全 文 ：司 . 幽 . 曰. . . . . . . . . . 一
第 ] 6 卷 第 3 期 生物化学与生物物理学报
1 9 84 年 5月 人 CT AB I OCH 工 M工 O A etB I O卫H Y习工0 人 日 IN I O人
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1 6, N o
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3
M a y
, 扮8盛
亮 一菌 _ 多 璐 的 研 r 究
L A T M忿组分的分离纯化及其性质
方积年 叶淳渠 吴淑云 刘玉荣 桂金珠
(中国科学院上海药物研究所)
段 文 陶
(江苏省镇江制药厂 )
, 摘 要
亮菌系担子菌 。 分离于腐烂柳木上 ,经子实体分离后 , 进行发酵培执 菌丝用热水抽提 、 乙
醇沉淀 、 去蛋白、 逆向流水透析 、 . D E A工纤维素柱层析两次 , 得到白色粉末 AT 岭。 衅M 3经超离心密度梯度分析 , 玻璃纤维纸电泳和 eS p h ad e x G 一20 0 柱层析 , 证明为单一均匀成分。
A T M 3 的比旋度为 〔“ 〕。 + 95 . 护 , 不含氮 , 分子量 14 5 , 0 0 。 用红外光谱法、 I H 核磁共振
和 ” C 核磁共振法证明其糖普键为 。 型 。 经纸层析及气相层析分析 , A TM 3 含压葡萄糖 , D -
半乳糖 , D 一 甘露糖 , 卜 、木糖和 卜 岩藻糖 , 其摩尔比为 。 . 8 6 : 0 . 3 0 : 3 . 91 : 1 . 0拍 . 8 50
A TM 3 进行过碘酸盐氧化及 S ln i比 降解 , 证明其结构中的主要连接键型为 a( 1” 6) , 并有
少量 “ ( 1` o3)
A T M 3 动物半体内肿瘤抑制率为 81 % 。 动物体内抑制率对 8一。为 26 · 6% : 对 H A o 为
3 7
.
7%
。
亮菌属假密环菌 〔通而“ 林比衬确忍。 `动 e sc 绷( S o OP . ex F明纽幻山。 是一种能发光的担
子菌 。 我国民间流传作为治疗急慢性肝炎及胆道疾患的中草药。 子实体经分离后发酵培
养 , 其醋溶性部分已经研究 , 确定为香豆素类化合物即 , 主要对胆囊炎有效 。 本工作系研
究亮菌水溶性部分多糖的分离纯化、 性质 、 结构及其生物学作用 。 经初步研究发现 , 亮菌
中含不 同成分的多糖 。 这些不同成分具有不 同的抗肿瘤作用及免疫促进作用 。 本文首先
报道亮菌中 A T M 3 组分的分离纯化及其性质 。
实 验 方 法
一 、 菌种和发酵
菌种系江苏省镇江制药厂于 19 69 年从该省丹徒县的枯死柳树中分离得到。 菌种经
斜面 2 o8 C 培养 , 然后相继接种于摇瓶 、 种子罐及发酵罐 , 于 28 扣即。 C 按常规发酵。
二 、 分离和纯化 ’
96 ~ 1 2 0 小时的发酵液经板框过滤 , 菌丝经水充分洗涤后 , 用 90 ` 10 ℃ 水在搅拌下
. . . ~ . . . ` . .一只- . .本文 1 98 2 年 8 月 生日收到。
8期 亮 菌 多 糖 的 研 究 L
提取 6小时 ,共 3 ’次 。 ` 离心去菌丝 , 上清液经薄膜浓缩至小体积 , 加 3~ 5倍工业 乙醇得到
沉淀。 沉淀用水溶解 , 时自来水逆相透析* 天 , 然后再对蒸馏水透析一天 , 未透析部分按
eS va g 法去蛋白 , 闭 , 去蛋白液加 3 倍乙醇沉淀 , 沉淀过滤 , 并经乙酸 丙酮 、 乙醚相继洗
涤 , 真空干燥 , 磨粉即得粗制品。 粗制品溶解于少量水后 , 在刃E A E 一 纤维素 (丑0 0矛型 )
柱上层析 , 然后相继用 H刃 , 0 . 01 皿 、 0 .肠万 , .0 1万 取H O O 3 展 层 , 最 后 用 0 . I N
N ao H 展层 , 流出液分部收集 , 水展层部分经硫酸一苯醚法阅 比色鉴定多糖部分。 合并多
糖反应阳性的高峰部分 , 减压浓缩 , 加 3 倍 乙醉沉淀。 沉淀再溶解于水中 , 进行 D E A E -
纤维素 (B刀子型 )柱层析 , 相继用 H :仪 D .肠卫 , 0 . 1万施翻B `Q , 展层 , 一流出液分部收集。
取 0 . 05 万 N如B ,O : 展层液的多糖高峰部分 , 合并 , 然后对蒸馏水透析二天 , 减压浓缩 , 加
3 倍乙醇沉淀 , 沉淀经乙醇 、 丙酮和乙醚相继洗涤后 , 真空干燥即得白色粉末 A T M 3 。
三 、 理化性质 一
(l) 超知公分析
,
A T M 3 溶解于水 , 浓度为 1界。 于 m 七a o h i U O A ` 1人型离心机
上进行密度梯度离心 , 操作温度为 12 . 4℃ 。 达到全速 砧 ,4 O3 r Pm 后 , 在动、 右0 、 7久 8久
9 0 和 1 0 0 分钟分别照相 。 _ · - -
(s) 破璃纤维纸 电泳 A T M 3 溶解于水后 , 一 点样于玻璃纤 维纸W h a 七~ G F / B上 , 电泳缓冲液 为 p H g . 3 硼砂缓 冲液 0[ , 0肠万 砚砂 :’0 . I N N a o 且 _( lO : 1y / V )孔 电压 , g o 0 V ; 操作温度 , 0 0 ; 孰小时 , 然后纸条…自然干燥 , 用对位茵香胺 伊镇公通d垃 e ) 试
剂于 1 3 0℃ 显色 2 0 分钟 。
(3 ) 凝胶柱层析 eS p h ad e 浑 G 一2 0 凝胶柱层析 (举18 x 72 5 m m ) , 样品 A T M 3 上
柱量为 1 0 m g 。 0 . 1万 N a 0 1洗脱 , 流速 1 0 m l / h , 流出液按每 8 m l 体积分部收集 , 硫酸-
苯酚法比色测定糖含量。 - - - 一 , -
卿 酸水解产物的纸层析 采用慢速滤纸 , 纸长肠 。 m , .下行层杭 溶剂系统为醋
徽乙酪 : 毗 .吮 : 水 ( 1 ) 4 : 8) 。 样品 (1 0负图用 . 2万硫酸封管 10 0 0 水解 6 `小时 , 碳酸钡 中
和浓缩后点样于层析纸上 , 并用各种标准单糖作对照 。 ’ 层析毕 , 纸条千燥后 ,万硝酸银` 氢
氧化钠试剂显色 〔幻 。
(5 ) 分子量测定 9J[ 采用凝胶过滤法测定分子量。 队币h a d枢 G - , 0 0装填 于直径
为 2 0 m m 的玻璃柱中 , 装填高度为 5 60 ~
, 用 0 .肠万 氯化钠按恒定流速污 m l/ h 平衡
三天 , 然后将各种不同的已知分子量的多糖分别相继上柱。 上柱量为 5` 8吨 , 流出掖每
8 m l 分部收集 , 用硫酸一苯酚法比色测定糖含量 。 分别求得洗脱体积 V . , 然后再用蓝色
葡聚糖 (m . w . > 20 万 )上柱 , 求得柱之空体积 Ve , 按 V韶Vo 与分子量对数关系作周 , 得
到标准曲线 。 最后 , 样品 A T M 3( 7 m g )按上述不变的条件上柱 , 求得 玖 , 根据风 /几 值 ,
查标准曲线 , 得到 AT M 3 的分子量。
(0) 酸水解物的定量 气相层析分析 样品 A T M 3 (10 m乡溶于 Z N 硫酸 (3 血)中 ,
10 0℃ 封管水解 ` 6 小时 。 碳酸钡中和 , 过滤 , 水解物在水溶液中用硼氢化钠 ( l o m g ) 室温
还原 2 小时 , 还原液经 7 3创 H + 型 )树脂中和 , 流出液减压浓缩至干 , 反复加甲醇后蒸发去
硼酸五次。 然后 , 用 4血醋配 :毗咙为 1 :1 的试剂乙酞化 , 溶液子 加 0℃ , 蒸发 加汾钟至
于 , 氯仿溶解后 , 进行气相层析 , 并根据气相层析各峰的面积比算出摩尔比 。
(7 ) 过碘酸监衷化 A T M8( 81 m动 一溶于水 (3 0 in l )中 , 加入 0 . 05般皿 过碘酸钠
树 - - - - - ~ - ~ - - - ~ . . .
生物化 学 与生物物理学报 16 卷
(20 l m)
, 混合物置于室温 10 ~ 1 60 0 之避光处 , 定时取样测定过碘酸钠的消耗与甲酸的释
放。 取反应液 0 . l m l 稀释后 , 用紫外分光光度计侈23 班功 )测定过碘酸钠的消耗。 另外取
反应液 ( 2 m l) 加入乙二醇一滴 , 10 分钟后用 0 . 0肠 N 氢氧化钠滴定甲酸的释放。
(s ) Sm恤 降解 氧化完全的反应液 ( 1O 二 l) 中加入乙二醇 l ml , 对燕馏水透析
过夜 , 然后减压浓缩至小体积 , 用硼氢化钠还原 16 小时于暗处 , 还原液通过 殆2 (H +) 及
71 7 (O H
一 )树脂混合床 。 流出液减压浓缩至干 , 然后用 0 . 2 N 盐酸封管 l 0 0C 水解 6 小
时 。水解液燕发至干 , 再反复加甲溥六次 , 蒸发至千 。取小量进行纸层析分析 , 标准品对照。
洛剂系统为醋酸乙醋 :毗吮 :水二抓滋 : 3 , 纸长 35 om , 下行层析 , 联苯胶试剂显色助 , 。 另
外大部分中和液减压浓缩至干 , 溶于砒健中 , 进行硅醚化〔川 , 制成三甲基硅衍生物后进行
气相色谱分析 。
四 、 抗肿瘤试验
A T M 3 对肿瘤半体内抑制试验 : 取接种 7 天的小白鼠艾氏腹水瘩细胞 , 用生理盐水
洗涤癌细胞 , 然后 2 0 r p ln 离心 10 分钟 , 弃去上清液 。 按上法连续洗涤三次 , 以 丑 a kn 。
氏溶液稀释成 8 x l o 6/ m l 的瘤细胞悬浮液 。 将不 同浓度的样品与瘤细胞悬液等量混 合 ,
置于 37 ℃ 温箱中作用 3 小时 。 再给小白鼠皮下注射 0 . 2 m l , 接种后生长 2 ~ 8 周 , 解剖
称取瘤重 , 与对照组比较 , 计算抑制百分率 。 体内试验用 J O R 小鼠斗 180 及且 A C , 于肿
瘤接种后 7 2 小时开始给药 , 连续三周 , 然后解剖称取瘤重 , 计算抑制率。
结 果
A T M 3 经超离心密度梯度分析得到一单峰 (图 功 。 A T M 3 经玻璃纤维纸碱性翻砂缓
冲液电泳 , 显色后呈一单色斑点。 A T M 3 经由p h ad ex G - 2 0 0 柱层析 , 流出液为一单峰 ,
峰的形状对称 , 其洗脱体积为 B .9 5威 (图幻 。 根据上述三种证明多糖纯度的方法可 以
确认所得的多糖 A T M 3 为单一均匀成分。
1
.
0
哎 0 . 5
目咧日例日
图 1 A T M习超离心图
条件: 1肠水溶液 ; 温度 1 2 .扩 q 转逮
5鼠 30 r . p . m . 每隔 1 0’ 照相一次 图 2 A T M 3 的 枷p h翻 e又 G一 0 柱层析
A T M 3 的比旋度为正值间 D + 9 .5 2 。 (O 二 1 . 2 , H刃 ) 。 该多糖能溶于水 , 不溶于其他
有机溶剂。 元素分析结果为 0 4 1 ,灯; E 6 , 69 ; 0 25 . 14 , 不含 N 。 采用凝胶过滤柱层析
3期 亮 菌 多 糖 的 研 ` 究 工 岛2 5
夕
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图 3凝胶柱层析测定分子量 图 4A TM 3的红外光谱 (KB ) r
法测得分子量为 15 4, 加0 (图 3) 。 紫外光谱分析为末端吸收 , 未发现核酸及蛋白质的吸收
峰 。 结合元素分析结果可以确认该多糖是纯粹多糖 , 非蛋白多糖。 红外光谱分析 (图幻
6 P P m
图 6 士H 核磁共振光谱 ( D刃 , DS
.
8注 OOM H幻
糖 , 即压葡萄糖 怡10 ) , 卜半乳糖 ( g al) ,
及咔哇反应阴性表明该多糖不含搪醛酸和酞
基 , 为中性糖 。 其 8 4 4 0班一 1为糖昔键 “ 型的
特征 吸 收诩 。 立H 核磁共 振光谱 (图句 中
8 5
.
28 及 6 . 12 p p m 有两信号 , 证明该多糖结
构中的糖昔键构型为 “ 型 。 18 0 核磁共振光
谱 (图 6) 发现搪昔键的信号均 堆集 在 95 ~
t加 p p m , 也说明它的糖昔键是 a 型“ , 。
多糖水解 物 的 气 相 层 析 (表 劝 证 明
人 T M 3的重复结构为含有五种单糖的杂多
D一甘露糖 (m a n ) , L 一 木糖 恤y l ) 和 L 一岩藻糖
:卜一一喻一一 , 护一一月淤一一 -佘一一弓卜
图 6 士 aC核磁共振光谱 ( D刃 , 25 . 2 M H幻
2邓 生 物化 学 与 生物物理 学 报6 1卷
( f u) o
, 其摩尔比为 。 . 86 : 3 . 0 : 3 . 91 :1 . 0 : 0 . 8 5 。 从 l aO N M R 中发现在糖昔键信号范围至
少有六个信号 , 也证明该多糖是杂多糖。
表 1 A TM 3 水解还原乙硫化衍生物的气相层析
柱 I (才。 ) 柱 1 1 (才二 ) 柱 1 1 1 (亥, )
标 准 品 A T M 3 标 准 品 A T M 3 标 准 品 A T M 3
卫 U C 3 , 7 ,护 3 , 7 , , 7 ,1 7 , , 7 , 1 7 , , 1 0 ,4 0 , , 1 0性 O , ,
X y1 4
, 41
户, 4 , 4 0 , , 1 2尹 1 2 , 1 2注5, , 1 2 , 1 5 , ,
M 久” 8 , 41
, ,
8
,性6 , , 1 5 , 0 7 , , 1 5 , 1 0 , , 3 2 , 2 5 , , 3 2 , 2 5 , ,
G a l 9
,
2 5
, ,
9
,
3 1
, r
1 7
,
4 3
, ,
1 7
, 4 7
, ,
34
,
2 7
, 户
3 4
,
2 7
, ,
G玩 1 0 `1 6 , , 1 0 , 1 8 , , 34 ` Q7 ` , 34 , 0 7 ,`
条件 : 柱 工: 5% O V 一 2邵越W , D MOS 一比r恤的叮 b W 80 ~ 1 0 目 , 柱长 1 . 3 米 , 柱温 Z0 0C , N 公邵 m l/ 分 ; 柱
直径 。 . 3厘米。
柱 1 1: 5% R co P l e x 一续加A/ W 一 D MOS 一 e h r二 os o r b W 8 0 ~ 1 0 目 ,柱长 1 . 3 米 ,柱温 1 93 0 0 , N , : 2 4 m l /分 ;
柱直径 。 . 8 厘米 。
柱 1 卫 1 M OV 一 17 S C O T 玻璃毛细管柱 , 柱温 1 8 50 0 , N 公 肛 也1/ 分 。
A T M 3 在低温暗处进行过碘酸盐氧化咖 , 间歇取样于 2 , 4 , 18 , 2 , 46 , 70 , 94 , 1 1 .8
1 4 2 小时测定过碘酸钠的消耗与甲酸的释放 。 其单位 己糖的过碘酸钠消耗分 别为 0 . 2 8,
0
.
4 1
,
1
.
0 3
,
1
.
0 3
,
1
.
1 7
,
1
. 灯 , 1 .炸 , 1 . 2 7 和 1 . 2 7 万 /万 , 甲酸的释放分别 为 0 . 09 ,
0
.
1 3
,
0
.
3 2 7
,
.0 3 5
,
0
.
40 4
,
0
.
4 55
,
0
.
4 8牙, 0 . 51 7 和 0 . 4 8 2万 / M 。 说明氧化反 应 于 1 1 8
小时完全 , 过碘酸盐消耗与甲酸释放的最大值分别为 1 . 2 7 和 O . 4 82 M /M 。
然后将上述氧化产物进行还原 , 水解 , 纸层析。 分析鉴别降解产物。 其主要降解产物
为大量 乙醇醛 、 丙三醇及少量未氧化之甘露糖和岩藻糖 。 结果说明 A T M 3 结构中含大量
( 1” 6) 键型及少量 (10 3) 键型 。 这个结论在 立ao N M R 中得到进一步证实 , 因为它在 6 6 0
~ 7 0 p p m 范围有许多信号 , 在 占75 ~ 85 p p m 只有少量信号 。
A T M 3 以 5 0 0 7 / m l 浓度进行动物半体内试验 , 其对艾氏腹水 瘤 的 抑 制率为 8 1 % 。
以 2 0 0 m g / k g 腹腔注射进行动物体内试 验 , 其 抑制率对 8一 180 为 26 . 6外 , 对 H A O 为
3 7
.
7外 。
讨 论
目前国内外从高等真菌担子菌中得到的多糖 , 其总数已有二三百种。 其中含有 醉入
g al
、
m a n
、
X yl 和 角 。 五种单糖的杂多糖也约有 印 余种 。 但极大部分未见全 结构的 报
道 。 通常报道到理化性质及各单糖的摩尔比就告一段落 。 我们发现 A T M 3 的 摩 尔 比与
理化性质与文献报道的 同类杂多糖均不相 同。 虽然还没有完成全结构 , 从现有数据 已足
够可以认为它是一种新的杂多糖。
多糖的分子量测定至今仍是一个较难的问题 。 现在还没有一种准确的测定方法 。 这
是因为多糖与其他一般化合物不同 , 它钓分子量只代表相似链长的平均配布 , 而不是确切
3期 亮 菌 多 糖 的 研 究 L
的分子大小 。 往往用不同方法会测得不同的分子量。 ` 例如 , 有时同一多糖其量均与数均
分子量用不伺方法测定甚至会相差一个数量级 。 我们用凝胶过滤法测定的分子量 , ,方法
简便 , 但误差也较大。
我们分别在常温与高温测定多糖的 I H N M R , 发现高温 一份o )C 测定能使光谱信号变
尖 , 易于解释 , 这是与文献报道一致的卿 。 尽管如此 , 因为我们采用的是 l o OM且公仪器 ,
分辨力还不高 , 其光谱还不十分清晰 * 如果采用 4 0 0 M H 么仪器 , 光谱将会更清楚 。 一 ’ 、
A T M 3 对肿瘤细胞的抑制作用系用 J O R 小鼠的斗18 0 及 E A O 固体型肿 瘤进行体
内外的抑制试验 , 均有一定程度的抑制作用 , 但效果不明显 。 我们在实验中艺分离得到另
一多糖组分 , 它具有显著的免疫活性并有明显的抑制肿瘤生长作用 。 该组分正在深入研
究中 。
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兮
、 摘
下
参 考 文 献
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器 8生 、物化学 与 生 物 物 理学报1 6 卷
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