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枣叶黄酮体外
及皮肤荧光斑马鱼体内抗氧化活性研究
李全国1，楚 杰2，陈锡强2，王君高1，吴晓敏，刘可春2
(1.齐鲁工业大学食品与生物工程学院，山东济南 250353;
2.山东省科学院生物研究所，山东济南 250014)
摘 要:目的:研究乐陵枣叶总黄酮的抗氧化活性。方法:采用分光光度法测定枣叶总黄酮对 DPPH·、·OH 和 O －2·的
清除能力和总黄酮的还原力;同时利用皮肤荧光斑马鱼进行总黄酮的抗氧化活性实验。结果:枣叶总黄酮在 0.2～
1.0mg /mL范围内对 DPPH·，·OH和 O －2·有着良好的清除作用，当试样浓度为 1.0mg /mL 时，清除率达到最大，分别为
65.4%，55.0%，75.5%。在对皮肤荧光斑马鱼进行总黄酮的抗氧化活性体内实验中，设置了三个实验组(20，50，
100μg /mL)，其相对抗氧化能力分别达到了 49.6%，58.6%和 77.8%。结论:乐陵枣叶总黄酮对自由基具有良好的清除
作用，具有较好的抗氧化能力。
关键词:枣叶，总黄酮，自由基，斑马鱼
Study on the antioxidant activity evaluation of
Jujube(Ziziphus)leaf flavonoids in vitro
and zebrafish(Danio rerio)with fluorescent skin
LI Quan－guo1，CHU Jie2，CHEN Xi－qiang2，WANG Jun－gao1，WU Xiao－min，LIU Ke－chun2
(1.School of Food Biological Engineering，Qilu University of Technology，Ji’nan 250353，China;
2.Biology Institute of Shandong Academy of Science，Ji’nan 250014，China)
Abstract:Objective:To investigate the antioxidant activity of flavonoids from Laoling jujube leaf in vitro and in vivo.
Methodology:The antioxidant activity of the extract was evaluated by spectrophotometry on its ability of
scavenging hydroxyl radical(·OH)，superoxide anion radical(O －2·)，1－ diphenyl－2－ picrylhydrazy(DPPH·)and
total reducing power. The zebrafish was used to test the antioxidant activities of flavonoids. Ｒesults:The total
flavonoids from jujube leaf had well scavenging activity to DPPH·，·OH and O －2·at the concentration from 0.2 to
1.0mg /mL，when the concentrations of sample were 1.0mg /mL，the highest scavenging were reached to 65.4 %，
55.0 % and 75.5 % respectively.In vivo experiments in zebrafish showed the three relative concentrations(20，50，
100μg /mL)of the antioxidant capacity were reached to 49.6%，58.6% and 77.8% respectively.Conclusion:The total
flavonoids from Laoling jujube leaf showed effective antioxidative action both in vitro and in vivo.
Key words:jujube leaf;flavonoids;free radicals;zebrafish
中图分类号:TS255.1 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2014)05－0058－05
收稿日期:2013－08－22
作者简介:李全国(1989－) ，男，在读硕士，研究方向:生物研究。
乐陵以盛产金丝小枣而著名，有着“金丝小枣之
乡”、“百里枣乡”等美誉。近年来，乐陵市实施了红
枣富民战略，使得枣树的种植面积大幅度的增长，现
在全市拥有的枣树已经达到 2000 多万株，年产干枣
突破 1 亿公斤，是全国红枣产量的十分之一［1－2］。如
此巨大的种植规模，对于枣叶的充分利用具有极大
的意义。枣叶在宁心安神，提高睡眠质量等方面具
有很好的功效，具有“东方睡叶”的美称［3］。因此，枣
叶是一种极具价值的天然保健饮品和药用资源。
枣叶中含有大量的生物活性物质，其中黄酮类
化合物是主要成分之一，黄酮类化合物具有抗氧化
和清除自由基的能力，另外黄酮还具有抗炎、抗衰
老、抗肿瘤［4－5］以及改善血液循环，降低胆固醇［6］等多
种生物活性，而且由于是直接从可食用的植物中提
取，大大的提高了黄酮本身的安全性，因而引起了人
们对黄酮研究的极大关注。斑马鱼是淡水水族箱观
赏鱼，由于其基因与人类基因有着 87%的相似，因此
被广泛地应用于生命科学研究。皮肤荧光斑马鱼是
将荧光蛋白标记在角质细胞上，在荧光显微镜下观
察计数角质细胞，然后加入甲硝唑来使得角质细胞
凋亡，然后再加入抗氧化物质，使有一部分角质细胞
的荧光得以表达，从而来测定药物的抗氧化能力。
人体内自由基是与生俱来的，适量的自由基可以帮
助维持生命的活力［7］，也可以帮助排除毒素，但是过
多的自由基会对人体产生危害，例如破坏细胞膜，使
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.05.071
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血清抗蛋白酶失去活性，从而产生炎症以及损伤基
因导致肿瘤等［8］。因此研究具有清除自由基作用的
黄酮类物质具有重要意义。本文通过体外及体内实
验考察乐陵枣叶总黄酮类物质的抗氧化能力，同时
以 VC 作为对照，为枣叶的综合利用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
芦丁对照品 南京泽朗医药科技有限公司;
DPPH 梯希爱(上海)化成发展有限公司;麻醉剂
Tric －ainc MS222，Sigma 公司;水为双蒸水;斑马鱼
培养水 配方［9］为 5mmol /L NaCl，0.17mmol /L KCl，
0.14mmol /L CaCl2，0.16mmol /L MgSO4;黄酮溶液
40mg /mL，VC 40mg /mL，甲硝唑溶液 2.5mol /L(DMSO
溶解) ;VC、DMSO、亚硝酸钠、硝酸铝、硫酸亚铁、水杨
酸、双氧水、氢氧化钠、无水乙醇等试剂均为分析纯。
转基因皮肤荧光斑马鱼 cy17(krt4－NTＲ:GFP) 山
东省科学院生物研究所繁殖。
ＲE－6000 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;
UV－2100 型紫外可见分光光度计 上海合利仪器有
限公司;TDL－5－ A 型离心机 上海安亭科学仪器
厂;电热恒温水浴锅 上海贺德实验设备有限公司;
Olympus SZX－16 型荧光显微镜 日本 Olympus 公
司;恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 乐陵枣叶总黄酮提取及含量测定
1.2.1.1 乐陵枣叶总黄酮提取 准确称取已粉碎过 20
目筛的枣叶于蒸馏瓶中，加入浓度为 50%的乙醇，1∶10
的料液比，70℃下回流 1h，离心，取上清液，浓缩，过大
孔树脂柱，旋转浓缩，真空干燥得总黄酮［10］。
1.2.1.2 乐陵枣叶总黄酮的含量测定 准确吸取枣
叶总黄酮浓缩液 1mL稀释 10 倍，按照文献［10］中的方
法在 510nm 处测定吸光度，代入标准曲线计算出枣
叶中总黄酮的浓度，再按照以下公式计算出枣叶中
总黄酮的含量。
总黄酮含量(mg /g)=(黄酮浓度 ×稀释倍数 ×
提取液体积)/样品重量
1.2.2 乐陵枣叶总黄酮体外抗氧化活性实验 采用
DPPH法、水杨酸法和邻苯三酚自氧化法来进行抗氧
化实验，测定了总黄酮的的总还原力，同时以 VC 为
阳性对照。
1.2.2.1 DPPH·的清除实验 实验前配制质量浓度
为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg /mL的枣叶黄酮和 VC 溶液。
同时用无水乙醇配制 0.1mmol /L的 DPPH溶液，置于
棕色瓶中备用。用移液枪准确吸取不同浓度的黄酮
溶液 1mL 置于试管中，同时加入 3mL 刚配制的
DPPH乙醇溶液，混合均匀，于暗处反应 30min，在
517nm波长处测定吸光度。同时用等浓度的 VC 溶
液作为阳性对照。DPPH自由基的清除率计算公式，
K(%)=［1－(A1－A2)/ A0］× 100
其中，A1 为样品溶液的吸光度，A2 为未添加
DPPH的样品溶液吸光度，A0 为未添加样品溶液的
DPPH溶液吸光度。
1.2.2.2 清除羟基自由基能力的测定 配制黄酮质
量浓度为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg /mL 以及 2mmol /L
的二氯化铁、2mmol /L的过氧化氢溶液和 6mmol /L 的
水杨酸乙醇溶液。在试管中加入 2mL 的黄酮样品溶
液、2mmol /L的二氯化铁、2mL 2mmol /L的过氧化氢溶
液和 2mL 6mmol /L的水杨酸，混合均匀，再添加 10mL
蒸馏水，混合后于 37℃的水浴锅中反应 30min。在
510nm波长处测定其吸光值。同时以相同的浓度 VC
做阳性对照进行测定。羟基自由基清除率计算公式，
G(%)=［B0－(B1－B2)］/ B0 × 100
其中，B0 为空白对照溶液的吸光度，B1 为样品
溶液的吸光度，B2 为未添加过氧化氢溶液的样品溶
液吸光度。
1.2.2.3 清除超氧阴离子自由基能力的测定 实验
前配制质量浓度为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg /mL 的黄
酮溶液及 0.05mol /L Tris － HCl(pH8.2)的缓冲液、
0.025mol /L邻苯三酚溶液、8mmol /L的盐酸溶液。取
试管，加入 4.5mL 0.05mol /L Tris－HCl(pH8.2)的缓冲
液置于 25℃的水浴锅中预热 20min，再加入 1mL 不
同浓度的样品溶液和 0.4mL 0.025mol /L 的邻苯三酚
溶液，混匀。将混匀的溶液放置于 25℃水浴中反应
4min，迅速加入 1.0mL 8mmol /L 的盐酸溶液终止反
应。在 320nm处测定其吸光度，同时以 VC 做为阳性
对照。超氧阴离子自由基清除率计算公式:
M(%)=(D0－Dx)/ D0 × 100
其中，D0 为空白对照溶液的吸光度;Dx 为加入样品
溶液的吸光度。
1.2.2.4 还原能力的测定 用移液枪准确取 2.5mL
不同质量浓度的黄酮溶液加入到试管中，然后加入
2.5mL 0.2mol /L pH6.6 的 H3PO4 缓冲液，再添加
2.5mL 1%的 K3Fe(CN)6 溶液后混匀。置于 50℃的
水浴锅中反应 20min 后，再加入 2.5mL 10% 的
C2HCl3O2 溶液，混匀后在离心机中以 3000r /min 的
转速离心 10min，取离心后的上清液 5mL加入已添加
0.5mL 0.1%的 FeCl3 溶液和 4mL蒸馏水的试管中，混
匀。10min后于 700nm处测定其吸光度。同时以 VC
做为对照。
1.2.3 斑马鱼体内抗氧化活性的研究
1.2.3.1 斑马鱼抗氧化原理 皮肤荧光斑马鱼是将
荧光蛋白标记在角质细胞上，对角质细胞进行计数，
如果一个细胞内的自由基导致了细胞损伤，就会使
得线粒体膜穿孔，这些小孔允许细胞色素 C到达细胞
质中，使得细胞色素 C与 Apaf－1 结合形成聚合体，这
些聚合体需要 ATP 提供能量，进而使得 caspase－9 裂
解为 caspase－3 和 caspase－7，这些裂解的 caspase 能
够激活蛋白水解酶，使得蛋白水解，DNA降解。通过
加入抗氧化药物来清除细胞内的自由基，从而减少
细胞凋亡。转基因斑马鱼在荧光显微镜下，皮肤上
显示许多绿色的荧光亮斑点，加入甲硝唑后，荧光斑
点会消失，再加入抗氧化药物荧光斑点会恢复。利
用这样的特性进行抗氧化实验，统计荧光斑点可以
测定药物的相对抗氧化能力。
1.2.3.2 斑马鱼胚胎的准备 斑马鱼的养殖方法参
照 Westerfield［11］的方法，选择成熟的斑马鱼，按照雌
鱼与雄鱼 1∶1 或者 1∶2 的比例置入繁殖缸内，次日清
60
晨取出受精卵，加入亚甲基蓝溶液，放入 28℃培养箱
中孵化，备用。
1.2.3.3 实验分组与给药 将孵化 24h 的斑马鱼胚
胎取出，放置于 1mg /mL 的链霉蛋白酶溶液中约
10min左右，脱去斑马鱼胚胎外层的卵膜。将脱去卵
膜的斑马鱼胚胎随机分成溶剂对照组、甲硝唑组、黄
酮组(20、50、100μL)、VC 组(20、50、100μL)，每组胚
胎 6 个，同时设置一个副孔，加入 24 孔板中，每组实
验进行三次。
根据实验分组，在每个孔中加入 2mL培养水，溶
剂对照组再加入 8μL 的 DMSO，甲硝唑组加入 8μL
2.5mol /L的甲硝唑溶液，黄酮组和 VC 组在加入与甲
硝唑相同的甲硝唑溶液之后，同时按照各自的浓度
加入不同量的 40mg /mL的黄酮和 VC 溶液。
将给药后的 24 孔板置于 28℃的恒温培养箱中
进行培养，24h之后取出，在荧光显微镜下观察斑马
鱼的生长状况以及皮肤荧光的强弱，同时为防止拍
照过程中斑马鱼不断的游动，在每个 24 孔板中加入
适量的三卡因溶液对斑马鱼进行麻醉。利用
imagepro－ plus 软件统计各组的荧光点数量，再利用
SPSS软件对数据进行统计分析。
相对抗氧化能力(%)=(给药组荧光角质细胞
数量－甲硝唑组荧光角质细胞数量)/(溶剂对照组角
质细胞数量－甲硝唑组荧光角质细胞数量)× 100
2 结果与讨论
2.1 总黄酮含量测定
吸取总黄酮浓缩液 1mL参照 1.2.1 中的方法，计
算出枣叶中总黄酮的含量为 6.0372mg /g。
2.2 DPPH·的清除实验
DPPH具有孤对电子，在 517nm 处有较强的吸
收，当加入自由基清除剂时，孤电子配对形成电子
对，导致吸收降低。因此可以用分光光度计进行定
量的测定［12］。总黄酮对 DPPH 自由基的清除作用如
图 1。
图 1 不同浓度样品对 DPPH·的清除作用
Fig.1 Scavenging effect of DPPH·
in different coucentration samples
如图1所示，总黄酮对 DPPH 自由基的清除作用
随着样品浓度的增加而增大。样品浓度从 0.2mg /mL
到 1mg /mL，对 DPPH自由基的清除率从 45.2%增大
到 65.4%，而在相同的质量浓度变化范围下，VC 对
DPPH自由基的清除从 93.4%增大到 98.7%，因此与
同等质量浓度的 VC 相比，样品的清除率低于 VC 的
清除率。与周劝娥等报道［13］的结果基本一致。
2.3 清除羟基自由基能力的测定
羟基自由基是一种重要的活性氧，具有极强的
得电子能力，能够引起基因的氧化损伤，是目前认为
毒性最强的自由基［14］。通过水杨酸比色法测定枣叶
总黄酮对羟基自由基的清除能力，实验结果如图 2
所示。
图 2 不同浓度的样品对·OH的清除作用
Fig.2 Scavenging effect of·OH
in different concentration samples
由图2可以看出随着样品浓度的不断增大，样品
对羟基自由基的清除能力呈现不断增大的趋势，说
明对羟基自由基的清除能力与样品的浓度呈现较好
的量效关系。由图 2 可知，当样品的浓度由 0.2mg /
mL增加到 1.0mg /mL 时，其对羟基自由基的清除率
也由 40%增大到了 55%。说明提取物对羟基自由基
有着较好的清除作用。这与阎娥等报道［15］的实验结
果趋势相同。
2.4 清除超氧阴离子自由基能力的测定
超氧阴离子自由基是代谢过程中第一个生成氧
的自由基，具有非常强的氧化能力，又能够转化为其
它氧自由基。因此，超氧阴离子自由基是其它氧自
由基的部分源头，清除超氧阴离子自由基能够显著
的减少氧自由基的生成。通过邻苯三酚自氧化法［16］
产生超氧阴离子自由基来测定样品的清除作用，实
验结果如图 3 所示。
图 3 不同浓度的样品对 O －2·的清除作用
Fig.3 Scavenging effect of O －2·
in different concentration samples
由图3可以看出，样品浓度与对超氧阴离子自由
基的清除率有着良好的线性关系。当样品的浓度由
0.2mg /mL增加到 1.0mg /mL 时，其对超氧阴离子自
由基的清除率由 43%增加到 75.5%。说明提取物对
61
超氧阴离子的清除作用随着提取物浓度的增加而升
高，其对超氧阴离子自由基具有较好的清除作用。
样品浓度为 0.2mg /mL时，样品对超氧阴离子自由基
的清除作用就达到了 43.7%，与对照品 VC 相比较而
言，在相同的质量浓度下，清除作用还是稍微弱
一些。
2.5 还原力实验
某种物质还原力的大小能够在一定程度上反映
这种物质清除自由基能力的强弱，研究表明，物质的
还原力越大，其抗氧化能力越强。通过显色反应测
量某种物质将 Fe3 +还原成 Fe2 +的能力，在 700nm 处
测定其吸光度，吸光度值越大，说明其还原能力越
大［17］。样品的还原力实验结果如图 4 所示。
图 4 不同浓度的样品的还原力大小
Fig.4 Samples of different concentration
of the reducing capacity
由图 4 可以看出，随着样品浓度的增加，样品的
吸光度越大，还原力越大。当样品的质量浓度达到
1.0mg /mL时，样品的吸光度为 0.76，在相同的质量浓
度下，VC 的吸光度为 0.75。表明样品具有较强的还
原力。
2.6 斑马鱼抗氧化活性
实验结果如表 1 所示，荧光图片如图 5 所示。
表 1 黄酮对皮肤荧光斑马鱼胚胎生成的影响
Table 1 Effect of flavonoids on the
skin fluorescent zebrafish embryo formation
组别 荧光点数
相对抗氧化能力
(%)
溶剂对照组 61.3 ± 7.0 －
甲硝唑组 4.6 ± 1.0 －
黄酮 20μg /mL组 32.7 ± 10.7＊＊ 49.6
黄酮 50μg /mL组 37.8 ± 9.0＊＊ 58.6
黄酮 100μg /mL组 48.7 ± 12.1＊＊ 77.8
VC 20μg /mL组 28.7 ± 12.3＊＊ 42.5
VC 50μg /mL组 38.1 ± 9.3＊＊ 59.1
VC 100μg /mL组 49.0 ± 10.8＊＊ 78.3
注:与溶剂对照组相比:＊＊p ＜ 0.01。
由表 1 可见，溶剂对照组中，斑马鱼的皮肤荧光
点最多，加入甲硝唑后绝大部分荧光点消失，结果如
图 5 中的 A所示，再加入样品后，荧光点能够再次更
多的被观察到，说明样品有抗氧化活性。随着样品
浓度的增加，荧光点越多，说明样品的抗氧化能力
图 5 黄酮对斑马鱼的抗氧化活性的影响
Fig.5 Effects of flavonoids on the
skin fluorescent zebrafish embryo formation
注 A－甲硝唑组;B－溶剂对照组;C－黄酮 20μg /mL组;
D－黄酮 50μg /mL;E－黄酮 100μg /mL;F－VC 20μg /mL;
G－VC 50 μg /mL;H－VC 100μg /mL。
增强。
3 结论
本文通过提取乐陵枣叶中的黄酮进行抗氧化研
究，结果发现提取的黄酮类物质具有较好的还原力，
对 DPPH·、·OH 和 O －2·清除率随着质量浓度的增大
而升高，说明有着明显的量效关系，当样品的浓度达
到 1mg /mL时，其对 DPPH·、·OH和 O －2·清除率分别
达到了65.4%、55%和 75.5%，同时在还原力测定中，
吸光度值为 0.76，与同浓度的 VC 相比，还原力相差
不大，表明枣叶黄酮具有较好的还原力。同时从斑
马鱼的抗氧化活性实验发现，通过添加甲硝唑消除
荧光点后，再添加提取物后，斑马鱼皮肤上的荧光点
能够重新在显微镜下观察到，添加量为 100μg /mL
时，相对抗氧化能力可达到 77.8%，说明乐陵枣叶黄
酮具有良好的抗氧化活性。本研究为乐陵枣叶的开
发利用提供了理论依据。
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(下转第 65 页)
65
沉降速度为 1.68mL /min。海藻酸钠(SA)原料的去
除率较低，但对于硅藻土也具有一定的絮凝效果。
可使去除率达到 83.01%，沉降速度为 1.39mL /min。
均大大优于未添加絮凝剂时硅藻土自然沉降的去除
效果。
表 1 海藻酸钠及改性海藻酸钠的絮凝性能比较
Table 1 Sedimentation data for different flocculants
序号 絮凝剂
沉降速度
(mL/min) 去除率
(%)
1 HSA 1.68 91.53
2 SA 1.39 83.01
3 无(未添加) 0.05 51.31
改性后含有氧肟酸基团的海藻酸钠絮凝剂对
浆液的絮凝作用力强，即使颗粒体积小、密度低也
具有好吸附作用，并且含氧肟酸基团的海藻酸钠迅
速的牢固的捕捉硅藻土颗粒，形成稳定的絮团，从
而表现出较优的沉降效果，且没有诱导期，吸附速
度快。实验结果可以明显看出在海藻酸钠高分子
聚合物中接入氧肟酸基团的辅助，更有利于絮凝
沉降。
实验研究表明，通过对海藻酸钠高分子聚合物
进行非均相酯化反应和肟化酸化反应改性，制得的
含氧肟酸基团的改性絮凝剂比未改性的海藻酸钠具
有更好的絮凝作用。
3 结论
本文以海藻酸钠为原料，通过分析沉降时间、絮
凝温度及絮凝剂投加量对絮凝沉降的影响研究，结
果表明:当沉降时间为 30min，温度为 20℃，海藻酸钠
絮凝剂投加量达到 2.4mg /L 时去除率达到最大。并
对海藻酸钠进行非均相酯化反应和肟化酸化反应，
制备出了含氧肟酸基团的高效絮凝剂。且对其絮凝
最优条件进行研究，得出在温度为 20℃，改性后的海
藻酸钠投加量为 0.8mg /L 时，絮凝 30min 后，去除率
最大可达 91.53%，液固比达 2.33，此时具有较好的絮
凝效果。
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