全 文 ：收稿日期:2015-07-18
基金项目:国家自然科学基金(81360664);贵州省中药现代化科技产业专项基金项目(黔科合中药字［2013］5062 号;黔科合重 G 字
［2013］4001)
作者简介:郑林(1981-)，女，博士，副教授，研究方向:重要药效物质基础及质量控制;Tel:0851-86908468，E-mail:mailofzl@ 126. com。
* 通讯作者:李勇军，Tel:0851-86908468，E-mail:liyongjun026@ 126. com。
·质量分析·
UPLC-MS /MS 同时测定静脉注射荭草花提取物
大鼠血浆中 3 种成分及其药代动力学研究
郑 林1，2，杨 武1，向文英1，孙 佳1，2，陈思颖1，2，李勇军2，3*
(贵州医科大学 1. 贵州省药物制剂重点实验室;2. 药学院;3. 民族药与中药开发应用教育部工程研究中
心，贵州 贵阳 550004)
摘要 目的:建立 UPLC-MS /MS测定大鼠尾静脉注射荭草花提取物后的大鼠血浆中 3 种成分(原儿茶酸、山柰
素-葡萄糖苷、檞皮苷)含量的分析方法，并研究这 3 种成分在大鼠体内药代动力学特征。方法:采用 Waters BEH
C18(50 mm ×2. 1 mm，1. 7 μm)色谱柱;流动相为 0. 1%甲酸乙腈-0. 1%甲酸溶液，梯度洗脱;质谱采用电喷雾电离
源(ESI);扫描方式为多反应离子监测(MＲM)。结果:静脉注射荭草花提取物后原儿茶酸、山柰素-葡萄糖苷、槲皮
苷在大鼠体内的半衰期分别为(41. 9 ± 12. 3)min、(71. 3 ± 56. 8)min和(90. 3 ± 74. 8)min，达峰浓度(1. 7 ± 0. 7)μg /
mL、(2. 1 ± 0. 9)μg /mL和(8. 7 ± 3. 7)μg /mL。结论:实验结果表明建立的方法快速、准确、灵敏，精密度回收率均
符合生物样品的测定要求，适用于原儿茶酸、山柰素-葡萄糖苷、檞皮苷 3 个成分在大鼠血浆中浓度的测定，3 个成
分在大鼠体内的药动学特征均符合二室模型。
关键词 UPLC-MS /MS;药动学;荭草花提取物
中图分类号:Ｒ284. 1 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2016)07-1574-04
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2016. 07. 030
Simultaneous Determination of Protocatechuic Acid，Kaempferol Biotin Glucoside and Quercitrin
in Ｒat Plasma and Pharmacokinetics By UPLC-MS /MS
ZHENG Lin1，2，YANG Wu1，XIANG Wen-ying1，SUN jia1，2，CHEN Si-ying1，2，LI Yong-jun2，3
(1. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics;2. School of Pharmacy;3. Engineering Ｒesearch Center for the Development
and Application of Ethnic Medicine and TCM，Ministry of Education，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China)
Abstract Objective:To develop a sensitive and reliable ultra performance liquid chromatography tandem mass sepctrometry(UP-
LC-MS /MS)method for simultaneous determination and pharmacokinetics of protocatechuic acid，kaempferol biotin glucoside and quer-
citrin in rat plasma，and study their pharmacokinetic characteristics in rats. Methods:Three compounds were simultaneously determined
by UPLC-MS /MS on Waters BEH C18(50 mm × 2. 1 mm，1. 7 μm)column. The mobile phase was 0. 1% acetonitrile formic acid and
0. 1% aqueous formic acid，and programmed in a linear gradient mode. The compounds were ionized in the electrospray ionization ion
source of the mass spectrometer and detected in MＲM mode. Ｒesults:The t1 /2 of protocatechuic acid，kaempferol biotin glucoside and
quercitrin after intravenous injection were(41. 9 ± 12. 3)，(71. 3 ± 56. 8)and(90. 3 ± 74. 8)min. The Cmax were(1. 7 ± 0. 7)μg /mL，
(2. 1 ± 0. 9)μg /mL，(8. 7 ± 3. 7)μg /mL. Conclusion:The established method is specific，rapid，accurate and sensitive，and is proved to
meet the requirements of biological sample analyses，and is suitable for the concentration determination of protocatechuic acid，kaempfer-
ol biotin glucoside and quercitrin in rat plasma，three compounds are all best fitted to the two-compartment open pharmacokinetic mod-
el.
Key words UPLC-MS /MS;Pharmacokinetics;Extracts of flowers of Polygonum orientale
荭草花为蓼科植物红蓼 Polygonum orientale L.
的干燥花序，又名狗尾巴花、水荭花，在贵州地区广
泛分布，具有行气活血、消积、止痛等功效。民间主
要用于风湿疼痛、心胃气痛等疾病的治疗，对冠心
病、心绞痛疗效确切〔1-3〕。课题组自主研发的以荭草
花为主药的治疗心血管疾病的注射用复方荭草冻干
粉针获国家食品药品监督管理局批准并已完成了Ⅲ
期临床研究。为使荭草花提取物更好地得以开发和
推广，本研究运用 UPLC-MS /MS 建立大鼠血浆中原
儿茶酸、山柰素-葡萄糖苷和槲皮苷 3 种成分的检测
方法，探讨这 3 种成分的药动学参数，以期为临床合
理用药的安全性和有效性提供实验依据。
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1 仪器与材料
1. 1 仪器 超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱
联用仪(美国 Waters 公司);MTN-2800D 氮吹浓缩
装置(奥特塞恩斯仪器公司);TGL-16G 离心机(上
海安亭科学仪器厂);Allegra 64Ｒ 低温高速离心机
(美国 Beckman Coulter公司)。
1. 2 药物与试剂 实验用荭草花采自贵州省植物
园，经贵州医科大学生药学教研室龙庆德副教授鉴
定为蓼科植物红蓼 Polygonum orientale L. 的干燥花
序;荭草花提取物自制(批号:20100815);葛根素对
照品(批号:0752-9605)购自中国食品药品检定研究
院;原儿茶酸对照品(批号:1198-101018)购自中国
固体制剂制造技术国家工程研究中心;槲皮苷、山柰
素-葡萄糖苷对照品自制(质量分数≥98%);乙腈为
色谱纯(德国 Merck公司);其他试剂均为分析纯。
1. 3 实验动物 经检疫健康的 SD 大鼠，雌雄兼
用，体质量(250 ± 20)g，由贵州医科大学动物中心
提供，生产许可证号:SCXK(黔)2014-0001。
2 方法与结果
2. 1 色谱条件 Waters BEH C18(50 mm × 2. 1
mm，1. 7 μm)色谱柱;Waters Van Guard BEH C18(5
mm ×2. 1 mm，1. 7 μm)保护柱;柱温为 45 ℃;流动
相为 0. 1%甲酸乙腈(A)-0. 1%甲酸溶液(B)，梯度
洗脱(0 ～ 0. 5 min，12% A;0. 5 ～ 1. 2 min，12% ～
14% A;1. 2 ～ 3. 0 min，14% ～ 20% A;3. 0 ～ 3. 3
min，20% ～90% A;3. 3 ～ 4. 0 min，90% ～ 12% A);
流速为 0. 35 mL /min;进样体积为 1 μL;
2. 2 质谱条件 采用电喷雾电离源(ESI);毛细管
电离电压:3 kV;离子源温度:120 ℃;喷雾气与反吹
气:氮气，去溶剂气流速:650 L /h，去溶剂气温度:
350 ℃，反吹气流速:50 L /h;碰撞气:氩气，碰撞气
流速:0. 16 mL /min;扫描方式为多反应离子监测
(MＲM)。原儿茶酸:m/z(－)152. 9→109. 0、山柰
素-葡萄糖苷:m/z(－)449. 3→287. 1、槲皮苷:m/z
(－)449. 2→303. 1 及葛根素:m/z(+)417. 0→
267. 1。
2. 3 溶液的配制 取原儿茶酸、山柰素-葡萄糖苷
和槲皮苷对照品适量，精密称定，用甲醇溶解定容至
10 mL，得到原儿茶酸(1. 202 mg /mL)、山柰素-葡萄
糖苷(1. 216 mg /mL)和槲皮苷(1. 200 mg /mL)的对
照品储备液。精密称取适量葛根素对照品，加甲醇
配制成浓度为 2 μg /mL 的内标溶液，保存于冰箱
(－ 20 ℃)，备用。
2. 4 血浆样品制备方法 取 100 μL 大鼠血浆，置
于 1. 5 mL塑料离心管中，补加 50 μL 甲醇、20 μL
内标溶液、50 μL 1%甲酸、400 μL甲醇，涡混 1 min，
超声 5 min，离心 10 min(15 000 r /min)，取上清液，
并在氮气吹干(45 ℃)，用 500 μL甲醇溶解残留物，
超声 10 min，并涡混 1 min，离心 10 min(15 000 r /
min)，取上清液，氮气吹干(45 ℃);用 200 μL 初始
流动相溶解残留物，超声 10 min，常温离心 10 min
(15 000 r /min)，取上清液进行 UPLC-MS /MS分析。
2. 5 荭草花提取物溶液的制备 取荭草花药材，
加 10 倍量水煎煮 3 次，每次 1 h，滤过，合并滤液，减
压浓缩至相对密度 1. 05 ～ 1. 07 (50 ℃)，加乙醇至
溶液含醇量为 65%，搅拌均匀，静置 12 h，抽滤，滤
液减压回收乙醇并浓缩至相对密度 1. 04 ～ 1. 06 (50
℃)，用水饱和正丁醇萃取 4 次，合并正丁醇萃取
液，减压回收正丁醇，残留物加 80%乙醇溶解，上聚
酰胺柱，用 80%乙醇洗脱，收集流穿液和洗脱液，回
收乙醇，残留物真空干燥，得荭草花提取物，得膏率
为 1. 48%。加生理盐水配制成浓度为 13 mg /mL的
荭草花提取物溶液，给药剂量为 50 mg /kg。
2. 6 药代动力学试验 取 6 只健康 SD 大鼠，雌雄
兼用，给药前禁食 12 h(自由饮水);尾静脉注射荭
草花提取物溶液，给药剂量为 50 mg /kg。取空白血
后再给药，于给药后 5、10、20、30、60、90、120、180、
240、300 min 经尾静脉连续取血约 0. 4 mL，置于肝
素处理过的塑料离心管中，离心 5 min(4 500 r /
min)，取血浆保存于 － 20 ℃冰箱中，备用。按“2. 4”
项下方法制备样品，注入 UPLC-MS /MS 系统进行分
析。
2. 7 数据处理 内标法计算 3 种成分的血药浓
度，采用 DAS 2. 0 数据处理软件进行药代动力学参
数计算和数据拟合，AUC0→t、MＲT 等参数选用统计
矩方法计算。
2. 8 方法学考察
2. 8. 1 专属性:取 100 μL 大鼠空白血浆(不加内
标)，补加 50 μL甲醇，按“2. 4”项下方法操作，考察
大鼠空白血浆、空白血浆加内标和样品色谱图的专
属性，结果原儿茶酸、山柰素-葡萄糖苷和檞皮苷 3
种物质及内标各成分间分离良好，未见血浆中杂质
干扰。
2. 8. 2 线性关系:分别精密量取原儿茶酸、山柰素-
葡萄糖苷和槲皮苷的对照品储备液适量，用甲醇按
梯度稀释成所需浓度，获到系列浓度的混合对照品
溶液。保存于冰箱(－ 20 ℃)中，备用。
取 100 μL大鼠空白血浆，依次分别加入 50 μL
系列浓度混合对照品溶液和 20 μL 内标，按“2. 4”
项下方法制备样品，进样分析。建立标准曲线，以各
·5751·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 39 卷第 7 期 2016 年 7 月
物质浓度为横坐标 X，待测物的峰面积与内标峰面
积之比为纵坐标 Y。结果表明原儿茶酸、山柰素-葡
萄糖苷和檞皮苷 3 种成分线性关系良好，回归方程、
相关系数与线性范围分别为:原儿茶酸(Y1 =
2. 835X1 + 0. 0499，r1 = 0. 9981，0. 020 ～ 4. 81 μg /
mL);山柰素-葡萄糖苷(Y2 = 5. 477X2 + 0. 1342，r2 =
0. 9977，0. 55 ～ 134. 0 μg /mL);槲皮 苷 (Y3 =
6. 796X3 + 0. 2806，r3 = 0. 9947，0. 55 ～ 134. 0 μg /
mL)。原儿茶酸、山柰素-葡萄糖苷和槲皮苷的最低
检测限(S /N≥3)分别为 0. 020、0. 015、0. 049 μg /
mL，最低定量限分别为 1. 9、1. 5、3. 4 μg /mL。
2. 8. 3 准确度和精密度:按“2. 8. 2”项下操作，分
别配制原儿茶酸、山柰素-葡萄糖苷和檞皮苷 3 种成
分高、中、低 3 个浓度的大鼠血浆样品(QC)，每个浓
度平行配制 5 份，3 种浓度连续测定 5 d，计算原儿
茶酸、山柰素-葡萄糖苷和檞皮苷 3 种成分的日内和
日间精密度 ＲSD 均小于 15%，准确度范围为
86. 7% ～ 115. 6%，提示该方法准确、可靠、重现性
好。结果见表 1。
2. 8. 4 提取回收率和基质效应考察:取 100 μL大
表 1 大鼠血浆样品准确度、精密度、提取回收率、基质效应考察结果(珔x ± s，n =5)
检测成分 加入浓度 /(μg /mL) 准确度 /%
精密度 ＲSD /%
日内 日间
提取回收率 /% 基质效应 /%
原儿茶酸 0. 059 86. 7 ± 7. 8 9. 0 6. 0 88. 9 ± 10. 8 92. 7 ± 1. 8
0. 53 98. 7 ± 3. 6 3. 7 8. 7 91. 3 ± 2. 9 96. 2 ± 4. 3
4. 81 93. 0 ± 2. 9 3. 1 3. 6 91. 5 ± 3. 2 93. 1 ± 3. 0
山柰素-葡萄糖苷 0. 045 91. 8 ± 9. 1 9. 9 6. 2 78. 6 ± 5. 0 102. 8 ± 3. 7
0. 41 108. 4 ± 2. 9 2. 7 9. 0 82. 3 ± 8. 6 109. 0 ± 3. 6
3. 65 105. 7 ± 3. 5 3. 3 3. 8 85. 7 ± 1. 8 99. 3 ± 1. 6
槲皮苷 0. 15 100. 3 ± 4. 2 4. 2 9. 0 79. 4 ± 5. 1 108. 3 ± 9. 9
1. 33 115. 6 ± 10. 1 8. 8 14. 9 80. 0 ± 2. 3 100. 2 ± 5. 3
12. 0 102. 6 ± 3. 0 2. 9 4. 2 82. 8 ± 5. 5 100. 6 ± 2. 9
鼠空白血浆，按“2. 8. 2”项下分别配制高、中、低 3
个浓度的质控样品(QC)，每一浓度平行 5 份，按
“2. 4”项下操作得 A 样品。另外取 100 μL 空白血
浆，除不加混合对照品溶液和内标外，其余按“2. 4”
项下操作，取上清液加高、中、低浓度的混合对照品
溶液和内标，氮气下吹干，以 200 μL 初始流动相溶
解残留物得 B 样品;另取上述高、中、低浓度的混合
对照品溶液与内标，氮气下吹干，用 200 μL 初始流
动相溶解残留物得 C 样品。同样方法对内标进行
考察。B样品与 C样品的色谱峰面积之比即为基质
效应，B样品与 A样品色谱峰面积之比即为提取回
收率。高、中、低 3 个浓度下 3 种检测成分的提取回
收率和基质效应结果见表 1。结果表明提取回收率
良好，不存在明显的基质效应。
2. 8. 5 稳定性:按“2. 8. 2”项下方法操作，分别配
制原儿茶酸、山柰素-葡萄糖苷和檞皮苷 3 种成分的
低、中、高 3 个浓度的大鼠血浆质量控制样品(QC)，
样品处理后至自动进样器中，在 0 和 6 h 分别进样，
以每个浓度测定 3 次。同法配制质量控制样品
(QC)，分别在室温下(约 20℃)放置 6 h，冷藏 8 h(4
℃以下)，冻融 3 次，以每个浓度测定 3 次。结果表
明原儿茶酸、山柰素-葡萄糖苷和檞皮苷 3 种成分的
处理后血浆样品于自动进样器中 0 和 6 h 均稳定，
且 3 种成分血浆样品在室温下放置 6 h、于 4 ℃下冷
藏 12 h和经 3 次冻融循环均稳定，结果见表 2。
2. 9 药物动力学试验 大鼠静脉注射荭草花提取
表 2 大鼠血浆样品稳定性考察结果(珔x ± s，n =3)
检测成分 加入浓度 /(μg /mL)
检测浓度 /(μg /mL)
进样器 室温 冷藏 冻融
原儿茶酸 0. 059 0. 055 ± 0. 002 0. 054 ± 0. 001 0. 043 ± 0. 002 0. 048 ± 0. 002
0. 53 0. 54 ± 0. 028 0. 50 ± 0. 01 0. 45 ± 0. 01 0. 48 ± 0. 03
4. 81 4. 29 ± 0. 13 4. 45 ± 0. 12 4. 19 ± 0. 16 4. 28 ± 0. 13
山柰素-葡萄苷 0. 045 0. 048 ± 0. 008 0. 042 ± 0. 006 0. 43 ± 0. 008 0. 47 ± 0. 011
0. 41 0. 45 ± 0. 01 0. 45 ± 0. 01 0. 43 ± 0. 02 0. 45 ± 0. 03
3. 65 3. 81 ± 0. 17 3. 84 ± 0. 19 4. 03 ± 0. 11 3. 94 ± 0. 10
槲皮苷 0. 15 0. 16 ± 0. 01 0. 15 ± 0. 01 0. 16 ± 0. 01 0. 16 ± 0. 007
1. 33 1. 36 ± 0. 11 1. 51 ± 0. 06 1. 48 ± 0. 07 1. 58 ± 0. 07
12. 0 12. 2 ± 0. 26 12. 3 ± 0. 25 12. 3 ± 0. 48 12. 5 ± 0. 32
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物后，原儿茶酸、山柰素-葡萄糖苷和檞皮苷 3 种成
分的血液浓度见表 3。用 DAS2. 0 软件分析药动学
参数并对药物在大鼠体内的动力学过程进行拟合，
其结果表明原儿茶酸、山柰素-葡萄糖苷和檞皮苷 3
个成分在大鼠体内符合二室模型，其相关药动学参
数见表 4。
表 3 含药血浆中 3 种成分的浓度测定结果(珔x ± s，n =6)
时间 /min 原儿茶酸 山柰素-葡萄糖苷 槲皮苷
5 1. 578 ± 0. 705 1. 927 ± 0. 857 8. 739 ± 3. 654
10 0. 664 ± 0. 368 0. 848 ± 0. 598 3. 846 ± 2. 162
20 0. 407 ± 0. 265 0. 535 ± 0. 485 2. 463 ± 1. 644
30 0. 312 ± 0. 264 0. 431 ± 0. 482 2. 021 ± 1. 759
60 0. 206 ± 0. 223 0. 330 ± 0. 413 1. 447 ± 1. 453
90 0. 153 ± 0. 159 0. 312 ± 0. 276 0. 972 ± 1. 025
120 0. 145 ± 0. 175 0. 308 ± 0. 334 0. 941 ± 1. 235
180 0. 122 ± 0. 147 0. 213 ± 0. 252 0. 749 ± 1. 079
240 0. 041 ± 0. 035 0. 061 ± 0. 059 0. 254 ± 0. 303
300 0. 036 ± 0. 037 0. 049 ± 0. 067 0. 249 ± 0. 340
表 4 3 种成分在大鼠体内的主要药动学参数(珔x ± s，n =6)
药动学参数 原儿茶酸 山柰素-葡萄糖苷 槲皮苷
AUC0→t /［min /(μg·mL)］ 56. 7 ± 43. 6 73. 2 ± 68. 6 346. 1 ± 292. 6
AUC0→∞ /［min /(μg·mL)］ 60. 3 ± 46. 4 93. 8 ± 90. 7 395. 0 ± 321. 6
MＲT0→t /min 43. 0 ± 21. 4 50. 3 ± 34. 5 60. 0 ± 32. 5
MＲT0→∞ /min 47. 0 ± 22. 9 58. 9 ± 23. 1 64. 8 ± 34. 1
t1 /2z /min 41. 9 ± 12. 3 71. 3 ± 56. 8 90. 3 ± 74. 8
CLz /［L /(min /kg)］ 0. 015 ± 0. 012 0. 012 ± 0. 011 0. 011 ± 0. 008
Vz /(L /kg) 0. 61 ± 0. 35 0. 56 ± 0. 24 0. 85 ± 0. 52
Cmax /(μg /mL) 1. 7 ± 0. 7 2. 1 ± 0. 9 8. 7 ± 3. 7
3 讨论
3. 1 本实验建立了 UPLC-MS /MS 测定大鼠尾静脉
注射荭草花提取物后的多指标成分的药代动力学实
验方法。通过方法学验证，此方法对原儿茶酸、山柰
素-葡萄糖苷和槲皮苷 3 种成分可快速、灵敏、准确
的同时测定。
3. 2 在选择样品处理方法时，根据所测成分的极
性及溶解性分别考察了甲醇、乙醇、乙腈等蛋白沉淀
剂，并发现甲醇的沉淀效果较好且无内源性物质干
扰。血浆的前期处理是药动学研究的一个重要步
骤，同时也是一个复杂的过程，直接关系到样品的测
定结果。由于样品量大，为缩短实验周期，提高实验
效率，课题组选择甲醇沉淀直接进样的方法，考虑到
对色谱柱使用寿命的因素后改成甲醇沉淀后用 N2
吹干，再用甲醇复溶的二次沉淀蛋白方法，避免了未
除净的蛋白冷冻时变性凝结的现象。被测成分原儿
茶酸、山柰素-葡萄糖苷和槲皮苷均为极性较大的弱
酸性化合物，在酸性条件下处于非解离状态，有利于
被测成分的提取。因此对在血浆样品处理中是否加
酸及加酸的种类进行了考察，实验结果表明，加酸后
明显有利于被测成分的提取;同时不同的酸对其提
取效率也不同(甲酸、盐酸、磷酸)，其中甲酸的效果
最好，因此笔者在处理样品时加入了 50 μL 1%甲
酸。
3. 3 大鼠静注荭草花提取物后，原儿茶酸、山柰素-
葡萄糖苷和槲皮苷 3 种成分平均滞留时间
(MＲT0→t)分别为(43. 0 ± 21. 4)min、(50. 3 ± 34. 5)
min和(60. 0 ± 32. 5)min，在大鼠体内消除较快;3
个成分的半衰期(t1 /2z)依次增加，分别为(41. 9 ±
12. 3)min、(71. 3 ± 56. 8)min 和(90. 3 ± 74. 8)min;
同时 3 个成分的清除率(CLz)、分布容积(Vz)参数
差异均较小，表明静注给予荭草花提取物后原儿茶
酸、山柰素-葡萄糖苷、槲皮苷 3 个成分在大鼠体内
过程相近。
参 考 文 献
［1］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会 . 中华本草
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［2］贵州省药品监督管理局编 . 贵州省中药材、民族药材质
量标准［S］．贵阳:贵州科技出版社，2003:267.
［3］李月婷，胡杰，谢玉敏，等 . 荭草花不同制备工艺样品对
犬急性心肌缺血的保护作用［J］．中药材，2015，38(1):
115-118.
·7751·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 39 卷第 7 期 2016 年 7 月