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总酚含量及多酚氧化酶活性与岩黄连
愈伤组织褐化的相关性研究
岑忠用 苏 江 邓晰朝 谢彦军
( 河池学院化学与生物工程学院，546300，广西宜州 )
摘 要 以未褐化的岩黄连愈伤组织为材料，于培养基中添加不同浓度的抗坏血酸，研究抗坏血酸对岩黄连愈
伤组织褐化及总酚含量和多酚氧化酶活性的影响。结果表明：在培养第 20 天，各处理岩黄连愈伤组织的褐化
率均低于对照；各处理的多酚氧化酶活性均高于对照，其中抗坏血酸浓度 175mg/L 的处理多酚氧化酶活性最高，
为 14.1400U/(g·min)，比对照高 72.3%；各处理的总酚含量均低于对照，抗坏血酸浓度为 175mg/L 的处理总酚
含量最低，为 0.4633µg/mL，比对照低 88.3%。相关性分析结果表明，岩黄连愈伤组织褐变率与总酚含量呈正
相关，与多酚氧化酶活性呈负相关；而岩黄连愈伤组织多酚氧化酶活性和总酚含量呈极显著负相关。
关键词 岩黄连；愈伤组织；褐化；总酚；多酚氧化酶
岩黄连（Corydalis saxicola）是一种珍贵的中
草药，长期以来由于大量采挖和收购，导致岩黄
连野生资源日益匮乏 [1]。因此，如何保护岩黄连
野生资源，加快岩黄连药源生产，促进其相关产
业可持续发展已迫在眉睫。利用组织培养技术，
进行工厂化育苗，被认为是解决岩黄连快速繁殖
的重要途径 [2]。在岩黄连的组织培养过程中，其
愈伤组织的诱导和产生是一个重要的阶段，但研
究发现在岩黄连愈伤组织培养过程中常发生严重
的褐变现象，严重阻碍岩黄连愈伤组织的生长和分
化，甚至导致其死亡。研究认为褐变发生的原因与
外植体、继代的愈伤组织中所含酚类化合物的多少
和多酚氧化酶（PPO）活性有直接关系 [3-7]。郑超
等 [8] 在研究曼地亚红豆杉的组织培养时发现其愈
伤组织褐化程度与总酚含量呈显著正相关 , 而总酚
含量与 PPO 活性则呈负相关。戴勤等 [9] 在擎天树
的组织培养研究中发现其外植体总酚含量和褐变
程度呈显著的正相关 , 赵滢等 [10] 在研究蝴蝶兰组
织培养过程中发现总酚含量与 PPO 活性呈正相关。
郑颖等 [11] 研究表明台湾桤木外植体褐变与总酚含
量呈正相关。
目前，关于岩黄连愈伤组织的褐化与 PPO 活
性和总酚含量的关系的研究尚未见报道。本研究
以抗坏血酸为抗氧化剂，研究不同浓度的抗坏血
酸对岩黄连愈伤组织褐化、总酚含量和 PPO 活性
的影响，拟通过抗氧化剂抗坏血酸减缓岩黄连愈
伤组织褐化，为解决其组织培养过程的褐化问题
提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验所用的岩黄连愈伤组织由河池学院植物
组织培养实验室提供。
1.2 试验设计
试 验 于 2014 年 进 行。 以 配 方 1/2 MS+TDZ
0.4mg/L+NAA 0.2mg/L+BA 0.1mg/L 为 培 养 基， 分
别 以 75、125、175 和 225mg/L 的 抗 坏 血 酸 添 加
于培养基中，以不添加抗坏血酸的培养基为对
照。以下各处理分别以对照、75mg/L、125mg/L、
175mg/L 和 225mg/L 表示。挑选生长状况一致且未
褐化的岩黄连愈伤组织接种到不同抗坏血酸浓度
培养基及对照培养基上。每个处理接种岩黄连愈
伤组织 30 瓶，每瓶接种愈伤组织 5～8 团（直径
2～5mm），于 25℃条件下进行弱光培养。
1.3 测定项目与方法
于培养后 20d 统计各处理愈伤组织的褐化率，
作者简介：岑忠用，副教授，主要从事植物组织培养及植物生理
生化研究工作
基金项目：广西教育厅科研项目（200911MS221）；河池学院引进
人才科研启动费项目（2010QS-N008）；广西高校重
点实验室桂西北特色资源研究与开发实验室资助项目
（桂教科研 [2006]6 号）
收稿日期：2015-11-04；修回日期：2015-12-30
作物杂志 Crops 2016（1）：149-153 DOI：10.16035/j.issn.1001-7283.2016.01.028
150 作物杂志 Crops 2016 年第 1 期
并测定总酚含量和 PPO 活性。
愈伤组织褐化率统计：凡褐化部分在 25% 以
上的愈伤组织即为已发生褐化 , 褐化率（%）= 褐
化愈伤组织数 / 接种愈伤组织数 ×100。
总酚的提取和测定：总酚的提取参照蔡文国 [12]
的方法并稍作改进。取新鲜岩黄连愈伤组织 5.0g，
加入 50.0mL 95% 的乙醇于功率为 100W 超声提取
仪中提取 2.0h，过滤于 100mL 容量瓶中，定容备
用。总酚含量采用福林酚法测定 [13-14]，取提取液
0.5mL，加入 2.0mL 20% 的 Na2CO3 缓冲液，1.5mL
Folin-Cioealteu 显色剂，蒸馏水定容到 50.0mL。在
55℃水浴锅中保温 1.5h，于波长为 760nm 处测定
吸光度。
PPO 的提取和活性测定参照黄树苹等 [15] 的方
法并稍作改进。取新鲜岩黄连愈伤组织 1.0g，放入
研钵，加 5mL pH 为 6.8 的 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液，
冰浴研磨成匀浆后，于冷冻离心机 4℃ 10 000r/min
离心 15min，取上清液备用。测定时取 pH 为 6.8
的 0.1mol/L Tris-HCl 缓 冲 液 3mL， 加 0.1mol/L 邻
苯二酚 1.0mL，酶提取液 0.2mL，混匀，于 25℃水
浴 10min 后立即在 410nm 处测定 OD 值，取 0.2mL
蒸馏水代替酶提取液作空白对照。以每分钟 OD410
变化 0.01 为一个 PPO 活性单位（U），按下式计算
PPO 活性：
PPO活性［U/（g·min）］＝△OD410×Ｖ Ｔ/W×
VS×0.01×t
式中：△OD410 为反应时间内吸光度的变化，
W（g）为样品鲜重，t（min）为反应时间，VT（mL）
为提取酶液总体积，VS（mL）为测定时取用酶液
体积。
1.4 数据处理
以 Excel 2003 和 SPSS 19.0 软件进行数据处理
和统计分析。
2 结果与分析
2.1 抗坏血酸对岩黄连愈伤组织 PPO 活性的影响
由表 1 可知，不同浓度抗坏血酸对岩黄连愈
伤组织 PPO 活性具有不同程度的影响，且添加
抗坏血酸处理的 PPO 活性均高于对照，其中抗
坏血酸浓度 175mg/L 的处理其 PPO 活性最高，为
14.1400U/(g·min)，比对照高 72.3%；而抗坏血酸
浓度为 75、125 和 225mg/L 的处理其 PPO 活性分
别比对照高 30.6%、45.2% 和 56.8%。通过对数据
进行方差分析，结果表明，抗坏血酸对岩黄连愈
伤组织 PPO 活性的影响差异极显著（P ＜ 0.01）。
以 LSD 法进行多重比较结果 ( 表 2）显示，添加不
表 1 不同处理对岩黄连愈伤组织 PPO 活性的影响
Table 1 The effects of different treatments on the activity of PPO of Corydalis saxicola bunting callus U/(g·min)
处理
Treatment
均值
Mean value
标准差
Standard deviation
标准误
Standard error
均值的 95% 置信区间 95% Confidence interval of mean 极小值
Minimum
极大值
Maximum下限 Lower bound 上限 Upper bound
对照（CK） 3.9233 0.11930 0.06888 3.6270 4.2197 3.79 4.02
75mg/L 5.6500 0.26514 0.15308 4.9914 6.3086 5.39 5.92
125mg/L 7.1633 0.19655 0.11348 6.6751 7.6516 6.94 7.31
175mg/L 14.1400 0.25239 0.14572 13.5130 14.7670 13.85 14.31
225mg/L 9.0900 0.20421 0.11790 8.5827 9.5973 8.86 9.25
表 2 不同处理岩黄连愈伤组织 PPO 活性的多重比较
Table 2 Multi-comparisons of the activity
of PPO of Corydalis saxicola bunting callus
of different treatments U/(g·min)
处理
Treatment
重复 Repetition 平均
AverageⅠ Ⅱ Ⅲ
对照（CK） 3.79 4.02 3.96 3.9233E
75mg/L 5.92 5.39 5.64 5.6500D
125mg/L 7.24 6.94 7.31 7.1633C
175mg/L 14.31 13.85 14.26 14.1400A
225mg/L 9.25 8.86 9.16 9.0900B
注：处理间字母不同表示差异达极显著水平（P ＜ 0.01）
Note：Different letters in the same column between treatments indicate
significant difference at 0.01 level,the same below
同浓度抗坏血酸的处理 PPO 活性与对照的差异均
极显著，而添加不同浓度抗坏血酸的处理间 PPO
活性的差异也极显著。
2.2 抗坏血酸对岩黄连愈伤组织总酚含量的影响
表 3 表明，添加不同浓度抗坏血酸的 4 个处理
中，175mg/L 处理总酚含量最低，为 0.4633μg/mL；
抗坏血酸浓度为 75、125 和 225mg/L 的处理总酚
含量也均低于对照的总酚含量，分别比对照低
27.5%、40.8% 和 65.2%。
利用 SPSS 19.0 数据处理软件进行方差分析，
结果表明抗坏血酸对岩黄连愈伤组织总酚含量的
151总第 170 期
表 3 不同处理岩黄连愈伤组织的总酚含量
Table 3 Total phenolic content of Corydalis saxicola bunting callus of different treatments µg/mL
表 4 不同处理岩黄连愈伤组织总酚含量的多重比较
Table 4 Multi-comparisons of total phenolic
content of Corydalis saxicola bunting callus
of different treatments μg/mL
处理
Treatment
重复 Repetition 平均
AverageⅠ Ⅱ Ⅲ
对照（CK） 3.24 3.75 3.86 3.62A
75mg/L 2.46 2.65 2.76 2.62B
125mg/L 2.05 2.16 2.21 2.14C
175mg/L 0.38 0.52 0.49 0.46E
225mg/L 1.18 1.36 1.24 1.26D
表 5 不同处理对岩黄连愈伤组织褐化的影响
Table 5 Effects of different treatments on Corydalis
saxicola bunting callus browning
处理
Treatment
接种愈伤组织数
Inoculated callus
number
褐化愈伤组织数
Number of
brown callus
褐化率
Browning
rate(%)
对照（CK） 111 84 75.68
75mg/L 117 31 27.35
125mg/L 112 26 23.21
175mg/L 115 21 18.26
225mg/L 119 25 21.01
表 6 岩黄连愈伤组织褐变率、PPO 活性和总酚含量的相关性
Table 6 Correlation between browning rate,ppo activity and total phenols content of Corydalis saxicola bunting callus
项目 Items 褐变率 Browning rate PPO 活性 PPO activity 总酚含量 Total phenols content
褐变率 Browning rate 相关性 Pearson 1 -0.654 0.786
显著性（双侧）Sig.(2-tailed) 0.231 0.115
N 5 5 5
PPO 活性 PPO activity 相关性 Pearson -0.654 1 -0.963**
显著性（双侧）Sig.(2-tailed) 0.231 0.009
N 5 5 5
总酚含量 Total phenols content 相关性 Pearson 0.786 -0.963** 1
显著性（双侧）Sig.(2-tailed) 0.115 0.009
N 5 5 5
注：** 表示在 0.01 水平（双侧）上显著相关
Note：**Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed)
处理
Treatment
均值
Mean value
标准差
Standard deviation
标准误
Standard error
均值的 95% 置信区间 95% Confidence interval of mean 极小值
Minimum
极大值
Maximum下限 Lower bound 上限 Upper bound
对照（CK） 3.6167 0.33081 0.19099 2.7949 4.4384 3.24 3.86
75mg/L 2.6233 0.15177 0.08762 2.2463 3.0003 2.46 2.76
125mg/L 2.1400 0.08185 0.04726 1.9367 2.3433 2.05 2.21
175mg/L 0.4633 0.07371 0.04256 0.2802 0.6464 0.38 0.52
225mg/L 1.2600 0.09165 0.05292 1.0323 1.4877 1.18 1.36
2.3 抗坏血酸对岩黄连愈伤组织褐化的影响
由表 5 可知，培养 20d 后对照的褐化率最高，
为 75.68%，可见其大部分愈伤组织已经发生了褐
化；而添加抗坏血酸的各处理褐化率明显低于对照
且均低于 30%，说明抗坏血酸能有效减缓岩黄连
2.4 岩黄连愈伤组织褐化率、PPO 活性和总酚
含量的相关性分析
利用 SPSS 19.0 数据处理软件进行相关性分
析，结果（表 6）表明，岩黄连愈伤组织褐变率
与总酚含量呈正相关且相关度最高，相关系数为
0.786；褐变率与 PPO 活性呈负相关，相关系数
为 -0.654；PPO 活性和总酚含量呈极显著负相关，
影响差异极显著。以 LSD 法进行多重比较结果 ( 表
4）显示，添加不同浓度抗坏血酸的处理总酚含量
与对照的差异均极显著，而添加不同浓度抗坏血
酸的处理间总酚含量的差异也极显著。
愈伤组织的褐化，其中浓度为 175mg/L 的处理减
缓效果最好，其褐化率最低，为 18.26%。
相关系数为 -0.963。
3 讨论
抗坏血酸是一种常见的抗氧化剂，在植物体
内直接参与活性氧的清除，并可通过抗坏血酸 -
谷胱甘肽循环清除过氧化氢，从而保护植物有机
体及其正常代谢，防止氧化胁迫造成的伤害 [16-17]。
因此，在植物组织培养中抗坏血酸常被用于减缓
岑忠用等：总酚含量及多酚氧化酶活性与岩黄连愈伤组织褐化的相关性研究
152 作物杂志 Crops 2016 年第 1 期
外植体及愈伤组织等的褐化问题。郑超等 [8] 研究
表明抗坏血酸处理红豆杉愈伤组织，能有效抑制
总酚的积累，降低愈伤组织褐化程度。常云霞等 [18]
研究表明抗坏血酸能降低大豆愈伤组织膜脂过氧
化伤害程度，从而缓解盐胁迫对愈伤组织生长的
抑制。赖艳艳等 [19] 研究发现用抗坏血酸浸泡蝴
蝶兰叶片外植体能降低其在离体培养过程中的褐
变率。
本研究以 1/2 MS+TDZ 0.4mg/L+NAA 0.2mg/L+
BA 0.1mg/L 为培养基，分别添加浓度为 75、125、
175 和 225mg/L 的抗坏血酸，结果表明，添加抗坏
血酸的处理岩黄连愈伤组织 PPO 活性均高于对照，
分别比对照提高 30.6%、45.2%、72.3% 和 56.8%；
而添加抗坏血酸的处理总酚含量均低于对照，分
别 比 对 照 降 低 27.5%、40.8%、87.2% 和 65.2%，
研究结果与郑超等 [8] 的研究结果具有一定的相似
性。说明添加抗坏血酸有利于提高岩黄连愈伤组
织的 PPO 活性，同时能抑制其总酚的形成和积
累。此外，添加抗坏血酸的各处理岩黄连愈伤组
织的褐化率明显低于对照，且随着抗坏血酸浓度
的增加，褐化率总体呈下降趋势，笔者认为这可
能是由于总酚的形成受到抑制，从而减少了醌类
物质的形成，降低了其褐化的程度。从本研究结
果看，随着抗坏血酸浓度的增加，PPO 活性总体
呈上升趋势，总酚含量和褐化率呈下降趋势，但
当抗坏血酸浓度增加至 225mg/L 时，其 PPO 活性
低于 175mg/L 处理的，而总酚含量和褐化率高于
175mg/L 处理的，这可能由于当抗坏血酸浓度相对
比较低时，其主要表现抗氧化作用，当抗坏血酸
浓度比较高时部分抗坏血酸与某些氨基酸发生反
应生成棕色的物质 [20]，从而增加岩黄连愈伤组织
褐化的程度；愈伤组织的褐化会导致细胞的损伤和
死亡，这势必会降低 PPO 活性。
相关性分析结果表明，岩黄连愈伤组织褐化
率与总酚含量呈正相关，与 PPO 活性呈负相关，
这也说明褐化率越高其细胞衰老和死亡越严重，
从而 PPO 活性越低；而岩黄连愈伤组织 PPO 活性
和总酚含量呈极显著负相关。结合总酚含量，对
照的总酚含量最高，其岩黄连愈伤组织的褐化率
也最高，而添加抗坏血酸的各处理总酚含量都低
于对照，岩黄连愈伤组织的褐化率也比对照低，
这与相关性分析结果相符合。
本研究通过在培养基中添加抗氧化剂抗坏血
酸以减缓岩黄连愈伤组织的褐化，首次研究了抗
坏血酸对岩黄连愈伤组织褐化及其相关物质的影
响，综合研究结果，认为通过抗坏血酸抑制岩黄
连愈伤组织的褐化是可行的。本研究中，添加抗
坏血酸浓度为 175mg/L 时效果最好。
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153总第 170 期
Study on Total Phenolic Content and Correlation
between PPO Activity and Browning of Corydalis
saxicola Bunting Callus
Cen Zhongyong,Su Jiang,Deng Xichao,Xie Yanjun
(School of Chemistry and Biological Engineering,Hechi University,Yizhou 546300,Guangxi,China)
Abstract With non-browned callus of Corydalis saxicola as materials, the effects of different concentrations of
ascorbic acid on browning of Corydalis saxicola callus, total phenolic content and PPO activity were studied by
adding them to culture medium in this experiment. The results showed that the browning rates of Corydalis saxicola
bunting callus under different ascorbic acid concentrations were lower than that of the control on the 20th day. While
the activities of PPO of all the treatments were higher than that of the control, the activity of PPO with concentration
of 175mg/L ascorbic acid was the highest with a value of 14.1400U/(g·min), 72.3% higher than the control. The
total phenolic contents of all the treatments were lower than that of the control, and the total phenolic content with
concentration of 175mg/L ascorbic acid was the lowest with a value of 0.4633μg/mL, 88.3% lower than the control.
The correlation analysis showed that the browning rate of callus was positively correlated with the content of total
phenols, and negatively correlated with the activity of PPO. The activity of PPO was much negatively correlated with
the total phenol content in the callus.
Key words Corydalis saxicola; Bunting callus; Browning; Total phenol; PPO
岑忠用等：总酚含量及多酚氧化酶活性与岩黄连愈伤组织褐化的相关性研究