全 文 ：作者简介:蒋美红 ,女 ,硕士研究生　　＊通讯作者:高中洪 ,男 ,副教授 ,硕士生导师　　Tel:(027)87543532　　E-mail:zhgao144@hotmail.com
RP-HPLC测定金刚藤中薯蓣皂苷元的含量
蒋美红 ,高中洪＊ ,杨祥良(华中科技大学化学系 ,湖北 武汉 430074)
摘要:目的　建立金刚藤中薯蓣皂苷元的测定方法。方法　采用 RP-HPLC 测定薯蓣皂苷元的含量 , 色谱柱为 Lichrospher C18
(4.6 mm×250 mm , 5μm), 流动相为甲醇 ,检测波长为 210 nm , 峰面积外标法定量。采用正交设计 , 考察发酵时间(A)、 水解时
间 (B)、 硫酸浓度(C)3 个因素对薯蓣皂苷水解的影响。结果　薯蓣皂苷元在 50～ 350μg·mL-1内具有良好的线性关系(r=
0.999 1 , n=7),平均回收率为 99.97%, RSD=0.85%(n=5)。采用发酵 72 h 后用浓度为 5%的硫酸水解 6 h ,可使金刚藤中薯
蓣皂苷水解完全。结论　RP-HPLC 是一个简便 、快速 、分离效果好 、精密度高 、准确度好的测定金刚藤中薯蓣皂苷元的方法。
发酵对水解产率影响显著。
关键词:薯蓣皂苷元;金刚藤;正交设计;反相高效液相色谱法
中图分类号:R284.2　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-2494(2005)04-299-03
RP-HPLC determination of diosgenin in Smilax china L.
JIANG Mei-hong ,GAO Zhong-hong＊ ,YANG Xiang-liang(Department of Chemistry , Huazhong University of Science and Technology ,
Wuhan 430074 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　To establish a method for determining diosgenin in Smilax china L.METHODS　A Lichrospher C18(4.6 mm
×250 mm , 5μm)column was used with methand as the mobile phase.The detection wavelength was at 210 nm.An external standardization
method was used.Three factors on dioscin hydrolysis , i.e.zymolysis time(A), hydrolysis time(B), the concentration of sulfuric acid(C)were
studied by orthogoral design.RESULTS　The linear range of 50 ～ 350μg·mL-1(r=0.999 1 , n=7)and an average recovery of 99.97%,
RSD=0.85%(n=5)were obtained.The optimum hydrolytic condition included zymolysis for 72 h and hydrolysis for 6 h with 5% sulfuric
acid.CONCLUSION　RP-HPLC is a simple , rapid and reliable method for diosgenin determination in Smilax china L.Zymolysis is the most
critical factor on the hydrolytic yield of diosgenin.
的比值未见性别差异 ,年龄的差异无显著性意义 ,可
能由于样本数量有限所致 。两者的比值变化范围较
大 ,对于未使用HC 的患者 ,24 h尿液中6β-OHC/ HC
的数值在 1.26 ～ 17.41间变化 ,对于使用 HC 的患
者 ,振幅有所减小 ,其比值在 0.67 ～ 2.51之间波动 。
从理论上分析 , 6β-OHC/HC 的数值越大 , 表明
CYP3A酶的活性越高 ,其所代谢药物的速率越快 ,
反之亦然。以接近 6.23为标准 ,若比值偏差较大 ,
可相应调整经 CYP3A代谢药物的使用剂量 。
文献[ 5]报道 ,24 h尿液中 6β-OHC/HC的数值为
(7.82±3.99),给予 300 mg HC后 6β-OHC/ HC 的数
值为(1.02±0.45)(n =29), 也与本实验的结果相
近。另外 ,尚可采用测定定时尿(如晨尿)、唾液和血
浆中 6β-OHC/HC 来表达 CYP3A的活性[ 6] ,各样品
间数据有较好的相关性 ,但 24 h尿液样品的数值较
为稳定 ,重复性较好 。结果表明 ,此方法灵敏可靠 、
简便迅速 ,可满足人体生物样品检测的要求 ,本法的
建立为进一步研究药物代谢与 CYP3A4酶活性间的
联系奠定了基础。
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(收稿日期:2004-06-23)
·299·中国药学杂志 2005年 2月第 40卷第 4期　　　　　　　　　　 Chin Pharm J , 2005 February , Vol.40 No.4
KEY WORDS:diosgenin;Smilax china L.;orthogoral design;RP-HPLC
　　金刚藤为百合科菝葜属植物菝葜的根茎 ,菝葜
属植物全世界共约 350种 ,主要分布于全球热带地
区 ,中国有 60种及一些变种[ 1～ 2] 。药理研究表明金
刚藤具有消肿止痛 、祛风利湿 、活血化瘀及抗肿瘤等
作用 ,临床单用或与其他药物配伍用于各种炎症性
疾病的治疗 ,如妇科盆腔炎及炎症性包块 、前列腺
炎 、类风湿性关节炎及各种肿瘤等 ,均取得较好疗
效[ 3 ～ 4] 。金刚藤中主要含有甾体皂苷元及其苷 ,此
外还含有一些黄酮类 、生物碱类等成分[ 1] 。目前 ,多
以薯蓣皂苷元或其苷含量作为控制金刚藤制剂质量
的指标 ,测定的方法主要采用薄层扫描法和分光光
度法[ 5～ 6] 。这些方法操作麻烦费时 ,不易控制 ,而有
关金刚藤中薯蓣皂苷元的高效液相色谱法测定笔者
尚未见报道。本实验探索了金刚藤样品预处理的最
佳水解条件 ,以及 RP-HPLC测定条件 ,实现了对金
刚藤中薯蓣皂苷元的准确分析 。
1　仪器与试药
1.1　仪器
Agilent1100 高效液相色谱仪(美国安捷伦公
司),G1314A 紫外检测器 ,Agilent1100色谱工作站 ,
微孔滤膜(0.45 μm)。
1.2　试药
薯蓣皂苷元对照品(mp 202 ～ 204℃,中国药品
生物制品检定所 ,批号 1539-200001),金刚藤生药材
(由湖南植物研究所提供 ,由华中科技大学药物研究
所韩定献副研究员鉴定 ,为金刚藤 Smilax china L.),
甲醇(色谱纯),其他试剂均为分析纯。
2　实验方法
2.1　色谱条件
色谱柱:Lichrospher C18柱(江苏汉邦科技有限公
司 ,250mm×4.6mm ,5μm);流动相:甲醇;流速:1 mL
·min-1;柱温:室温;检测波长:210 nm;进样量20μL。
2.2　溶液的配制
2.2.1　对照品溶液的配制　精密称取薯蓣皂苷元
对照品 25.0 mg ,置 25 mL 量瓶中 ,加流动相溶解并
稀释至刻度 ,摇匀 ,精密移取 2 mL至 10 mL量瓶中 ,
用流动相定容至刻度 ,摇匀 ,即得含薯蓣皂苷元 200
μg·mL-1的对照品溶液 。
2.2.2　供试品溶液的配制　金刚藤生药材经干燥
粉碎后 ,准确称取 3 g 置 100 mL 的锥型瓶中 ,加 50
mL 水 ,放入 39℃恒温箱中发酵 72 h ,加入硫酸使其
浓度达 5%,然后在 90℃水浴中常压水解 6 h ,冷却
后过滤 ,残渣用蒸馏水洗至中性 ,放入 60℃烘箱中
烘干 ,置索氏提取器中用氯仿-甲醇=(9∶1)的混合
溶剂提取7 h ,回收溶剂至干 ,残渣用流动相溶解 ,定
容在25 mL量瓶中 ,摇匀 ,0.45μm微孔滤膜过滤 ,取
续滤液作为供试品溶液 。对照品溶液与供试品溶液
均进样 20μL ,记录峰面积 ,按外标法计算含量。
3　结　果
3.1　正交试验法对金刚藤水解条件的优选
选定发酵时间 、水解时间 、硫酸浓度作为考察因
素 ,每个因素各取 3个水平 ,以薯蓣皂苷元含量(峰
面积)为评价指标 ,应用 L9(34)正交表安排试验 。因
素水平表见表1 ,筛选结果见表 2 ,3。
表 1　因素水平表
Tab 1　Levels of factors
水平 因素
A(发酵时间)/ h B(水解时间)/h C(硫酸浓度)/ %
1 24 3 3
2 48 6 5
3 72 9 7
表 2　正交试验结果
Tab 2　Results of orthogoral design
试验号 A(发酵时间)
B
(水解时间)
C
(硫酸浓度)
D
(空)
薯蓣皂苷元含量
(峰面积)
1 1 1 1 1 95.5
2 1 2 2 2 195.7
3 1 3 3 3 159.5
4 2 1 2 3 206.9
5 2 2 3 1 246.4
6 2 3 1 2 191.2
7 3 1 3 2 332.1
8 3 2 1 3 305.4
9 3 3 2 1 344.5
K1 450.7 634.5 592.1 686.4
K2 644.5 747.5 747.1 719.0 T2/9=479 417.8
K3 982.0 695.2 738.0 671.8
R 531.3 113.0 155.0 47.2
表 3　方差分析表
Tab 3　Variance analysis
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F P
A 48 193.8 2 24 096.9 123.8 <0.01
B 2 132.0 2 1 066.0 5.5 >0.05
C 5 043.8 2 2 521.9 13.0 >0.05
D 389.32 2 194.6
直观分析和方差分析表明:因素中发酵时间 A对水
解产率的影响高度显著(P <0.01),其次为硫酸浓
度 。经过分析 ,优化后的最佳条件为 A3B2C2 ,即金
刚藤生药材水解的最佳条件为:在 39℃恒温箱中发
酵 72 h ,后加硫酸使其浓度达 5%,在 90℃水浴中常
压水解 6 h 。
3.2　系统适应性实验
·300· Chin Pharm J , 2005 February , Vol.40 No.4 　　　　　　　　　　　 中国药学杂志 2005年 2月第 40卷第 4期
按“2.1”色谱条件分别进样 20 μL 对照品溶液
和供试品溶液 ,薯蓣皂苷元峰的保留时间为 9.9 min
左右 ,主成分和相邻杂质峰得到良好的分离 ,分离度
大于 2 ,对照品和供试品的色谱图见图 1。
图 1　薯蓣皂苷元对照品和样品色谱图
a-薯蓣皂苷元对照品;b-样品;1-薯蓣皂苷元
Fig 1　Chromatograms of diosgenin standard and sample
a-diosgenin standard;b-sample;1-diosgenin
3.3　线性范围
精密称取薯蓣皂苷元对照品 25.0 mg ,置 25 mL
量瓶中 ,加流动相溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,精密移
取0.5 ,1.0 ,1.5 ,2.0 ,2.5 ,3.0 ,3.5 mL至 10 mL 量瓶
中 ,用流动相定容至刻度 ,摇匀 ,按“2.1”色谱条件进
样 ,以对照品浓度(μg·mL-1)为横坐标(X),主峰面
积为纵坐标(Y)作图 , 一元线性回归方程为 Y =
7.1836X+119.23 , r=0.999 1 ,线性范围为 50 ～ 350
μg·mL-1 。
3.4　精密度实验
取上述薯蓣皂苷元对照品溶液连续进样 5次 ,
每次 20μL ,测得各次峰面积的 RSD为 0.24%。结
果表明 ,此分析方法精密度良好。
3.5　溶液稳定性实验
将同一对照品溶液在室温下考察 5 d ,测得日内
与日间精密度(RSD)分别为 0.77%, 1.96%。结果
表明 ,薯蓣皂苷元的甲醇溶液在5 d内稳定。
3.6　方法重复性实验
取同一批号样品 5份 ,按“2.2.2”项下操作 ,测
得薯蓣皂苷元的含量为 0.055 6%,测定结果 RSD为
1.86%。
3.7　加样回收率实验
精密称取已测含量的金刚藤生药材粉末 ,精密
加入对照品若干 ,按“2.2.2”项下操作 ,测定其含量 ,
计算加样回收率 ,结果平均回收率为 99.97%, RSD
为0.85%(n=5)。
3.8　样品含量的测定
按“2”项下的有关方法测定不同金刚藤生药材
中薯蓣皂苷元含量 ,测定结果见表 4。
表 4　金刚藤生药材中薯蓣皂苷元的含量.%, n=3
Tab 4　Contents of diosgenin in Smilax china L.%, n=3
样品编号 平均含量 RSD
1 0.041 5 1.47
2 0.055 6 0.63
3 0.068 6 0.77
4　讨　论
薯蓣皂苷是金刚藤制剂的指标性成分 ,薯蓣皂
苷无紫外吸收 ,而其水解产物薯蓣皂苷元有紫外末
端吸收。为测定其含量 ,文献[ 7]报道选用 210 nm紫
外末端吸收 ,效果较好。都述虎等[ 8]考察了流动相
用甲醇-水为90∶10及 95∶5的溶剂系统 ,发现它们均
可较好分离薯蓣皂苷元 ,但保留时间太长 。本实验
试用了不同流动相 ,最后选用甲醇 ,纯甲醇保留时间
为 10 min左右 ,且主峰与相邻峰分离度大于 2 ,已达
到了色谱分离的要求。同时还比较了不同流速对分
离效果的影响 ,最后选用了流速为 1 mL·min-1 ,该
条件保留时间适中 ,分离效果好。考虑到乙腈的费
用 ,故本实验中未选用乙腈为流动相 。
金刚藤中薯蓣皂苷元的测定 ,关键是要使生药
中的薯蓣皂苷完全转化为皂苷元 ,而转化的关键 ,是
水解时间及水解酸度 。另外 ,有文献报道[ 9]水解前
先发酵 ,可提高皂苷元的提取率 ,其原因可能是在该
温度下 ,一些微生物起了作用 ,另外发酵也使其充分
溶胀 ,更容易水解 。基于上述原因 ,我们采用正交实
验 ,得到了最佳处理工艺 ,按这个工艺 ,金刚藤中的
薯蓣皂苷基本上转化为薯蓣皂苷元 ,从而保证了分
析的准确性 。
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(收稿日期:2004-06-30)
·301·中国药学杂志 2005年 2月第 40卷第 4期　　　　　　　　　　 Chin Pharm J , 2005 February , Vol.40 No.4