全 文 ：　第 17卷　第 10期　　　　　　　　　医 学研 究 生学 报　　　　　　　　　Vol.17　No.10
　2004年 10月　　　　　　　　Journal of Medical Postgraduates　　　　　　　　　Oct.2004
·论　　著·
苦瓜子抗人免疫缺陷病毒蛋白 30的分离纯化及其
切割超螺旋 DNA的活性研究
王临旭 , 　孙永涛 , 　杨为松 , 　白雪帆 , 　黄长形 , 　王福祥
(第四军医大学唐都医院解放军感染病诊疗中心 , 陕西西安 710038)
摘要 :　目的:分离纯化苦瓜子抗人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白 30(MAP30)并对其切割超螺旋 DNA 的活性作初步
分析。 　方法:采用离子交换层析及凝胶过滤层析等方法从苦瓜子中分离纯化 MAP30 , 并经 SDS-PAGE、Western
blots 等鉴定 , 将质粒 pUC18 与不同浓度 MAP30 孵育 ,进行琼脂糖电泳分析其切割 DNA 的活性 。 　结果:得到相
对分子质量为 30 000的目的蛋白 MAP30 , 证实其具有使超螺旋 DNA 断裂为缺口环状及线状 DNA 的活性。 　结
论:MAP30 对 DNA(RNA)的切割作用可能是其发挥生物学效应的主要机制之一。
关键词 :　植物蛋白;　分离纯化;　超螺旋 DNA
中图分类号:　Q946.1　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1008-8199(2004)
Isolation and purification of plant protein MAP30 and its
DNA-cleaving activity on supercoiled DNA
WANG Lin-xu ,SUN Yong-tao ,YANG Wei-song ,BAI Xue-fan ,HUANG Chang-xing ,WANG Fu-xiang
(Center of Diagnosis and Treatment for In fect ious Diseases of PLA , Tangdu Hospi tal , the Fourth
Military Medical University , Xi an 710038 , Shaanx i , China )
Abstract:　Objective:To isolate and purify plant protein MAP30 (momordica anti-HIV protein of
30000)f rom the seeds of Momordica charantia and observe its DNA-cleaving activity on supercoiled
DNA.　Methods:MAP30 w as purified and identified wi th ion exchange chromatography , gel perme-
ation chromatog raphy , SDS-PAGE and Western blots.The DNA-cleaving activity w as analyzed by
electrophoresis in 1% agarose af ter Supercoiled plasmid pUC18 as subst rate t reated wi th MAP30 of
v arious concentrations.　Results:A single band w ith a molecular mass corresponding to 30 000 was
obtained fo r MAP30.The conversion of Supercoiled plasmid pUC18 to relaxed (nicked)and linear
forms w as demonstrated.　Conclusion :MAP30 is a 30 000 plant protein.The DNA-cleaving activity
may play a key role in the mechanism of it s biological ef fects
Key words:　Plant protein;　Isolation and purification　Supercoiled circuler DNA
0　引　　言
　　苦瓜子抗人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白 30(mo-
mordica anti-HIV protein of 30 000 , MAP30)是 20
世纪 90年代由美国科学家 Lee-Huang 等[ 1] 从葫芦
科植物苦瓜种子中提取的一种植物蛋白。苦瓜是原
产于我国的一年生攀藤草本植物 ,自古时起就已将
其作为药用 ,具有“清暑涤热 ,明目解毒”等功效 。这
种从苦瓜子中提取的 MAP30 是相对分子质量为
30 000的单链蛋白 ,具有抗病毒 、抗肿瘤等多种生物
·865·
收稿日期:　2004-03-17;　修订日期:　2004-04-03
作者简介:　王临旭(1969-),女 ,山西太原人 ,主治医师 ,医学博士 ,从事传染病学 、分子病毒学研究。
通讯作者:　孙永涛(1963-),湖北沙市人 ,教授 ,博士生导师 ,从事感染病专业及 AIDS防治研究。
DOI :10.16571/j.cnki.1008-8199.2004.10.001
学活性 ,尤其对 HIV 有显著抑制作用 ,不仅可抑制
T 淋巴细胞内的 HIV 复制 ,而且对单核/巨噬细胞
内的 HIV 也有抑制作用;而对正常细胞却无明显毒
性。同时它具有不易产生耐药性 、成本低廉等优点 ,
为艾滋病的治疗带来了新的希望。本研究分离纯化
了MAP30 ,并对其切割 DNA 的活性作了初步研究 。
1　材料和方法
1.1　主要试剂及仪器　特选长白苦瓜子 ,购于陕西
汉中汉台区农技推广中心 ,层析介质 Sepharose CL-
6B 、Sephadex G-75 购自 Pharmacia , CM-52 购自
Whatman ,MAP30 鼠源抗体由 Sy lvia Lee-Huang 博
士惠赠 ,HRP 标记羊抗鼠抗体购自华美公司;Bio-
Rad低压液相层析系统及 Mini-Protean 电泳仪 、电
转移装置 ,SPECORD 40型紫外分光光度仪等。
1.2　实验方法
1.2.1　MAP30的分离纯化　主要采用离子交换层
析及凝胶过滤层析等方法进行分离纯化。按文献
[ 1]将 50 g 苦瓜子去皮 、粉碎 ,悬浮于冷等渗盐水
中 ,冷冻离心 ,取上清液 ,调 pH 至 4.0 ,离心过滤得
粗提液 ,经硫酸铵沉淀 、透析后 ,依次进行 Sepharose
CL-6B 、Sephadex G-75 及 CM-52 柱层析 ,经梯度洗
脱 ,收集第 2峰即得 MAP30 。
1.2.2　MAP30纯度的鉴定　紫外分光光度仪测定
其吸收峰及浓度 ,蛋白质浓度(mg/ml)=1.5(A 280–
0.75 × A260;SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-
PAGE)法(180 V ,1.5 h)鉴定相对分子质量大小及
纯度 ,分别将粗提液及各层析柱的收集液上样进行
分析;western-blot 法鉴定其抗原性 ,将 SDS-PAGE
凝胶电转移至硝酸纤维素膜上(0.2 A ,2 h),剪下低
分子质量标准蛋白质(marker)进行氨基黑染色 ,其
余膜用 30 g/L BSA 封固 0.5 h ,加入 MAP30 鼠源
抗体 ,37℃孵育 1.5 h ,再加入 HRP 标记羊抗鼠抗
体 ,37℃孵育 1.5 h ,DAB显色。
1.2.3　MAP30 对超螺旋 DNA 的切割作用 　在
Mg
2+缓冲体系(10 mmol/L Tris HCl pH 7.5 , 50
mmol/L NaCl , 5 mmol/ L M gC12 , 1 mmol/L DT T)
及锰离子(Mn2+)缓冲体系(20 mmol/L Hepes pH
7.5 , 5 mmol/L M nC12 , 1 mmol/ L DTT)中 ,以 180
ng 质粒 pUC18 作为底物 , 分别加入不同浓度
MAP30(1.2 μg 、2.4 μg 和 3.6 μg),反应体系共 10
μ1 ,经37℃孵育 1 h ,进行 1%琼脂糖凝胶电泳分析 。
2　结　　果
2.1　紫外分光光度仪分析结果　经紫外光谱测定
表明 ,在 278 nm 处有一蛋白吸收峰 ,蛋白质平均浓
度为 0.47 mg/ml ,产率为 0.9‰ 。
2.2　SDS-PAGE 结果　最终所得的 MAP30 为单
一条带 ,相对分子质量为 30 000 ,见图 1 。
图 1　MAP30 的凝胶电泳图
Figure 1　SDS-PAGE of MAP30
　　 1:低分子质量标准;　2:粗提液;　 3:上层析柱前;　 4:
S epharose C L-6B柱收集液;　5:S ephadex G-75 柱收集液;　6:
MAP30(CM-52柱收集液)
2.3　Western-blo t 结果 　经 Western-blot 分析表
明 ,MAP 30与其抗体结合产生一条色带 ,证明了其
在免疫学上的特异性。
2.4　MAP30对超螺旋 DNA 的切割作用　将不同
浓度 MAP30 与质粒 DNA 作用后 , 可见随着
MAP30量的增加 ,超螺旋 DNA 逐渐减少 ,缺口环状
DNA递增 ,并进一步产生线状 DNA 。MAP30在含
Mg
2+ 、Mn2+的两种缓冲体系中均有上述活性 ,见图
2。
图 2　MAP 30 对质粒 pUC18切割作用的琼脂糖电泳图
Figure 2　DNA-cleaving activity on pUC18 of MAP30
　　R:缺口环状 DNA;　L:线状 DNA;　S:超螺旋 DNA;　1～ 4:
Mg2+缓冲体系(MAP30分别为 0μg 、1.2μg 、2.4μg 和 3.6μg);
　5～ 8:Mn2+缓冲体系(MAP30分别为 0μg 、1.2μg、2.4μg 和
3.6μg)
3　讨　　论
　　MAP30 属于单链核糖体失活蛋白(ribosome-
inactivating proteins , RIP)家族[ 2] ,此类蛋白普遍存
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在于高等植物中 ,因可作用于真核细胞核糖体使之
失活而得名。我国对单链 RIP 天花粉蛋白(TCS)的
大量研究表明 ,此类蛋白具有中期引产 、抗早孕 、抗
肿瘤及免疫调节等多种生物学活性[ 3] 。1989年 ,美
国将 TCS用于抗 HIV 的研究 ,并发现 TCS 可抑制
HIV 的复制[ 4] 。临床应用也表明 , TCS 可减轻艾滋
病患者症状 ,使 CD4+淋巴细胞计数上升等 。这些
发现引起了国内外学者对此类蛋白质的极大兴趣 。
目前 ,已从苦瓜子中提取了α、β 、γ-苦瓜子蛋白(α、β 、
γ-MMC)及 MAP30等四种 RIP。MAP30分子与α-
MMC及 TCS 分别有 48%及 60%的序列同源性 。
研究表明 ,这四种从苦瓜子中提取的 RIP 仅 MAP30
及α-MMC 具有抗 HIV 活性。α-MMC 只对急性感
染期 T 细胞中的 HIV-1有抑制作用 ,而 MAP30 不
仅可抑制急性 、慢性感染期 T 细胞中 HIV 复制 ,而
且对单核/巨噬细胞内的 HIV 也有抑制作用 ,并具
有比 TCS更高效 、安全的抗 HIV 活性。此外 ,它对
单纯疱疹病毒也有抑制作用 ,还可抑制中枢神经系
统肿瘤等九种人肿瘤细胞系的增殖[ 5] 。
　　有关 MAP30抗病毒 、抗肿瘤的作用机制尚有
待深入研究 。本实验证实 MAP30 具有使超螺旋
DNA 断裂为缺口环状及线状 DNA 的活性 , 在
Mg2+、Mn2+存在时均有上述活性 。Wang 等[ 6] 对
MAP30的 NMR波谱分析表明 , MAP30具有 DNA
(RNA)糖苷酶/脱嘌呤裂解酶的活性 , 它可识别
DNA(RNA)分子特定的空间构象 ,使 DNA(RNA)
分子脱嘌呤并发生磷酸二酯键断裂 , 而 Mg2+ 、
Mn2+等可促进 MAP 30与 DNA底物的结合。故除
了MAP30 可选择性进入病毒感染细胞及肿瘤细
胞 ,非特异地使核糖体失活而干扰宿主细胞蛋白质
合成之外 ,它还可直接作用于病毒 DNA(RNA)及变
异的肿瘤细胞 DNA 本身 ,使之空间拓扑构象不可
逆性失活 ,从而丧失复制 、转录功能。这种对 DNA
(RNA)的切割作用可能是 MAP30发挥生物学效应
的主要机制之一。
参考文献:
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(责任编辑:李风华;　英文编辑:朱维铭)
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