全 文 ：57※工艺技术 食品科学 2011, Vol. 32, No. 02
柿叶黄酮化合物分离制备
孙化鹏 1，钟晓红 1,*，陆 英 1,2，周 舟 1
(1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；
2.湖南农业大学 湖南省天然产物工程技术研究中心，湖南 长沙 410128)
摘 要：应用高速逆流色谱法和制备型高效液相色谱法分离制备柿叶黄酮化合物并进行初步结构鉴定。采用乙酸乙
酯 -甲醇 -水(5:1:5，V/V)做溶剂系统，在主机转速 850r/min、流速 1.5mL/min、检测波长 254nm条件下进行HSCCC
分离纯化，所得流分浓缩干燥后再采用制备型HPLC分离制备柿叶黄酮化合物，所得产物采用HPLC检测并进行显
色反应、紫外图谱和质谱分析。结果表明，从柿叶粗提物中分离所得 4种化合物是以槲皮素和山奈酚为苷元的黄
酮苷类化合物。
关键词：柿叶；黄酮化合物；高速逆流色谱；制备型高效液相色谱；结构鉴定
Separation, Purification and Structural Analysis of Flavonoids from Diospyros kaki Leaves
SUN Hua-peng1，ZHONG Xiao-hong1,*，LU Ying1,2，ZHOU Zhou1
(1. College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China；
2. Hunan Provincial Research Center of Natural Products, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)
Abstract ：In this study, high-speed countercurrent chromatography (HSCCC) followed by preparative high performance liquid
chromatography (HPLC) was used to separate and purify flavonoid monomers from the crude ethyl acetate extract from
Diospyros kaki leaves. Meanwhile, the flavonoid monomers obtained were preliminarily identified by color development reaction
and further structurally characterized by UV spectroscopy and mass spectroscopy. The HSCCC separation of flavonoids was
achieved by using a solvent system composed of ethylacetate, methanol and water (5:1:5, V/V) at a flow rate of 1.5 mL/min and
setting the rotational speed at 850 r/min with a detection wavelength set at 254 nm. For further separation, the separated
fractions were then applied to preparative HPLC, and 4 flavonoid compounds, named A-Ⅱ, A-Ⅲ, B-Ⅱ and B-Ⅲ, were obtained.
A-II and A-III might be quercetin flavonoids, and B-Ⅱ and B-Ⅲ might be kaemoferol.
Key words：Diospyros kaki leaves；flavonoids；HSCCC；preparative HPLC；structural identification
中图分类号：R931.6 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)02-0057-05
收稿日期：2010-04-08
基金项目：长沙市科技局项目(K06095-22)
作者简介：孙化鹏(1983—)，男，硕士研究生，研究方向为功能成分分离纯化。E-mail：sunhuapeng11@163.com
*通信作者：钟晓红(1961—)，女，教授，博士，研究方向为药用植物资源工程。E-mail：xh-zhong@163.com
柿叶为柿(Diospyros kaki)的新鲜和干燥叶片，味
苦、性寒，具有较高的营养价值和药用功效，是我国
一味重要的中药资源[1]。柿叶中含有多种营养成分和功
效成分，现代的药理研究证明，柿叶黄酮化合物是其
药用功效中的主要活性成分[2-3]。柿叶黄酮化合物具有重
要的药理药效作用，当前国内外对柿叶黄酮化合物的药
理作用也做了一定程度的研究[4-7]。分离鉴定柿叶中的主
要黄酮化合物，明确其药效作用及各成分之间的协同效
应，对更进一步的明确柿叶的药效物质基础和充分开发
利用柿叶黄酮化合物的药效成分具有重要意义。本实验
应用高速逆流色谱对柿叶黄酮化合物主要成分进行初步
纯化分离，分离后的各流分再通过制备型高效液相色谱
分离制备柿叶黄酮化合物单体。所得产物经高效液相色
谱检测分析，并通过显色反应、紫外光谱和质谱进行
结构的初步鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
柿叶采自湖南省长沙市，品种为牛心柿树，经湖
南农业大学中药资源研究室鉴定为柿树叶片。
HSC CC 分离用溶剂(乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正
己烷、正丁醇、石油醚、磷酸等均为分析纯 )；制备
2011, Vol. 32, No. 02 食品科学 ※工艺技术58
型HPLC分离用溶剂(甲醇为分析纯)；HPLC分析用溶剂
(乙腈为色谱纯)；实验用水为超纯水。
1.2 仪器与设备
TBE-300A型高速逆流色谱仪(配有TBD-2000外检测
仪、LX-300恒温器和 TBP-50A恒流泵) 中国上海同田
生化技术有限公司；LC-8A制备型高效液相色谱仪(配有
Shin-pack PRC-DOC色谱柱、SPD-20A 检测器、SCL-10
AVP泵)、LC10 AT-VP Plus高效液相色谱仪 日本
Shimadau公司；Lab Tech可见 -紫外分光光度计 北京
莱伯泰科仪器有限公司；EASY pure Ⅱ纯水仪。
1.3 柿叶黄酮粗提物制备
称取干燥柿叶粉末若干，回流提取、过滤，合并
滤液并减压浓缩回收乙醇，得膏状提取物，加适量水
稀释后以等体积石油醚萃取 6 次后再以乙酸乙酯萃取 6
次，合并乙酸乙酯相，减压浓缩后蒸干，得乙酸乙酯
粗提物，即为柿叶黄酮粗提物，保存于冰箱中备用。
1.4 柿叶黄酮HSCCC分离纯化
HSCCC溶剂系统的选择主要是根据样品在两相溶剂
中的分配系数 K来选择。根据参考文献[8-10]选择一系
列溶剂系统，用HPLC分析方法测定样品在不同溶剂系
统中的分配系数 K，并通过实际 HSCCC分离实验来选
择分离效果最好的溶剂系统。
根据优选出的溶剂系统配制一定量的溶剂体系，充
分混匀后静置 8h使两相溶剂达到分离平衡。将分离平
衡的两相溶剂分离，超声脱气 30min，然后将作为固定
相的上相溶剂以20mL /min的速度泵入高速逆流色谱管路
中，当上相溶剂充满管路时，开启色谱柱以 850r/min正
向旋转，同时以 1.5mL/min的速度泵入作为流动相的下
相溶剂，在检测器出口处用量筒接收流出液。当流出
液为下相溶剂且流出稳定时，说明色谱柱中上、下相
分离已经达到平衡，记录量筒中被推出的上相溶剂的体
积，计算固定相在色谱中的保留率，此时称取柿叶黄
酮粗提物 200mg溶解于 15mL上相溶剂中，从进样口进
样，同时将检测器波长设置为 254nm，开启色谱工作站
采集图谱，根据色谱图分别收集不同流分，然后用高
效液相色谱检测各流分成分。
1.5 制备型HPLC分离制备
由于本实验所分离制备的柿叶黄酮化合物结构非常
相似，在通过高速逆流色谱(HSCCC)分离后很难得到单
一成分，所以实验将 HSCCC分离纯化的各流分应用制
备型高效液相色谱进行二次分离。将通过 HSCCC分离
纯化后的各流分收集、浓缩、干燥后，以少量甲醇溶
解，经 0.45μm滤膜过滤后即为样品溶液。然后应用制
备型高效液相色谱在 a和b项的色谱条件下分离制备柿叶
黄酮化合物成分。根据高效液相色谱图手动收集不同物
质峰峰尖部分，然后用分析型高效液相色谱分析检测各
流分主要成分，并按照峰面积归一法计算各物质纯度。
色谱条件 a：色谱柱：Shin-pack PRC-DOC色谱柱；
柱温：室温；检测波长 360nm；流速 15mL/min；进样
量 1mL；流动相为 28%甲醇等度洗脱。
色谱条件 b：色谱柱：Shin-pack PRC-DOC色谱柱；
柱温：室温；检测波长 360nm；流速 15mL/min；进样
量 1mL；流动相为 34%甲醇等度洗脱。
1.6 柿叶黄酮HPLC分析
对柿叶黄酮粗提物及经过HSCCC分离纯化和制备型
HPLC分离制备后的各个组分进行分析检测，色谱条件
如下：色谱柱为C18柱(4.6mm× 150mm，5μm)；柱温
30℃；检测波长 360nm；流速 1mL/min；进样量 20μL；
进行以流动相为乙腈 -0.1%磷酸溶液的二元高压梯度洗
脱，0～30min 15%乙腈，30～60min 20%乙腈，60～
70min 30%乙腈，70～85min 30%乙腈，85～90min 80%
乙腈。
1.7 柿叶黄酮结构初步鉴定
通过对分离制备所得产物进行显色反应、紫外图谱
特征和质谱分析，初步鉴定制备所得化合物的结构。
2 结果与分析
2.1 柿叶黄酮粗提物HPLC检测
图 1 柿叶粗提物 HPLC检测图谱
Fig.1 HPLC chromatogram of the crude ethyl acetate extract from
Diospyros kaki leaves
40000
35000
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
－5000
－10000
1
μ
V
0 10 20 30 40 50 60 70 80
2
3
4
56
7
8
9
10 11
12
时间 /min
如图 1所示，柿叶粗提物所含黄酮化合物主要有 12
种，并且在该方法下不同物质峰之间分离度较好。其
中 3、4、7、8、9、1 0 号峰所表示的物质在柿叶粗
提物中含量相对较高。
2.2 HSCCC分离纯化
本实验考察了多种溶剂体系，通过高效液相色谱法
测定其中主要化合物(即图 1 中 3、4、7、8、9、1 0
号峰所表示的物质)的 K 值，结果如表 1 所示。通过表
1所示K值可以看出，溶剂系统——正己烷 -乙酸乙酯 -
甲醇 -水(0.5:5:2:4，V/V)、正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水
(0.5:6:2:5，V/V)和正己烷 -正丁醇 -水(1:1:2，V/V)中主
要化合物的K值都在 0.5～2之间，理论上属于合适的溶
剂系统，然而在实际 HSCCC分离实验过程中，在这 3
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个溶剂系统下柿叶黄酮分离效果很差。综合K值选择结
果并结合实际 HSCCC分离效果，实验选用了综合分离
效果最好的溶剂系统乙酸乙酯 -甲醇 -水(5:1:5，V/V)，
虽然在该溶剂系统下没有实现各物质的完全分离，但分
离效果最好。
溶剂系统(体积配比)
K值
峰 3 峰 4 峰 7 峰 8 峰 9 峰 10
乙酸乙酯 -甲醇 -水(5:1:5) 1.65 1.75 1.92 3.06 2.39 1.89
正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水(1:5:1:5) 0.45 0.58 0.25 0.64 0.60 0.44
正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水(0.5:5:2:4) 0.73 0.76 0.92 1.08 1.28 1.45
正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水(1:5:3:3) 0.28 0.22 0.17 0.26 0.22 0.23
正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水(1:6:2:5) 0.43 0.41 0.54 0.65 0.75 0.89
正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水(0.5:6:2:5) 0.81 0.83 1.10 1.27 1.63 1.97
正己烷 -正丁醇 -水(1:1:2) 0.87 0.95 0.68 1.49 0.54 0.71
表 1 K 值分配的液相色谱表
Table 1 Effect of different solvent systems on the K values of six
major compounds in the crude ethyl acetate extract
通过分析，在优选出较合适的溶剂系统乙酸乙酯 -
甲醇 -水(5:1:5，V/V)后进行高速逆流色谱仪分离实验，
实验同时考察高速逆流色谱仪转速和流动相流速对分离
效果的影响。实验考察了转速为 750、800、850r/min
以及流动相流速 1、1.5、2mL/min各 3个水平，结果
表明转速越高时，固定相的保留率越高，分离效果越
好；而流动相流速对分离效果的影响是当流速较慢时，
分离时间长，分离效果较好，流速较快时，分离时间
短，但分离效果不是很理想。所以本实验选择了转速
850r/min、流动相流速 1.5mL/min为实际操作条件进行实
验。HSC CC 色谱图详见图 2。
图 2 柿叶黄酮粗提物 HSCCC图谱
Fig.2 HSCCC chromatogram of flavonoids from Diospyros kaki leaves
extraction
200.0
159.4
118.8
78.2
37.6
－ 3.0
流分Ⅰ
m
V
0 41 82 123 164 205 246 287 328 369 410
时间 /min
流分Ⅱ 流分Ⅲ
流分Ⅳ
由图 2可知，通过高速逆流色谱法分离得到 4个流
分，通过高效液相色谱分析检测各个流分的组成成分，
结果见表 2。各个流分的高效液相检测图谱详见图 3。
通过检测分析可知，经过高速逆流色谱分离后所得
到的 4 个流分均为混合物，没有达到单体分离的效果，
其主要原因是所要分离的柿叶黄酮化合物结构相似、极
性相近，使得各个物质在溶剂体系中的分配系数(K值)
非常接近，从而造成在实际的分离过程中的分离难度很
大。根据需要本实验应对收集的各个流分进行二次分
离，但通过高速逆流色谱进行二次分离已经很难实现单
体的分离，所以实验过程中采用分离效果更好的制备型
高效液相色谱分离法作为进一步分离实验的方法。
流分 流分Ⅰ 流分Ⅱ 流分Ⅲ 流分Ⅳ
化合物 化合物 1、2 化合物 3、4、5 化合物 7、8 化合物 9、10
表 2 HSCCC分离结果
Table 2 HSCCC separated fractions and their compound composition
图 3 不同 HSCCC 流分 HPLC图谱
Fig.3 HSCCC profiles of separated fractions
30000
20000
10000
0
－10000
－20000
3
μ
V
0 10 20 30 40 50 60 70
时间 /min
4
5
B.流分Ⅱ
12500
10000
7500
5000
2500
0
－2500
1
μ
V
0 10 20 30 40 50 60
时间 /min
2
A.流分Ⅰ
12500
10000
7500
5000
2500
0
μ
V
0 10 20 30 40 50 60
9
10
时间 /min
D.流分Ⅳ
25000
20000
15000
10000
5000
0
－5000
μ
V
0 10 20 30 40 50 60
7
8
时间 /min
C.流分Ⅲ
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2.3 制备型HPLC分离制备
实验过程中将通过HSCCC分离纯化后的流分Ⅰ和流
分Ⅱ混合收集、浓缩、干燥、过滤后得到样品 A，将
流分Ⅲ和流分Ⅳ混合收集、浓缩、干燥、过滤后得到
样品B。样品A在1.5节色谱条件 a下进行分离制备实验，
样品B 在 1.5节色谱条件 b下进行分离制备实验，并分
别收集各个流分。制备型高效液相色谱图详见图 4。
图 4 制备型 HPLC色谱图
Fig.4 Preparative HPLC profiles of HSCCC separated fractions
35
30
25
20
15
10
5
0
m
V
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
流分A-Ⅰ
时间 /min
样品A
流分A-Ⅱ
流分A-Ⅲ
流分A-Ⅳ
25
20
15
10
5
0
m
V
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
流
分
B
-Ⅰ
时间 /min
样品 B
流
分
B
-Ⅱ
流
分
B
-Ⅲ
样品 A 通过制备型高效液相色谱分离得到 4 个流
分；样品B通过制备型高效液相色谱分离得到 3个流分，
如图 4所示。所得各个流分利用高效液相色谱在分析检
测后可知，流分 A-Ⅰ、流分 A-Ⅳ、流分 B-Ⅰ为混合物
且主要化合物纯度不高；流分 A-Ⅱ、流分 A-Ⅲ、流分
B -Ⅱ、流分 B -Ⅲ分离效果较好、纯度较高，结果详见
表 3 。
流分 流分A-Ⅱ 流分A-Ⅲ 流分B-Ⅱ 流分B-Ⅲ
化合物号 4 5 7 8
纯度 /% 98.3 92.7 99.1 91.5
表 3 制备型高效液相色谱分离结果
Table 3 Preparative HPLC separated fractions and their purity
通过以上结果分析可知，柿叶黄酮粗提物经过
HSCCC和制备型HPLC两次分离后，能达到分离制备柿
叶黄酮化合物单体的效果。
2.4 柿叶黄酮结构初步鉴定
2.4.1 显色反应结果分析
A -Ⅱ、A -Ⅲ、B -Ⅱ、B -Ⅲ 4 种化合物显色反应结
果如表 4 所示，4 种化合物的盐酸 - 镁粉反应、氯化铝
反应、氢氧化钠反应均成阳性反应，并且锆盐 -枸橼酸
反应结果表明它们均含有 5-OH而不含 3-OH。即 A-Ⅱ、
A-Ⅲ、B-Ⅱ、B-Ⅲ 4种化合物可能是含有 5-OH的黄酮
类化合物。
化合物 化合物颜色 Mg-HCl AlCl3 ZrOCl2/C6H8O7 NaOH
A-Ⅱ 黄灰色 红色 黄色荧光 黄色加深 /褪去 黄色
A-Ⅲ 黄灰色 红色 -紫色 黄色荧光 黄色加深 /褪去 黄色
B-Ⅱ 黄色 红色 -紫色 黄色荧光 黄色加深 /褪去 黄色
B-Ⅲ 黄色 红色 黄色荧光 黄色加深 /褪去 黄色
表 4 A-Ⅱ、A-Ⅲ、B-Ⅱ、B-Ⅲ 4 种化合物显色反应结果
Table 4 Results of identification of preparative HPLC separated
fractions by color development reaction
2.4.2 紫外图谱特征结果分析
根据 A -Ⅱ、A -Ⅲ、B -Ⅱ、B-Ⅲ 4 种化合物紫外图
谱特征分析可知，A -Ⅱ、A -Ⅲ 2 种化合物紫外图谱特
征相似，甲醇溶液紫外图谱带Ⅰ的峰位分别在 361nm和
360nm，带Ⅱ的峰位都在 257nm；在加入诊断试剂甲醇
钠后，2种化合物带Ⅰ分别红移 47nm和 49nm且强度不
降，表明这两种化合物有 4＇-OH；在加入诊断试剂醋酸
钠 /硼酸后，带Ⅰ分别红移 19nm和 20nm，表明这两种
化合物 B 环有邻二酚羟基。
B-Ⅱ、B-Ⅲ 2种化合物紫外图谱特征也非常相似，
甲醇溶液紫外图谱带Ⅰ的峰位都在 351nm，带Ⅱ的峰位
都在 266nm；在加入诊断试剂甲醇钠后，2种化合物带
Ⅰ分别红移 51nm和 46nm且强度不降，表明这两种化合
物有 4＇-OH；在加入诊断试剂醋酸钠后，2种化合物带
Ⅰ分别红移 29nm和 18nm，带Ⅱ红移 8nm，表明这 2种
化合物有 7-OH和 4＇-OH，但无 3-OH；在加入诊断试剂
醋酸钠 /硼酸后，无明显变化，表明这两种化合物 B环
没有邻二酚羟基。
2.4.3 质谱结果分析
根据 A -Ⅱ、A -Ⅲ、B -Ⅱ、B -Ⅲ 4 种化合物 APCI-
MS(m/z)分别为 465[M+H]+、465[M+H]+、449[M+H]+、449
[M+H]+的结果分析可知 4种化合物的相对分子质量分别
为 46 4、46 4、44 9、44 9。
综合以上显色反应、紫外图谱、质谱分析结果并
结合文献[11-15]初步推断化合物A-Ⅱ、A-Ⅲ可能是以槲
皮素为苷元的黄酮苷类，B-Ⅱ、B-Ⅲ可能是以山奈酚为
苷元的黄酮苷类。
3 讨 论
由于柿叶中的黄酮化合物大多为相同苷元的黄酮苷
类，在结构和性质方面非常相似，分离制备十分困难。
本实验采用HSCCC和制备型HPLC法两次分离制备，最
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终从柿叶粗提物中分离制备了 4种黄酮化合物，为进一
步研究不同柿叶黄酮化合物药理药效提供基础。但这样
反复制备的过程损失较大，希望今后能筛选出通过
HSCCC或者制备型HPLC法一次分离制备柿叶黄酮化合
物单体的方法。
本实验对制备的 4种化合物进行了初步鉴定，所推
断结构不是十分确定，有待于用更准确的方法确定其结
构特征。
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