全 文 ：一羟鬼笔毒肽(PHN)的制备及其毒理研究
魏宝阳1 , 2 ,高国赋2 ,陈作红1
(1.湖南师范大学生命科学学院 , 中国 长沙　410081;2.湖南农业大学生物科学技术学院 ,中国 长沙　410128)
摘　要　利用反相高效液相色谱技术对灰花纹鹅膏菌(Amanita fuliginea)的肽类毒素进行分离 , 并对保留时间
为60.807 min 的成分进行了纯化 , 纯度达到99%.通过环肽检测 、紫外光谱和质谱鉴定为一羟鬼笔毒肽(PHN), 其相
对分子质量为 772.36 Da.一羟鬼笔毒肽(PHN)能引起植物细胞坏死 ,对小白鼠的 LD50为 1 414μg·kg-1 , 能引起小白
鼠肝脏充血 ,血液循环衰竭.
关键词　灰花纹鹅膏菌;高效液相色谱;质谱;一羟鬼笔毒肽
中图分类号　Q943.1　　　　文献标识码　A　　　　文章编号　1000-2537(2006)02-0089-04
Preparation and Toxicology of Phalloin(PHN)
WEI Bao-yang1, 2 , GAO Guo-fu2 , CHEN Zuo-hong1
(1.College of Life Science , Hunan Normal University , Changsha 410081 , China;
2.College of Biology Science and Technology , Hunan Agriculture University , Changsha 410128 , China)
Abstract　Phalloin is isolated and prepared from Amanita fuliginea by means of reversed- phage high-performance
liquid chromatography , the purities of the yield are over 99%.Phalloin were identified through the cyclopeptide determi-
nation , UV spectrograph and MS.The molecular weight is 772.36 dalton.Phalloin can cause plant cellular to be necro-
sis.The LD50 in white mice is LD50=1 414μg·kg-1.Phalloin can cause the liver of the white mice to be hyperemia and
the blood circulation crock up.
Key words　Amanita fuliginea;RP-HPLC;MS;Phalloin
一羟鬼笔毒肽(PHN)是鹅膏肽类毒素的一种 ,与二羟鬼笔毒肽(PHD)类似 ,能特异性地与微丝球形肌动
蛋白G-actin(globular actin)结合 ,因而一羟鬼笔毒肽用荧光物质标记后 ,可做肌球蛋白的探针 ,在研究细胞骨
架的结构和功能中有应用价值.目前市场上 SIGMA 公司出售的 PHN 来自于欧洲的毒鹅膏(Amanita phal-
loides),价格极其昂贵 ,140.60美元 mg.近年来在我国南方一些省份频繁引起中毒死亡事件的灰花纹鹅膏菌
(Amanita fuliginea Hongo)就含有一羟鬼笔毒肽.本文利用反相高效液相色谱技术第一次从灰花纹鹅膏菌中分
离纯化出一羟鬼笔毒肽 ,并对其毒性进行研究 ,结果报道如下.
1　实验部分
1.1　材料
灰花纹鹅膏菌(Amanita fuliginea Hongo)采自长沙县 ,小白鼠购于中南大学湘雅医学院 ,绿豆购自市场.
1.2　仪器和试剂
Waters Delta 600 E液相色谱仪(Waters公司),色谱工作站(杭州英谱公司),色谱分析柱:YWG C18 10 μm
收稿日期:2006-04-06
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30070005);湖南省科技厅基金资助项目(03JZY3036)
2006 年 6月
第 29 卷 第 2期　　　　　　　　 　
湖南师范大学自然科学学报
Journal of Natural Science of Hunan Normal University
　　　　　　　　 　Vol.29　No.2
Jun., 2006
ID 4.0 mm×300 mm.半制备柱:YWG C18 10 μm ID 10 mm ×300 mm(大连依利特科学仪器有限公司), UV-
2401PC紫外分光光度计 ,Q-TOF 质谱仪.
醋酸铵购于美国 Sigma公司 、乙腈和甲醇为色谱纯购于湖南省化工研究院 、冰醋酸为分析纯 、航空汽油 、
双蒸水(自制).
1.3　实验方法
1.3.1　粗毒抽提　参照文献[ 1] .
1.3.2　一羟鬼笔毒肽的分离纯化　分离纯化方法按文献[ 1] .纯化梯度模式:0 ～ 10 min ,A 液 100%～ 95%;
10 ～ 25 min ,A液95%～ 20%,并保持 5 min;30 ～ 35min ,A液 20%～ 0%,并保持 5min;40 ～ 45min ,A液 0%～
100%,并保持到结束.检测波长:295 nm;柱温:40 ℃;流速:分析柱 1 mL min;半制备柱 2 mL min.进样量:分
析柱 10μL ,半制备柱 1 mL.
1.3.3　结构鉴定　分离纯化结果用环肽检测分析参照文献[ 2] .紫外扫描测最大吸收波长 ,LCQ-Advantage离
子阱质谱仪测定分子量.
1.3.4　一羟鬼笔毒肽(PHN)对绿豆种子萌发的影响　参照文献[ 3] .
1.3.5　一羟鬼笔毒肽(PHN)的 LD50的测定　采用[ 4]上所记载的简易方法.
1.3.6　一羟鬼笔毒肽(PHN)的小白鼠毒理实验　注射一羟鬼笔毒肽(PHN)3 h后解剖 ,观察脏器的变化 ,测
脏体比.
2　结果与分析
2.1　分离纯化
图 1　灰花纹鹅膏菌粗毒提取液的 HPLC 图谱 图 2　60.807 min 峰的纯化后的 HPLC 图谱
　　灰花纹鹅膏菌粗毒提取液在 RP-HPLC半制备柱上的分离纯化结果如图 1.分离效果较好 ,分离度高 ,峰
形比较好 ,主要毒素成分可以较好的分离 ,目标物质(60.807 min)也能很好的得以分离.分离收集后纯度达
90%以上.进行一次纯化后 ,纯度即可以达到 99%以上.
2.2　结构鉴定
2.2.1　样品的环肽检测　样品在板 2上有黄色斑点 ,而板 1相应位置上无显色的斑点 ,由此可知样品是
环肽.
2.2.2　样品的紫外光谱分析　样品在 0.02 mol L的NH4AC和HAC的缓冲液 pH 为 5的条件下测定毒素的
最大吸收波长 ,其最大吸收波长为:290.71 nm(见图3).
从文献报道来看 ,在 phallotoxins中 ,生色基团为2′-(SR)Trp的衍生物 ,其紫外吸收光谱的波长区的λmax为
290 nm.在其他的天然产品中 ,这些生色基团是极少数的.因此从紫外吸收光谱分析可以知道该样品为鬼笔
毒肽(phallotoxins).同时从紫外吸收光谱的峰形可以进一步说明上述 HPLC 分离纯化得到的物质纯度较高 ,
该分离纯化的工艺流程适合分离鹅膏毒素.
2.2.3　样品的质谱分析　质谱的结果如图 4.从样品的分子离子峰(M +)可以看出有两组峰 ,分子离子峰分
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别为 755.349 9 Da和 773.363 9 Da ,再减去一个质子 ,得到其相对分子质量分别为 754.349 9 Da和 772.363 9
Da;其中772.363 9Da与文献资料(Wieland ,1986)的吻合;两个分子离子峰相差18.014 0 Da ,可能是由于脱掉
一个水形成的.从环肽检测 、紫外吸收和质谱 ,可以确认该样品是 Phalloin(PHN).
图 3　样品的紫外吸收图谱 图 4　样品的的质谱图
2.3　毒理分析
2.3.1　一羟鬼笔毒肽(PHN)对绿豆种子萌发的影响　一羟鬼笔毒肽(PHN)对绿豆豆芽胚根根长和根重的影
响如图5 、图 6所示.
图 5　PHN 对豆芽胚根根长的影响 图 6　PHN对豆芽胚根根重的影响
　　从图 5可以看出 ,随着 PHN浓度的增加 ,对胚根的平均长度抑制越强 ,由此可以推断 ,该毒素抑制种子
胚根的增长.从图 6可以看出 ,胚根的重量随着毒素浓度的增加而减少.该实验的结果与 PHD的实验结果
相似.
2.3.2　PHN的半致死剂量　预备实验采用 3组剂量 ,即 5 , 0.5 , 0.05 mg·kg-1 ,其死亡率分别为 100%, 0%,
0%;补充实验采用 4组剂量 ,即 1 , ,4 ,8 mg·kg-1 ,其死亡率分别为 0%,100%, 100%,100%.根据预备实验和
补充实验结果 ,可以计算出 LD50=1 414μg·kg-1.
2.3.3　PHN的小白鼠毒理实验　1)注射 PHN的小白鼠的活动情况与解剖学观察.怕冷(小白鼠聚集在一
起),行动迟缓 ,嗜睡 ,呼吸急促;3 h后出现死亡 ,4 h没有死亡的小白鼠过几小时后又重新恢复正常.
致死老鼠的解剖学上的形态观察:肝脏的颜色变成深黑色 ,呈糜烂状 ,明显萎缩 ,其他器官没有明显
异常.
2)注射PHN的小白鼠的脏体比结果.在 PHN注射 2 ～ 5 h后小白鼠即死亡 ,说明该组分是快作用毒素 ,
属于鬼笔毒肽类毒素.通过对 PHN脏体比的结果可以看出:肝体比与毒素浓度的变化有很大的相关性 ,毒素
浓度越大 ,对肝的影响越大 ,小白鼠的死亡时间也明显提前 ,对肾可能也有影响.说明 PHN是肝作用毒素 ,与
鬼笔毒肽的毒理特性相似 ,并且半致死剂量与文献资料记载的半致死剂量 1 500 μg·kg-1很接近.
表 1　注射 PHN的脏体比统计结果
脏体比 注入毒素的量 μg
0 10 25 50 100
肝体比 % 5.33±0.50 5.63±1.45 6.38±0.97 8.42±0.75 8.37±0.53
肾体比 % 1.40±0.22 1.56±0.32 1.64±0.27 1.58±0.19 1.82±0.18
　　注:5个组 , 每组 10 只小白鼠 , x±s.
91第 2期　　　　　　　　　　　　　魏宝阳等:一羟鬼笔毒肽(PHN)的制备及其毒理研究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
3　讨论
用该技术分离制备的一羟鬼笔毒肽(PHN)具有生物学活性 ,与Wieland 制备的毒素的活性一致 ,如本次
测得的半致死剂量 LD50=1 414μg·kg-1与Wieland测得的 LD50=1 500μg·kg-1的结果吻合 ,说明使用的试剂
如乙腈等有机溶剂对毒素的活性没有影响 ,使用该方法制备该毒素是可行的.
一羟鬼笔毒肽(PHN)对绿豆种子萌发的毒理作用的原理是由于一羟鬼笔毒肽(PHN)专一性地与植物细
胞的丝状肌动蛋白(F-actin)结合 ,从而打破了纤维形肌动蛋白(F-actin)与球形肌动蛋白G-actin之间的平衡 ,
形成了大量的 F-actin- Phallotoxins的复合体 ,阻止了F-actin解离成G-actin ,使细胞的骨架系统发生改变 ,从而
影响核膜 、液泡膜等膜系统.核膜由于失去了 F-actin支撑而使细胞核的形状发生明显改变 ,液泡膜通透性也
发生了改变 ,引起细胞内物质的流失 ,从而细胞的分裂和生长也受到相应的影响.所以随毒素浓度增大 ,根尖
伸长的抑制作用越大 ,根的干重下降越明显和根尖腐败程度增大.
在临床实践过程中我们发现 ,毒蕈毒素引起的急性中毒主要作用于肝脏和肾脏 ,尤以肝脏为主 ,镜下能
发现大量的肝细胞坏死 ,实验动物研究也能证实这一点 ,说明损害具有器官特异性.但这主要是鹅膏毒肽的
作用结果 ,因为一羟鬼笔毒肽(PHN)等鬼笔毒肽不能被人的肠胃吸收 ,所以对人没有毒性.一羟鬼笔毒肽
(PHN)能使肝脏重量显剧增加 ,体积增大 ,几乎占了体腔体积的一半 ,晚期肝较硬.因而采用动物的脏体比来
特异地评价毒素的活性是有效的.
参考文献:
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[ 5] 　陈作红 , 胡劲松 ,张志光 ,等.我国 28 种鹅膏菌主要鹅膏毒肽和鬼笔毒肽的检测分析[ J] .菌物系统 , 2003 , 22 (4):565-
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[ 7] 　WIELAND T.Peptides of poisonous Amanita mushroom[ M] .Germany:Springer Verlag New York Inc , 1986.
(上接第 60页)
　　〈U〉 = 1
2
Mω2〈u2〉 = 3
4
hω,〈u2〉 = 3h
2Mω. (12)
由此 ,根据式(9),在绝对零度下
　　I(hkl)= I0exp(-hG2 2Mω). (13)
如果 G =109 cm-1 , ω=1014s-1 以及 M =10-22 g ,指数函数的辐角近似等于 0.1 ,因此 I = I0;0.9.在绝
对零度 ,射线束的 90%是弹性散射 ,10%是非弹性散射.
3　结论
从式(11)以及图 1可以见到衍射线条的强度随温度的增高而减弱 ,但并不发生突变 ,低 G(低指数)的反
射受到的影响比高 G(高指数)反射小.在给定的温度下 ,|G|愈大 ,高温时的反射愈弱.同时 ,谱线的锐度不
会随散射角的增大和温度的升高而受到损失.此结论与实验曲线符合较好.
参考文献:
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