全 文 ：第 52 卷 第 3期
2 0 8年 9 月
江苏教育学院学报 (自然科学版 )
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.
25
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.
2 (洲〕8
香樟叶黄酮类化合物的提取及抑菌作用的研究
戴 群 朱 晓 新
(江苏教育学院生物系 , 江苏南京
翁 德 宝
2 1X() 13 )
摘 要 本文以香樟叶为材料 ,采用石油醚除脂 , 乙醇浸提方法 , 获得黄酮类化合物的提取物 . 乙醇提取物用 M g +
H CI
,
zn
+ HCI
,
1% eF 1C
3 一 乙醇液 , 2% 川 1C 3 一 乙醇液 , 1% N aO H 进行显色反应 ,呈现黄酮类化合物性质特征颜色 . 这提示
样品提取物中含有黄酮类化合物 . 用该提取物对 4 种细菌 , 3 种霉菌进行抑菌实验 . 结果表明 ,提取物具有较强的抗菌活
性 ,且抗菌活性作用呈现明显的量效关系 ,但对不同菌种的抑菌效果有明显差异 .
关键词 香樟叶 ;黄酮类化合物 ;提取 :抑菌作用
香樟 ( iC
~
m ,
c a杯甲ho ar ( iL n
.
) Po sl )系樟树属的常绿乔木植物 ,是我国亚热带绿阔叶林的主要树种之一 ,资源丰富 .
樟树具有驱虫 、 防腐 、耐蛀的功能 . 提取樟树叶色素 、香料等用来制成植物农药、 氧化剂和医药产品等 . 樟树叶为可再生资源 ,其
应用前景广阔 . 黄酮类化合物具有消炎 、 消肿 、 降压 、 降血脂以及清除氧自由基等多种功能 , 已用于食品 、 药品 、 化妆品等产品
中川 .
黄酮类化合物 (加加no 汕 )是在植物中分布非常广泛的一类低分子量的天然产物 ,其在植物体内大部分与糖结合成昔类 ,有
一部分是以游离态 (昔元 )形式存在的 . 绝大多数的植物体内都含有黄酮类化合物 ,其对植物的生长、 发育 、 开花 、 结果及防菌防
病等方面起着重要的作用 2[] . 同时 ,黄酮类化合物生理活性多种多样 ,如皮素 ( q ue cr et i。 ) 、芦丁 (心 i。 ) 、 葛根素 ( p ue ar ir 。 )等具有
扩冠作用 3[] ,水飞蓟宾 ( :妙ib 。 )具有保肝作用等闭 ,因此引起了人们的广泛研究 .
1 实验材料和仪器
1
.
1 原料 香樟叶 ,取自江苏教育学院校园内 .
1
.
2 菌种 细菌 :金黄色葡萄球菌 ( S t叩勺产阮 co c us a uer us ) 、 大肠杆菌 ( & c he irC ih a co il ) 、 北京棒杆菌 ( oC 。 刀e bacet ir um eP ik ne 。 。 )
、
枯草芽抱杆菌 ( B ac 边 us s砧椒15) .
真菌 : 曲霉 ( A叩已嗜 il lsL sP . ) 、根霉 ( hR 众叩us sP . ) 、 青霉 ( eP n ic 沼iu m sP . )
上述菌种由江苏教育学院微生物实验室提供 .
1
.
3 培养基 牛肉膏蛋白陈培养基 (培养细菌用 ) : 牛肉膏 3 9 ,蛋白陈 10 9 , N ac l 5 9 ,琼脂 巧 一 209 ,水 l以叉〕耐 , P 7H . o 一 7 . 2 , 12 1℃
20m i n
.
马铃薯培养基 (简称 P DA ) (培养真菌用 ) : 马铃薯 2 0 9 ,葡萄糖 20 9 ,琼脂 巧 一 2雌 ,水 1。汉)耐 , P H 自然 , 121 ℃ 20 m .in
1
.
4 试剂 石油醚 (沸点 30 一 60 ℃ ) 、 95 % 乙醇 (沸点 97 ℃ ) 、 山梨酸钾 、 甲醇等试剂 ,均为分析纯 .
1
.
5 仪器 数显恒温水浴锅 H H石 (国华电器有限公司 ) ;索氏抽提器 ;电子天平 ; D一 1 型 自动蒸汽灭菌锅 (北京发恩科贸有限公
司 ) ; S PX 一150 C 型恒温恒湿箱 (上海博迅实验有限公司医疗设备厂 ) ;川X 一16 0 B 一Z 霉菌培养箱 (上海博迅实验有限公司医疗设备
厂 ) ; SW一CJ 一 lF 净化工作台 (苏净集团安泰公司 ) ;移液枪 ;打孔器 .
2 实验方法
2
.
1 黄酮类化合物的提取
2
.
1
.
1 方法 :索氏提取法
2
.
1
.
2 样品处理 :香樟叶洗干净之后 ,置于烘箱内烘干 ,干品研细成粉末 . 称取 109 ,置于索氏抽提器内用石油醚回流抽提 17 h ,
除脂 . 脱脂后用电子天平对用于提取的空容量瓶进行称重 (记作 W : ) ,脱脂后的样品再用 95 % 乙醇水浴 ( 10 ℃ )提取 1h2 ,得乙
醇提取液 ,挥干乙醇 ,得香樟叶黄酮类化合物的粗提取物 ,备用 ,连瓶称重 (记作 叭 ) ,计算得率 .
得率 ( % ) = (叭 一 w l ) /样品质量 xl o % .
2
.
2 黄酮类化合物定性实验 (显色反应 )[ 5 、 . ]
取部分提取物 ,用无水甲醇进行溶解 ,分别与 HCI 一镁粉 、 H CI 一 锌粉 、 1% F eC I , 一 乙醇液 、 2 % 从cl , 一 乙醇液 、 1% Na 0 H 进行
一 3 0 一
显色反应 ,在室内光线下和用紫外灯观察颜色变化 .
2
.
3 香樟叶黄酮类化合物提取物的抑菌作用的检测 v.[ ` 、 9]
2
.
3
.
1 黄酮类化合物抑制细菌的测定方法
抗菌性的研究方法一般包括体外抗菌实验和体内抗菌实验 (又称动物实验 ) . 体外实验常采用打孔法和滤纸片法 . 两种方法
均是通过抑菌圈的直径大小来衡量黄酮类化合物抗菌活性及细菌对黄酮类化合物的敏感程度 .
2
.
3
.
1
.
1 打孔法
活化细菌菌株 ,将活化的细菌接种于液体培养基中 37 ℃摇床 ( 170 : · m in 一 ’ )培养 2h4 ,在超净工作台上将熔化的细菌培养基
迅速倒平板 ,每个培养皿中倒人约 20 d ,待培养基冷却凝固后 ,用无菌移液枪吸取 10 己 菌液注人平板 ,用无菌三角棒涂布均匀 .
接着用灭过菌的打孔器在培养基上打孔 ,每皿打 3 个孔 (小孔直径为 8 m m ) . 用无菌水将粗提取物稀释为 10 % 的浓度 , 以相同浓
度的山梨酸钾作为阳性对照 . 无菌移液枪吸取 l o ilt 粗提取物稀释液 , 注人所打孔中 ,平板置于 37 ℃恒温箱中培养 , 24 h 后观察
有无抑菌圈 ,并测量抑菌圈直径 .
2
.
3
.
1
.
2 滤纸片法
活化细菌菌株 ,将活化的细菌接种于液体培养基中 37 ℃摇床 ( 170 : · 而 n 一 ’ )培养 24 h ,在超净工作台上将熔化的细菌培养基
迅速倒平板 ,每个培养皿中倒人约 20 耐 ,待培养基冷却凝固后 ,用无菌移液枪吸取 10 菌液注人平板 ,用无菌三角棒涂布均匀 .
接着用打孔器在滤纸上打孔 ,获得圆形滤纸片若干 (直径为 g m m ) . 取滤纸片蘸取粗提取物稀释液 ,每皿放置三个 ,每种样品做两
个平板 ,平板置于 37 ℃恒温箱中培养 , 2 h4 后观察有无抑菌圈 ,并测量抑菌圈直径 .
2
.
3
.
2 香樟叶黄酮类化合物提取物的抑制霉菌的测定方法
在超净工作台上 ,同无菌移液枪吸取 10 0u l提取物稀释液注人培养皿中 ,将熔化的马铃薯培养基迅速倒平板 ,在桌面上轻轻
摇晃培养皿是提取液与培养基混合均匀 ,待培养基冷却凝固后 ,用接种环挑取少量霉菌 ,三点接种于培养基上 ,每种菌每种提取
液做两皿 . 倒置于霉菌培养箱中恒温培养 7h2 ,然后观察各皿霉菌生长情况 ,并测量菌落直径 ,计算抑菌率 :
抑菌率 (% ) = ( 空白菌落直径 一 实验菌落直径 ) / 空白菌落直径 x l o %
结果与分析
黄酮类化合物定性实验结果
用索氏提取法提取所得提取物颜色呈透明棕褐色 ,有中药的甜香味 . (见图 1 和表 l)
表 1 香樟叶中黄酮类化合物的定性测定
显色剂 /条件 香樟叶提取物的显色结果 条件显色结果可能组分
日光 ( 自然光 )
U V / 3 6
r n m
M g 一 HC F热水浴
Z n 一 HCF 热水浴
1% F e C 13 一 乙醇 / 日光
2% 川 1C 3 一 乙醇 / 日光
2% AI C13 一 乙醇 / U V
1% Na 0 H/ 日光
l % N
a 0 H / U V
淡黄色
淡蓝紫色荧光
呈现红色 (晶亮 )
呈现红色
深绿色
黄绿色
黄绿色荧光
黄色
绿色荧光
黄酮类 , 黄酮醇类
黄酮类 ,黄酮醇类 ,双氢黄酮类
黄酮类 , 黄酮醇类 ,双氢黄酮醇类
黄酮类 , 黄酮醇类 ,双氢黄酮醇类
黄酮类 ,黄酮醇类 ( 3 , 5 一 二经基衍生物 )
3
,
5 一二经基黄酮类
3
,
5 一 二经基黄酮类
黄酮类 ,黄酮醇类
黄酮 ,黄酮醇 , 双氢黄酮 、异黄酮 ,查耳酮
注 :在空 白组中 , 除了 1% eF 1C 3 一 乙醉溶液为橘黄色外 , 其余的 实验试剂均为无色 .
一 3 1
D
.
1%a N O印 日光E .Mg 一H CF 热水浴F .Z n一HF C热水浴
图 1香樟叶中黄酮类化合物的定性实验结果
3
.
2黄酮类化合物得率
表 2香樟叶提取物得率统计表
样品重量 样品重 空瓶重
W 1
实验后重
W 2
△W 得率 %
香樟叶 13 3 0 9 9.0 9. 9 9
分析: 由表3 中显示得率偏高 .在索氏提取过程中 ,有空气中的水蒸气进人抽提器中 ,故而最终所得提取物混有少量水 , 而
分离又很困难 ,考虑到分离会导致提取物损失 ,故而没有进行分离 ,因此提取物得率偏高 ,本次试验所得提取物可称为黄酮类化
合物的粗提取物 , 由于实验条件简陋 ,提取物中还含有其他一些物质 .
3
.
3 香樟叶黄酮类化合物提取液对细菌抑制作用的研究结果
本实验采用滤纸片法测定香樟叶黄酮类化合物提取液对细菌的抑菌作用 .
表 3 香樟叶提取液对细菌的抑制效果
抑菌圈直径 ( ~ )
北京棒杆菌 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 枯草芽抱杆菌
提取液液浓度 ( 10 % )
注 : 山梨酸钾对表中四种细 菌均无抑制作用 .
A
.
Co卿 e b a e t e ir u m P e k in e n s e B . St a Ph y l oc oc e u s a uer u s C . E s e h e ir e hi a e iol D . B ac i l u s s ub t iil s
图 2 香樟叶提取液对细菌的抑制作用
图 2 分别显示了香樟叶提取物在不同平皿培养基上对北京棒杆菌、 金黄色葡萄球菌 、 大肠杆菌 、 枯草芽抱杆菌产生的抑菌
圈 . 表 3 列出了浓度为 10 % 的提取液对 4 种细菌的抑制作用 . 香樟叶提取物对以上四种细菌均有一定抑菌作用 ,且对不同细菌
抑制作用有差异 , 既能抑制球菌 ,亦能抑制杆菌 ;既对革兰氏阳性菌有抑制作用 ,也对革兰氏阴性菌有抑制作用 ,其中对大肠杆
菌 ( sE ch ier ch ia co il) 的抑制作用最为明显 ,说明香樟叶提取物对细菌的抑制作用具有广谱性 . 食品加工中常用的防腐剂山梨酸钾
作为对照 ,对四细菌种均无明显的抑制作用 ,则更体现了香樟叶提取物抑菌作用的独特 .
3
.
4 香樟叶黄酮类化合物提取液对霉菌抑制作用的研究结果
表 4 香樟叶提取液对霉菌的抑制作用
曲霉 青霉 根霉
空白 33 17 3 8
香樟叶提取物 (浓度 1 0% ) 2 6 13 22
抑菌率% 2 1 . 2 2 3 . 5 42 . 1
注 :表中数字为菌落直径 ( m m )
一 3 2 一
4 讨论
黄酮类化合物的抑菌机制目前还不是很清楚 : G fo du ( 19 9 )指出 ,酚类通过破坏细胞壁及细胞膜的完整性 , 导致微生物细胞
释放胞内成分 , 引起膜的电子传递 、营养吸收 、核昔酸合成及 A仰 活性等功能障碍 ,从而抑制微生物的生长 . 段彩霞等 ( 19 9 )则
认为 ,酚类化合物及衍生物一般呈弱酸性 p H 二 6 , 能使蛋白质凝固或变性 ,故有杀菌或抑菌作用 〔’ ” 〕 . 黄酮类化合物的化学结构属
酚类衍生物 , 也具上述特征 ,从而表现一定的抑菌功能 . 如苦参对革兰氏阳性菌有明显的抗菌作用 ,认为异戊二烯黄烷酮衍生物
是其具有抗菌活性的成分 .
近年研究也证实了某些黄酮类化合物在体外抑菌实验中表现出一定的抑菌功能 . 潘铃 ( 19 91 )用琼脂扩散法测定绿茶黄酮
等对大肠杆菌 、 沙门氏菌 、 变形杆菌 、金黄色葡萄球菌等有抑制作用 . 熊大胜 ( 20 0 )用显齿蛇葡萄幼嫩茎叶中提取的有效成分进
行真菌和细菌的抑制作用的研究表明 ,提取物对枯草杆菌 ,金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用 , 对青霉 、 黄曲霉 、 黑曲霉有较弱
的抑制作用〔’ 0 }. 香樟叶提取物对本项实验所用 7种菌的抑菌效应在食品工业上具有一定的意义 ,它对常见的污染食品的微生物
曲霉 、 青霉、 根霉 、大肠杆菌 、 北京棒杆菌 、 枯草芽抱杆菌和金黄色葡萄球菌均具有抑菌功效 ,可作为天然的防腐剂 ,在食品生产
加工中应用 ,这可为香樟的开发利用拓宽新途径 ,本项实验的结果则为此提供了科学依据 .
本项实验对香樟叶内的黄酮类化合物进行了定性的研究 ,取得了一定的成效 ,但存在一定不足之处 , 因条件和时间关系 ,提
取物不是很纯 ,未能选择更多的菌种作为供试菌 ,对黄酮类化合物的抑菌作用的了解有局限性 .
参 考 文 献
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拌 ir m e n t iw th 4 k in d s of ha e t ier a a n d 3 ki n ds of fu n ig as xe am p les , i t i s of u n d ht at th e e x t m c t h as an t i bac t ier al ac t ivi ty an d th e re i s a d os e ~ e fe e t rel at i o n s hiP ,
an d t o d ife 民n t b ac t e ir a th e an t ib ac t e ir al e任民 t d i fe rs .
K ey w or ds cam
p h o侧od le a v e s
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n va o n o i d co 呷o u n d , exatr e t , b a e t e ir os at s i s e fe e t
(责任编辑 胡 明 )
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