全 文 ：菌 物 学 报 24（1）：93~97, 2005
Mycosystema
二羟鬼笔毒肽（PHD）的制备及其毒理研究
魏宝阳 陈作红* 张 平 张志光
（湖南师范大学生命科学学院真菌研究室 长沙 410081）
摘 要：利用反相高效液相色谱技术从灰花纹鹅膏菌 Amanita fuliginea 中分离纯化出二羟鬼
笔毒肽（PHD），纯度达到 98%。毒理表明二羟鬼笔毒肽（PHD）能引起植物细胞坏死，对
小白鼠的半致死量（LD50）为 2mg/kg。
关键词：灰花纹鹅膏菌，高效液相色谱，质谱
中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2005）01-0093-0097

二羟鬼笔毒肽（Phalloidin，PHD）是鹅膏肽类毒素的一种，能特异性地与微丝球形肌动
蛋白 G-actin (globular actin) 结合，因而二羟鬼笔毒肽用荧光物质标记后，可做肌球蛋白的探
针，在研究细胞骨架的结构和功能中有广泛的应用 (张志光等，1999)。而目前市场上 SIGMA
公司出售的 PHD来自于欧洲的毒鹅膏 Amanita phalloides，价格极其昂贵,每毫克达 140.60美
元。近年来在我国南方一些省份频繁引起中毒死亡事件的灰花纹鹅膏菌 Amanita fuliginea
Hongo 含有较高的二羟鬼笔毒肽，其含量达 1464.3µg/g 干子实体（陈作红等，2003）。为了
有效利用我国的鹅膏资源，本文利用反相高效液相色谱技术从灰花纹鹅膏菌中分离纯化出了
二羟鬼笔毒肽，并对其毒理进行了初步研究。
1 材料和方法
1.1 实验材料
灰花纹鹅膏菌 Amanita fuliginea Hongo采自长沙县，实验小白鼠购于中南大学湘雅医学
院，绿豆购自市场。
1.2 仪器和试剂
Waters Delta 600E液相色谱仪 (Waters公司)，色谱工作站（杭州英谱公司），色谱分析
柱：YWG C18 10µm ID4.0mm×300mm；半制备柱：YWG C18 10µm ID10mm×300mm（大连依
利特科学仪器有限公司）， Q-TOF（Micromass公司）。
二羟鬼笔毒肽标样和醋酸铵 (美国 Sigma公司)，乙腈和甲醇 (色谱纯，湖南省化工研究
院)，冰醋酸 (分析纯)，汽油 (航空汽油)，双蒸水 (自制)。
1.3 实验方法
1.3.1 粗毒提取：参照文献（胡劲松等，2003）。
1.3.2 二羟鬼笔毒肽的分离纯化：洗脱液由 A、B两液混合，A液为 10%乙腈＋90%0.02mol/L
醋酸铵；B 液为 24%乙腈＋76%0.02mol/L醋酸铵。用冰醋酸调节 pH至 5.0。分离梯度模

基金项目：国家自然科学基金资助项目（30070005），湖南省科技厅项目（03JZY3026）
*通讯作者 E-mail: chenzuohong@263.net
收原稿日期：2004-08-23，收修改稿日期：2004-10-08
DOI:10.13346/j.mycosystema.2005.01.016
94 菌 物 学 报 24卷
式：0→15min，B 液 0→5%，15→35min，B 液 5%→80%，并保持 5min；40→45min，B 液
80%→100%，并保持 5min；50→55min，B 液 100%→0%，保持 10min。纯化梯度模式：0
→10min,B 0→5%；10→25min，B 5→80%，并保持 5min；30→35min，B 80→100%，并保持
5min；40→45min，B 100→0%，并保持到结束。检测波长：295nm； 柱温：40℃；流速：
分析柱：1mL/min；半制备柱:2mL/min。 进样量：分析柱：10µL，半制备柱：1mL。
先在分析柱上筛选出最适宜的色谱条件，后在半制备柱上进行毒素分离和纯化，分离纯
化结果用 Q-TOF质谱仪测定分子量。
1.3.3 二羟鬼笔毒肽对绿豆种子萌发的影响
用二羟鬼笔毒肽配成 1mg﹒mL-1、0.5 mg﹒mL-1、0.01 mg﹒mL-1、0.05 mg﹒mL-1、0.01 mg
﹒mL-1五个浓度梯度的溶液。按对照组（CK）和处理组分别选取颗粒饱满、大小均一绿豆种
20 粒，放入衬有双层滤纸的培养皿中，3 组重复，加不同浓度的目标毒素溶液 3mL 后置于
26.2℃恒温箱中进行暗萌发，44h和 70h后分别测量根的长度。于 70h后每皿测量 10棵绿豆
的湿重与干重，并进行形态学观察。
1.3.4 二羟鬼笔毒肽的 LD50的测定
采用纪云晶主编的《实用毒理手册》上所记载的简易方法。预备实验：设三个梯度，每
个梯度三只小白鼠，每只小白鼠注射的剂量分别为 50µg﹒kg-1，500 µg﹒kg-1，5000 µg﹒kg-1。
补充实验：根据第一步结果，设合适的间距较小的四个剂量，每组两只动物根据补充实验试
验结果，取两个或三个相邻剂量的几何平均值即得 LD50。
2 结果与分析
2.1 二羟鬼笔毒肽在 RP-HPLC 半制备柱上的分离纯化
灰花纹鹅膏菌粗毒提取液在 RP-HPLC半制备柱上的分离纯化结果如图 1，可以看出分离
效果较好，分离度高，峰形比较好，主要毒素成分可以较好的分离，其中以α-鹅膏毒肽
（33min）、二羟鬼笔毒肽（50min）的效果为最好，二羟鬼笔毒肽粗毒分离收集后其纯度就
图1 灰花纹鹅膏菌粗毒提取液的HPLC图谱
Fig.1 HPLC of Amanita toxins extracted from Amanita fuliginea
1期 魏宝阳等：二羟鬼笔毒肽（PHD）的制备及其毒理研究 95
可达 90%以上（如图 2），进行一次纯化后，纯度即可以达到 98%以上。

2.2 二羟鬼笔毒肽的质谱分析（图 3）
在 Q-TOF质谱仪测得分子量为 788.4 Da。再根据分子量和色谱保留时间以及最大紫外吸
收值（290.83nm）与二羟鬼笔毒肽标样的数据对照，可判断该组分为 Phalloidin，C35H48N8O11S
﹒5H2O MW878 (788+90)，与Wieland 的结果一致(Wieland,1986)。
2.3 二羟鬼笔毒肽对绿豆种子萌发的影响
2.3.1 PHD 对豆芽胚根根长的影响：结果如表 1,从表可以看出：随着毒素浓度的增大，毒素
对根的生长的抑制作用增强。但在浓度为 0.01mg/mL在 44 小时时对根的抑制出现了反常的
现象，即其抑制作用比浓度为 0.100mg/mL、0.050mg/mL时还要强，可能是实验误差引起的，
是不是还有其它原因还有待进一步研究。
图2 49.0 0分
钟峰纯化后的
HPLC图谱
Fig.2 HPLC of
purified toxin
图 3 二羟鬼笔
毒肽纯化样品的
质谱图
Fig. 3 Mass
spectrum of
purified
Phalloidin
96 菌 物 学 报 24卷
表 1 PHD对豆芽胚根根长的影响( X ±S, cm, 每组 10根豆芽胚根，3次重复)
Table 1. The effect of PHD on embryo root length of bean sprouts

1.00 0.50 0.10 0.05 0.01
对照
(Contrast)
44 1.1±0.1 1.4±0.1 2.5±0.3 2.7±0.2 2.3±0.1 3.2±0.0
70 1.5±0.1 2.1±0.1 4.1±0.2 4.3±0.3 4.5±0.1 5.2±0.2
*浓度（mg﹒mL-1）
2.3.2 PHD对豆芽胚根重量的影响：结果如表 2，从表可以看出：随着毒素浓度的增大，毒素
对根的鲜重和干重的抑制作用明显增强。
表 2 PHD对豆芽胚根重量的影响（ X ±S ,mg, 60次重复）
Table 2. The effect of PHD on embryo root weight of bean sprouts
浓度（mg﹒mL-1）
Concentration
1.00 0.50 0.10 0.05 0.01
对照
(Contrast)
鲜重（mg）
wet weight
260.4±45.1 310.3±36.3 672±31.5 882.5±54.0 998.1±40.0 1065.±22.3
干重(mg)
dry weight
38.9±40.4 42.9±35.1 66.1±31.6 86.2±6.2 116.4±6.1 121.9±5.0
2.3.3 对根的显微结构的影响：根尖细胞的液泡的体积和数目变小，在伸长区以上的部分观
察到液泡似乎破裂，液泡中有许多致密块。细胞的核膜发生明显变形，核形状不规则，可以
看到核破裂，出现了细胞坏死现象。随着毒素浓度的增大，根尖坏死部分的长度增长，而对
照组没有出现根尖坏死现象。同时对根尖细胞的 DNA 进行了提取和电泳，没有发现细胞凋
亡的 DNA 特征带，细胞核也没有出现凋亡小体，因而没有出现细胞凋亡现象。说明二羟鬼
笔毒肽能引起植物细胞坏死，并不引起细胞凋亡。
2.4 二羟鬼笔毒肽对小白鼠的 LD50测定
实验结果如表 3,表 4, 根据预备实验和补充实验结果，可以计算出二羟鬼笔毒肽对小白
鼠的 LD50=2 mg﹒kg-1.通过对致死小白鼠的解剖学形态观察,发现除肝脏肿大，颜色变深外，
其它器官没有明显异常。对三只小白鼠进行食物施毒发现小白鼠没有死亡现象，甚至没有观
察到明显的中毒症状，说明该毒素不能被小肠吸收，并且与文献资料吻合。
表 3 PHD对小白鼠毒性预备实验
Table3 Toxicity preliminary experiment of PHD to white mouse
剂量 Dosage(µg﹒kg-1) 50 500 5000
死亡数(个) Number of dead 0 0 3
表 4 PHD对小白鼠毒性补充实验
Table4 Toxicity supplementary experiment of PHD to white mouse
剂量 Dosage(µg﹒kg-1) 1000 2000 4000 8000
死亡数 (个) Number of dead 0 1 2 2
浓
度
* 时 间 (h)
1期 魏宝阳等：二羟鬼笔毒肽（PHD）的制备及其毒理研究 97
3 讨论
二羟鬼笔毒肽的分离采用本实验室已成熟的鹅膏毒肽纯化方法效很好，粗毒分离收集后
纯度就可达 90%以上。再在分离梯度模式的基础上进一步对起纯化条件进行了摸索，找到了
较好的纯化梯度模式，在这模式上一次纯化纯度可达 98%以上。灰花纹鹅膏菌二羟鬼笔毒肽
（PHD）含量是 1462.3µg·g-1，含量比较丰富,可作为生产这一毒素的原料。
二羟鬼笔毒肽对绿豆种子萌发的毒理作用的原因是由于二羟鬼笔毒肽专一性地与植物细
胞的球形肌动蛋白 G-actin(globular actin)结合，从而打破了球形肌动蛋白 G-actin与纤维形肌
动蛋白 F-actin (fibrous actin)之间的平衡，形成了大量的 G-actin- Phalloidin的复合体，阻止了
G-actin组合成 F-actin，使细胞的骨架系统发生改变，从而影响核膜、液泡膜等膜系统。核膜
由于失去了 F-actin支撑而使细胞核的形状发生明显改变，液泡膜通透性也发生了改变，引起
细胞内物质的流失，从而细胞的分裂和生长也受到相应的影响。所以出现了随毒素浓度增大
对根尖长度、根的干重和根尖腐败程度增大的现象。二羟鬼笔毒肽对小白鼠的 LD50测定两种
常用的方法：改良寇氏法和纪云晶主编的《实用毒理手册》上所记载的简易方法。文献资料
绝大部分是用的第一种方法，其测得的值也有一些不同的数据，如 2.56 mg / kg，2.38 mg / kg，
2.0 mg / kg。而本文采用简易方法测的的数据与文献资料吻合。说明用该方法提取和纯化的
毒素是有生物学活性的，可以应用于生物学的研究中。
[REFERENCES]
Chen Z H, Hu J S, Zhang Z G, Zhang P, Li D P, 2003. Determination and analysis of the main amatoxins and phallotoxins in 28
species of Amanita from China. Mycosystema, 22 (4): 565~573
Ｈu J S, Chen Z H, Zhang Z G, Zhang P. 2003. Analysis of the main amatoxins and phallotoxins in Amanita exitialis, a new species
in China. Acta Microbiologica Sinica 43 (5): 642~646
Wieland H, 1986. Peptides of Poisonous Amanita Mushrooms. Germany: Springer-Verlag New York Inc, 1~256
Zhang Z G, Zhang X Y, LI D P, 1999. Application of Amanita toxic peptides in life science research. Journal of Hygiene Research.
28 (1): 60~63
[附中文参考文献]
陈作红, 胡劲松, 张志光, 张 平, 李东屏, 2003. 我国 28种鹅膏菌主要肽类毒素的检测分析，菌物系统，22 (4): 565~573
胡劲松, 陈作红, 张志光, 张 平, 2003. 我国鹅膏菌新发现种——致命鹅膏 (Amanita exitialis) 的肽类毒素分析. 微生物学
报, 43 (5): 642~646
纪云晶, 1991. 实用毒理手册. 中国环境科学出版社. 74~75
张志光, 张晓元, 李东屏, 1999. 鹅膏菌多肽毒素在生命科学研究中的应用. 卫生研究, 28 (1): 60~63

PRODUCTION AND TOXICOLOGY RESEARCH OF PHALLOIDIN(PHD)
WEI Bao-Yang, CHENG Zou-Hong
(Mycological Laboratory, College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081)
ABSTRACT: Phalloidin is isolated and purified by using reversed-phage high-performance liquid chromatograph and
mass spectrum from Amanita fuliginea. The purities of the product are over 98%. The toxicology displayed the phalloidin
can cause plant cellular necrosis and the LD50 in white mouse is 2mg/kg.
KEY WORDS: Amanita fuliginea, RP-HPLC, mass spectrum