全 文 ：金槐米槲皮素对人鼻咽癌细胞的干预作用研究
顾生玖1，刘建楠1，姚丽新2，杨 娜1，朱开梅1*
(1．桂林医学院，广西桂林 541004;2．广西壮族自治区南溪山医院，广西桂林 541002)
摘要 ［目的］探讨金槐米槲皮素对人鼻咽癌 CNE2细胞的干预作用。［方法］通过微波辅助提取法从桂北金槐米中提取槲皮素并纯化，
用浓度 20、40、60和 80 μmol /L的槲皮素作用于人鼻咽癌细胞 CNE2;分别在 24、48和 72 h 后，采用 MTT 法初步检测人鼻咽癌细胞被抑
制的情况，用流式细胞术分析其细胞周期和凋亡率、光学显微镜观察细胞形态学变化。［结果］从槐米中提取的槲皮素对鼻咽癌细胞有
明显的抑制作用，且呈浓度、时间明显的依赖性，药物干预作用的最适浓度为 60 μmol /L，药物干预后形态学观察的最适宜时间为 48 h。
细胞周期分析显示，槲皮素能阻滞鼻咽癌细胞于 G1期。［结论］从桂北金槐米中提取的槲皮素对人鼻咽癌细胞有较强的干预作用。
关键词 金槐米;槲皮素;人鼻咽癌
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)18 －09639 －02
Intervention Effects of Quercetin from Sophora japonica on the Human Nasopharyngeal Carcinoma Cell
GU Sheng-jiu et al (Guilin Medical University，Guilin，Guangxi 541004)
Abstract ［Objective］To discuss the intervention effects of Sophora japonica quercetin on the human nasopharyngeal carcinoma cell CNE2．
［Method］Quercetin was extracted from S． japonica and then purified by microwave-assisted extraction． Quercetin was used to interfere human
nasopharyngeal carcinoma cell CNE2 with the concentrations of 20，40，60 and 80 μmol /L． After 24，48 and 72 h，the inhibitory situation of
human nasopharyngeal carcinoma cell CNE2 was preliminarily detected by MTT method． Cell cycle and apoptosis rate were analyzed by flow
cytometry;and morphological changes were observed by optical microscope． ［Conclusion］Quercetin extracted from S． japonica had signifi-
cantly inhibitory effects on the human nasopharyngeal carcinoma cell，and showed obvious concentration and time dependent manners． The op-
timal concentration of drug intervention was 60 μmol /L． After drug intervention，the optimal morphological observation time was 48 h． Cell cy-
cle analysis showed that quercetin was able to block nasopharyngeal carcinoma cell at G1 period． ［Conclusion］Quercetin was extracted from
S． japonica had intervention effects on human nasopharyngeal carcinoma cell．
Key words Sophora japonica;Quercetin;Nasopharyngeal carcinoma cells
基金项目 广西科技攻关项目(科技攻关 0815005-1-17;0992003A-25;
09321056)资助;桂林市科技攻关项目(科技攻关20110106-5)。
作者简介 顾生玖(1965 － ) ，男，甘肃靖远人，教授，博士，从事天然药
物抗肿瘤研究研究，E-mail:glzkm @ 163． com。* 通讯作者，
教授，硕士，从事天然药物抗肿瘤研究，E-mail:5899602@
glmc． edu． cn。
收稿日期 2012-03-12
金槐米是桂北地区的经济作物之一，其干燥花蕾能清热
止血，用于治疗血热所致的各种出血症。金槐米的主要有效
成分是芦丁和槲皮素等黄酮类活性物质。槲皮素是近年来
的研究热点，其不仅能抗炎症、抗过敏、抗病毒、抗肿瘤和抗
氧化［1］，还能抑制肺腺癌细胞株 A549细胞的生长［2 －4］，而且
可以对人乳腺癌细胞的增殖和凋亡产生效应［5］。笔者探讨
金槐米中的槲皮素对鼻咽癌细胞干预作用的最适宜浓度与
时间，以期为金槐米的进一步研究提供参考。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。金槐米，采自广西全州，经广西植物研究
所蒋运生研究员鉴定为金槐米。
1． 1． 2 主要仪器。FACSCalibur 流式细胞仪，购自美国 Bec-
ton Dicknson公司;二氧化碳培养箱，购自美国 Thermo Fisher
公司;倒置荧光显微镜，购自日本 Olympus公司;多功能高速
冷冻离心机，购自德国 Eppendorf 5804R公司;GIS-2800 凝胶
成像系统，购自上海天能科技公司。
1． 1． 3 主要试剂。人鼻咽癌 CNE2细胞，由桂林医学院科学
实验中心提供;RPMI 1640、胎牛血清和胰蛋白酶，均购自美
国 Gibco公司;HEPES，购自美国 Amresco公司;MTT、二甲基
亚砜(DMSO) ，均购自美国 Sigma公司;金槐米槲皮素为实验
室自行提取纯化，纯度为 96． 7%。
1． 2 方法
1． 2． 1 样品溶液的制备［6］。将采集的桂北地区金槐米晒干
后，粉碎干燥保存。称取适量金槐米粉末，按料液比 1∶ 20
(g /ml)加入浓度55%乙醇，浸泡2 h，然后将其在微波功率为
380 W、微波温度 60 ℃的条件下提取 9 min，静置 8 h，经高效
液相测定其含量。槲皮素提取及鉴定按文献介绍的方法进
行操作［7］。
1． 2． 2 细胞的培养。取对数生长期细胞鼻咽癌 CNE2 细胞
接种于 24孔培养板上，用 PBS 冲洗细胞 2 ～ 3 次，每孔加适
量的含浓度 10%胎牛血清的培养基，在 37 ℃、浓度 5% CO2
的培养箱中培养，用浓度 0． 25%的胰蛋白酶消化传代，每 2
～3 d换液 1次，进行细胞传代。细胞分以下 2 组进行处理:
①对照组。细胞不作任何处理。②试验组。槲皮素浓度分
别为 20、40、60和 80 μmol /L组，每个浓度组与对照组均设 4
个平行孔。2组试验的观察时间相同。
1． 2． 3 不同浓度槲皮素对细胞生长的抑制作用。取经传 3
～4代后的对数生长期细胞，用浓度 0． 25%胰蛋白酶溶液进
行消化，然后用吸头轻轻吹打制成细胞悬液，按每个孔的细
胞数量约为 5 ×103 个接种到洁净的 96 孔板中，每孔加入细
胞悬液 200 μl，每组设 5个平行孔，置于细胞培养箱中，在 37
℃、浓度 5%CO2 及饱和湿度的条件下静置培养 24 h，在倒置
显微镜下观察细胞贴壁后，吸弃原培养基，随即加入不同浓
度的槐米槲皮素(药物终浓度为 20、40、60和 80 μmol /L) ，并
设空白对照组，对照组加入等量没有槐米槲皮素的 DMEM
培养液，并在 96孔板剩余孔补上等 PBS以防止试验孔液体
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(18):9639 － 9640，9668 责任编辑 石金友 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.18.056
过快蒸发。分别在37 ℃培养箱中培养24、48和72 h，然后取
出 96孔板，每孔加入 10 μl浓度为 5 mg /ml 的 MTT，并在 37
℃的培养箱中继续孵育 4 h，吸弃原上清液，在避光条件下每
孔加入 100 μl DMSO，振荡 10 min，待结晶溶解后用酶标仪在
595 nm波长处测定吸光度(A595)并记录试验结果，按下列计
算公式计算抑制率:细胞抑制率(%)=(对照组 A值 －试验
组 A值)/ 对照组 A值 ×100。
1． 2． 4 细胞周期的改变和细胞凋亡的检测。将贴壁生长到
80%的融合细胞加入浓度 40 μmol /L 的槲皮素，分别作用
24、48和 72 h，然后用浓度 0． 125%胰酶消化，于 4 ℃、1 000
r /min离心 5 min，收集细胞，然后边滴入浓度 95%乙醇边摇
匀，使乙醇终浓度为 70% ～ 75%以固定细胞，并在流式细胞
仪上进行检测。试验对照组只加10 μl DMSO，空白对照组细
胞不作任何处理。
1． 2． 5 统计学方法。所有试验数据均采用 SPSS17． 0 统计
软件进行单因素方差分析。
2 结果与分析
2． 1 金槐米槲皮素对鼻咽癌细胞的抑制作用 槲皮素对人
宫颈癌 HeLa 细胞的增殖具有明显抑制作用，且呈明显的时
间、剂量相关性［8］。观察发现，浓度 80 μmol /L 的槲皮素在
作用 12 h后出现抑制作用。由表 1可知，不同浓度槐米槲皮
表 1 不同浓度金槐米槲皮素对鼻咽癌细胞的抑制作用
槲皮素
浓度
μmol /L
抑制率∥%
24 h 48 h 72 h
20 16． 415 ±0． 146 2ab 20． 570 0 ±0． 391 83ab 37． 532 5 ±0． 737 76a
40 28． 135 ±0． 154 2ab 40． 170 0 ±0． 353 93ab 70． 775 0 ±0． 553 68a
60 60． 813 ±0． 557 8ab 74． 712 5 ±0． 644 17ab 88． 217 5 ±0． 452 21a
80 90． 560 ±0． 390 5ab 92． 957 5 ±0． 727 66ab 96． 670 0 ±0． 459 49a
注:a为与对照组比较(P ＜0． 01) ;b 为与 72 h组比较(P ＜0． 01)。
素作用人鼻咽癌 CNE2 一段时间后，对鼻咽癌 CNE2 细胞均
有一定的抑制作用;随着槲皮素的浓度增加和作用时间的延
长，槐米槲皮素对鼻咽癌 CNE2细胞生长的抑制作用越来越
明显，呈剂量和时间依赖性。统计分析各浓度组细胞存活率
与对照组的差异均有统计学意义(P ＜ 0． 01) ;相同作用时间
下，各浓度组间细胞存活率差异均有统计学意义(P ＜0． 01) ;
同一浓度下，24 h与72 h，48 h与 72 h 组的细胞存活率差异
有统计学意义(P ＜ 0． 01)。结果表明，金槐米槲皮素对人鼻
咽癌 CNE2细胞在体外有抑制增殖的作用，并且其抑制效果
跟药物浓度和药物作用时间呈正相关。
2． 2 金槐米槲皮素对鼻咽癌细胞周期的影响和对凋亡的诱
导情况 槲皮素对肿瘤细胞凋亡有较强的诱导作用，研究
报道用 40 ～120 μmol /L的槲皮素作用 Cloudman S91细胞 72
h，显示流式细胞仪检测有亚 G 峰出现，能把细胞被阻滞于
G0 /G1 期
［9］。试验观察发现，用浓度 20、40、60 和 80 μmol /L
的槲皮素处理人鼻咽癌 CNE2细胞 48 h后，该细胞周期阻滞
在 G1 期，各浓度组与对照组比较具有统计学意义(P ＜
0. 05)。S期的细胞数量减少，浓度 40、60 和 80 μmol /L浓度
组与对照组相比具有统计学意义(P ＜0． 05)或(P ＜0． 01)。
表 2 金槐米槲皮素对鼻咽癌细胞周期的影响
槲皮素浓度
μmol /L
n G1 期 G2 期 S期
－ 3 59． 59 ±0． 41 10． 61 ±0． 97 29． 80 ±1． 37
20 3 64． 59 ±0． 98* 7． 65 ±1． 05 27． 76 ±0． 94
40 3 68． 35 ±1． 09* 7． 81 ±0． 30 23． 84 ±1． 39*
60 3 70． 68 ±0． 58* 8． 03 ±0． 31 21． 28 ±0． 64*
80 3 84． 05 ±1． 96* 10． 23 ±1． 06 5． 72 ±0． 90＊＊
注:* 为(P ＜0． 05) ;＊＊为(P ＜0． 01)。
2． 3 槲皮素对鼻咽癌细胞形态学的影响 为进一步分析槲
皮素作用于鼻咽癌细胞的剂量依赖关系，也为明确考察最佳
药物浓度，将不同浓度的槲皮素作用于人鼻咽癌 CNE2 细胞
处理 48 h后，倒置显微镜下清晰可见:对照组(未用药组)细
胞生长状态良好，排列紧密，部分细胞出现了重叠生长。细
胞大多呈圆形或椭圆形，边缘整齐，胞质均匀，细胞核居中。
当槲皮素浓度为 20 μmol /L 时，整体观察发现，细胞部分细
胞体积明显缩小，形态不规则，一些细胞粘附能力下降，细胞
逐渐破裂而死亡。当浓度达到 80 μmol /L时，大部分细胞发
生了萎缩，细胞体积减小，细胞轮廓不清，出现了毛刺状，细
胞质分布不均，细胞失去粘附能力，出现大量的细胞碎片。
图 1 槲皮素对人鼻咽癌 CNE2细胞形态学的影响(200 ×)
3 结论与讨论
试验结果表明，从金槐米中提取的槲皮素对鼻咽癌细胞
有较强的干预作用，且呈明显的浓度、时间依赖性关系。当
金槐米槲皮素浓度为 60 μmol /L 时，干预作用较好;观察金
槐米槲皮素对鼻咽癌细胞的形态学影响发现，其最适宜的观
察时间为作用 48 h后。
肿瘤的发生和发展与细胞程序性死亡有关。许多抗肿
瘤药物都是通过影响细胞周期达到对肿瘤细胞的杀伤作用。
槲皮素对细胞周期的影响结果文献报道不一。Ranellitte 等
(下转第 9668 页)
0469 安徽农业科学 2012 年
续表 1
种类 科 名称 入药部位 功效
玄参科 婆婆纳 Veronica didyma Tenore 全草 凉血止血、理气止痛
爵床科 爵床 Rostellularia procumbens (L．)Ness 全草 清热解毒、利尿消肿、截疟
酢浆草科 红花酢浆草 Oxalis corymbosa DC． 全草 清热消肿、散瘀血、利筋骨
酢浆草 Oxalis corniculata L． 全草 清热利湿、消肿、安神
商陆科 商陆 Phytolacca acinosa Roxb． 根 峻下通水，解毒消肿
锦葵科 磨盘草 Abutilon indicum (Linn．)Sweet 全草 清热利湿、开窍活血
茄科 少花龙葵 Solanum photeinocarpum Nakamura et Odashima 全草 清热利湿、凉血解毒
小檗科 黄芦木 Berberis amurensis Rupr． 根茎皮 清热消炎、健胃
细叶小檗 Berberis poiretii Schneid． 根茎 清热祛湿、泻火解毒
旋花科 裂叶牵牛 Pharbitis nil (L．)Choisy 种子 泻水利尿
景天科 垂盆草 Sedum sarmentosum Bunge 全草 清热解毒、消肿排脓
虎耳草科 落新妇 Astilbe chinensis (Maxim．)Franch． et Savat． 根状茎 治筋骨酸痛
豆科 山合欢 Albizia kalkora (Roxb．)Prain 根和茎皮 补气活血、消肿止痛
葛 Pueraria lobata (Willd．)ohwi 根、茎 治关节痛
苦木科 臭椿 Ailanthus altissima (Mill．)Swingle 根皮、果 收敛止血、利湿清热
苦木 Picrasma quassioides(D． Don)Benn． 树皮 泻热
楝科 香椿 Toona sinensis (A． Juss．)Roem． 根皮、果 收敛止血、祛湿止痛
苦楝 Melia azedarach L． 皮、叶、果 祛湿、止痛
木兰科 厚朴 Magnolia officinalis Rehd． et Wils． 皮 行气消积
锦葵科 苘麻 Abutilon theophrasti Medicus 种子 通乳
梧桐科 梧桐 Firmiana platanifolia (L． f．)Marsili 花、果、根皮 祛风除湿、清热解毒
堇菜科 紫花地丁 Viola philippica Cav． 全草 清热解毒
犁头草 Viola inconspicua Bl． 全草 清热解毒，散阏消肿
五加科 刺楸 Kalopanax septemlobus (Thunb．)Koidz． 根 清热祛痰、收敛镇痛
伞形科 水芹 Oenanthe javanica (Bl．)DC． 全草 热凉血、利尿消肿、降血压
积雪草 Centella asiatica (Linn．)Urban 全草 清热解毒、止血利尿、活血祛瘀
白芷 Angelica dahurica(Fisch． ex Hoffm．)Benth． et Hook． f． ex Franch． et Sav． 根 祛风除湿、通窍止痛
牻牛儿苗科 牻牛儿苗 Erodium stephanianum Willd． 全草 强筋骨、祛风湿、清热解毒
老鹳草 Geranium wilfordii Maxim． 全草 活血通经、清热止泻
卫矛科 南蛇藤 Celastrus orbiculatus Thunb． 全株 祛风除湿、通经止痛
灯心草科 灯心草 Juncus effusus Linn． 茎髓 清热、利水渗湿
4 结论与讨论
试验共整理出 108 种药用植物，其中商陆、葛、海金沙、
益母草和何首乌等 12 种有较大面积的分布，未发现野大豆
和明党参等濒危稀有种。老山有丰富的野生药用植物资源，
在中药资源逐渐减少的今天，应依托有利的自然环境发展人
工栽培，既可以合理开发资源又能改善当地单一的农业结
构。根据实地调查和文献查阅，笔者认为葛根和何首乌 2个
品种可以在老山地区进行人工栽培试验，以野生种为栽培对
象，人工仿野生栽培，逐步建立种植基地。
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1994．
(上接第 9640 页)
研究表明，槲皮素阻断 HT229、wiDr、COL0201 和 LS-174人克
隆细胞株于 G0 /G1期
［10］。因此，槲皮素对细胞周期的影响的
作用机制有待进一步研究。
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