙江绍兴 312000)
摘要 ［目的］诱导虎杖叶的愈伤组织并测定其中白藜芦醇的含量。［方法］以虎杖叶为组织培养材料，在28 ℃和黑暗培养条件下，在含
有浓度 0． 2 mg /L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和浓度 1 mg /L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)的MS诱导培养基中进行诱导，15 d后把诱导出的愈
伤组织转接到相同培养基中培养 15 d，转接 3次后，把愈伤组织切下放置在相同培养基上继续培养 3 次后，采用 HPLC法测定虎杖叶愈
伤组织中白藜芦醇的含量。［结果］诱导出的愈伤组织生长状况良好，并且测得虎杖叶愈伤组织中白藜芦醇的含量为 0． 24 mg /g。［结
论］由叶诱导出的愈伤组织中含有白藜芦醇成分，用 HPLC法测定其含量，方法简便、迅捷，结果可靠。
关键词 虎杖(POLYGONI CUSPIDATI RHIZOMAET RADIX);愈伤组织;叶;白藜芦醇
中图分类号 R282． 4 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2011)32 －19751 －02
Induction of Callus from P． cuspidatum Leaves and Determination of Resveratrol
LIN Ruo-zhou (College of Life Sciences，Shaoxing University，Shaoxing，Zhejiang 312000)
Abstract ［Objective］To induce the callus from P． cuspidatum leaves and to determine the content of resveratrol．［Method］P． cuspidatum leaves
as tissue culture materials were induced on MS induction medium containing 0． 2 mg /L 2，4-dichlorophenoxyacetic acid (2，4-D)and 1 mg /L 6-
amino-benzyl adenine (6-BA)at 28 ℃ and dark． 15 d later，the induced callus was transferred to the same culture medium for 15 d，which were
transferred 3 times． Subsequently，the callus was cut and then cultured in the same medium for three times． The content of resveratrol in the callus
induced fromP． cuspidatum leaves was determined by HPLC．［Result］The callus induced from P． cuspidatum leaves grew well，and its resveratrol
content was determined at 0． 24 mg /g．［Conclusion］The HPLC method was simple． Convenient，quick and accurate to determine the content of
resveratrol in P． cuspidatum leaves．
Key words P． cuspidatum;Callus;Leaves;Resveratrol
作者简介 林若舟(1988 －) ，男，浙江温州人，从事生命科学研究，
Email:linruozhou92@ 163． com。
收稿日期 2011-09-01
虎杖(POLYGONI CUSPIDATI RHIZOMAET RADIX)为
蓼科(Polygonaceae)植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb． et
Zucc．)的干燥根和根茎，白藜芦醇(Resveratrol，3，4，5-trihy-
droxy-trans-stilbene)是其主要活性成分。研究表明白藜芦醇
具有降血脂、抗菌、抗病毒、抑制血小板凝聚、抗炎和调节脂
蛋白代谢等药理作用［1 －7］。试验对虎杖叶进行愈伤组织诱
导，并通过 HPLC测定虎杖叶愈伤组织中白藜芦醇的含量，
以期为虎杖的进一步研究和利用提供理论依据。
图 1 白藜芦醇的结构
Fig． 1 The structure of resveratrol
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb． et
Zucc．)嫩叶采摘于绍兴种植园，经鉴定为正品。嫩叶采摘后
放置在塑料袋中，在叶洒上水，迅速带回实验室放置在 4 ℃
冰箱中。
1． 1． 2 主要仪器。Waters 1525 高效液相色谱仪、Waters
2487双波长紫外检测器、Waters breeze 色谱工作站，均购自
美国Waters公司。
1． 1． 3 主要试剂。白藜芦醇(图 1) ，批号:111535-201011，购
自浙江省药检所;甲醇为色谱纯，水为超纯水，醋酸为分析
纯，市售。
1． 2 方法
1． 2． 1 愈伤组织的诱导和继代。取虎杖嫩叶用自来水冲洗
干净后再用蒸馏水冲洗 5 次，滤纸吸干后在超净台经浓度
75%乙醇处理 2 min，然后浸泡在无菌水中涮洗，用浓度
0． 1% HgCl2 处理 8 min，接着浸泡在无菌水中涮洗干净，然
后用无菌滤纸吸干水分，把嫩叶切成 0． 5 cm ×0． 5 cm大小的
方块，然后接种在含有 2，4-D(0． 2 mg /L)和 6-BA(1 mg /L)的
MS培养基中，置于人工气候箱中 28 ℃暗培养。
1． 2． 2 色谱条件。色谱柱为 Waters bridge column(4． 6 mm
×250 mm，5 μm) ，流动相为无水甲醇 － 浓度 1% 醋酸
(45∶ 55，V /V) ，检测波长为 306 nm，流速 1 ml /min，柱温为 30
℃，进样量均为 20 μl。
1． 2． 3 供试品溶液的制备。取虎杖叶愈伤组织在 50 ℃烘
24 h，取 1． 000 g干粉，加 20 ml 无水甲醇，称定质量，超声处
理 30 min(用冰冷却) ，药渣用 10 ml无水甲醇洗 3次，合并洗
涤液与提取液，然后经微孔滤膜(0． 45 μm)过滤，滤液即为供
试品溶液。
1． 2． 4 标准溶液的制备及线性关系的考察。精密称取白藜
芦醇 3． 0 mg于 100 ml容量瓶中，加无水甲醇溶解并定溶，配
成浓度为 30 μg /ml的储备溶液。分别取 1 ml白藜芦醇储备
液稀释成质量浓度为 6． 0、12． 0、18． 0、24． 0、27． 0和 30 μg /ml
的溶液，每个浓度的溶液吸取 20 μl，注入液相色谱仪，记录
相应的峰面积值。以峰面积对质量浓度进行线性回归，计算
回归方程。
1． 2． 5 方法学考察。①精密度试验。取白藜芦醇溶液各 20
μl，重复进样 5 次，计算白藜芦醇峰面积和 RSD。②稳定性
试验。取供试品溶液于室温下放置，分别在 0、12、24、36、48 h
测定，计算白藜芦醇的平均峰面积和 RSD。③重现性试验。
平行制备 5份供试品溶液，在“1． 2． 2”色谱条件下进行测定，
计算白藜芦醇的平均峰面积和 RSD。④回收率试验。精密
称取 5份虎杖叶愈伤组织干粉，每份为 0． 200 g，按供试品溶
液的制备方法制备，再分别精密加入对照品各 15 μg，在
“1． 2． 2”色谱条件下进行测定，计算白藜芦醇的平均回收率
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39(32):19751 － 19752 责任编辑 石金友 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.32.109
和 RSD。
1． 2． 6 含量测定。精密称定 1． 000 g虎杖叶愈伤组织干粉，
按“1． 2． 3”的制备方法制备供试品溶液，在“1． 2． 2”色谱条件
下进行测定，计算白藜芦醇的含量。
2 结果与分析
2． 1 虎杖愈伤组织的诱导 叶在诱导培养基上生长 10 d
后能见到白色愈伤组织长出来，继续培养 5 d后转接到相同
培养基上进行继代培养，继代培养时间也是 15 d，连续继代
培养 3次后，用手术刀切下放置在相同培养基上进行增殖培
养，继续增殖培养 3次后进行白藜芦醇含量的测定(图 2)。
图 2 虎杖叶愈伤组织
Fig． 2 Callus induced from P． cuspidatum leaves
2． 2 方法学考察 ①线性关系的考察。以峰面积对质量
浓度进行线性回归，得白藜芦醇回归方程为 y = 952 462 x －
34 650，r2 = 0． 995 8，结果表明白藜芦醇在 6． 0 ～ 30． 0 μg /ml
浓度范围内呈良好的线性关系。②精密度试验。测得白藜
芦醇峰面积为 2 683 003 ± 96 578(n = 5) ，RSD 为 0． 16%，表
明仪器精密度良好。③稳定性试验。测得白藜芦醇的平均
峰面积为2 701 124 ±7 532(n =5) ，RSD为 0． 14%，表明在48
h内稳定。④重现性试验。测得白藜芦醇平均峰面积为 2
698 542 ±6 256(n =5) ，RSD为 0． 12%，表明重现性良好。⑤
回收率试验。计算白藜芦醇的平均回收率为 99． 6%，RSD 为
1． 34%(n =5) ，表明该方法简便、快捷，准确度高，可以用来
测定虎杖叶愈伤组织中白藜芦醇的含量。
图 3 白藜芦醇对照品 HPLC色谱图
Fig． 3 HPLC chromatogram of resveratrol standard substance
2． 3 含量测定 由图 3 ～4可知，白藜芦醇对照品 HPLC色
谱图与虎杖叶愈伤组织的 HPLC色谱图中，在相同的保留时
间上有对应的吸收峰，故能初步表明虎杖叶愈伤组织中含有
白藜芦醇。用试验方法测定何虎杖叶愈伤组织中白藜芦醇
的含量为 0． 24 mg /g。
图 4 虎杖叶愈伤组织白藜芦醇 HPLC色谱图
Fig． 4 HPLC chromatogram of resveratrol in the callus induced
from P． cuspidatum leaves
3 讨论
(1)试验采用 HPLC 测定虎杖愈伤组织和悬浮细胞中白
藜芦醇的含量，结果准确、精密度高、重复性好，平均加样回
收率为 99． 6%，RSD 为 1． 34%，说明该方法可用于虎杖愈伤
组织中白藜芦醇的定量分析。
(2)传统种植技术周期长，目标产物产率低，利用植物愈
伤组织培养体系生产药用植物有效成分是一种高效、快速、
低廉的方法。虎杖愈伤组织中含有 0． 24 mg /g的白藜芦醇，
同野生型的白藜芦醇含量相比较，尽管产量稍低，但是周期
短［8］。通过高产细胞株系的筛选和培养条件的优化，可以使
其达到或超出天然来源的含量。
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25791 安徽农业科学 2011 年