全 文 ：三峡七叶一枝花薯蓣皂苷元的分离提取工艺研究
李于善 , 　周　强 , 　张玉针 , 　黄春迎
(三峡大学化学与生命科学学院 ,湖北宜昌 443002)
摘　要:以薯蓣皂苷元的提取量为考察指标 ,采用正交实验法对三峡七叶一枝花中薯蓣皂苷元的提
取工艺进行优选 ,以分光光度法测定其含量。结果表明:破壁处理对薯蓣皂苷元得率影响最大 ,助
提方式影响最小 。采用酶酵解(纤维素酶用量 15 u/g 生药 , pH4.5 ,温度45°C ,酵解6 h),微波助提
(微波强度为中高火 ,固∶液为 1∶14 ,提取 2次 ,每次 4 min),双相酸水解(料∶酸液∶甲苯=1∶6
∶6 , 6%的硫酸 ,100°C酸解 6 h)联合技术 ,苷元得率提高了 77.2%,工艺时间缩短了66.7%,溶剂
耗量减少了 12倍物料的 70%乙醇。
关键词:七叶一枝花;薯蓣皂苷元;微波提取;双相酸解
中图分类号:TQ 028.3　　　文献标识码:A
文章编号:0367-6358(2009)02-0086-04
Studies on the Ex traction Process of Diosgenin f rom Paris
Polyphy lla from China T hree Gorges
LI Yu-shan , 　ZHOU Qiang , 　ZHANG Yu-zhen , 　HUANG Chun-ying
(Col lege o f Chemist r y an d Li f e S cience , Ch ina Three Gorges Universi ty , H ubei Y ich ang 443002 , China)
Abstract:The ex t ract ion o f dio sgenin f rom Paris polyphy lla was studied.The o rthogonal de sign w as used
to optimize the ex traction process of diosgenin f rom Paris Vietnamensis.The ex t raction ratio w as
measured by spect ropho tome try.The results show ed that adopting the combined technologies of
enzymoly sis(15u cel lulase anzyme for 1 g Paris Vietnamensis , enzymo ly sis temperature 45°C , enzymic
t reatment at pH 4.5 fo r 6 h), microw ave ex t raction (microw ave pow er 100%, so lid:wate r =1∶14 ,
ext ract ing 2 t imes , 4 minutes each time)and acidoly sis in tw o phases material:6% H 2SO4 :to luene =
1∶6∶6 , acidoly sis at 100°C for 6 h), the yield of dio sgenin w as increased by 77.2%, the ex traction t ime
w as reduced by 66.7% and the solvent 70% alcohol w as saved in a large quantity.
Key words:Paris polyphy l la;dio sgenin;microw ave ext raction;acidoly sis in tw o phases
收稿日期:2008-04-10;修回日期:2008-10-21
作者简介:李于善(1963～ ),男 ,副教授 ,主要从事电化学分离 , Tel:13396140647。
　　七叶一枝花(Paris polyphy lla),又名南重楼 、
蚤休等 ,属百合科植物。作为传统中药 ,具有清热解
毒 、消肿止痛 、凉肝定惊之功效。经现代药理研究 ,
七叶一枝花皂苷具有抗肿瘤 、消炎 、抑菌 、镇静 、止血
等作用 。此外 , 七叶一枝花皂苷的主要酸解产
物———薯蓣皂苷元 ,是合成甾体激素和避孕药的主
要前驱体 。本实验 ,以产于三峡库区的七叶一枝花
块根为原料 ,对其中的薯蓣皂苷元的提取工艺进行
了优化研究 ,用分光光度法测定其薯蓣苷元的含量 ,
考虑其苷元得率和工艺流程在工业生产中的可行
性 ,确定了最佳工艺 ,为三峡库区的七叶一枝花植物
资源的开采利用以及工业化生产提供了参考资料。
1　实验部分
1.1　仪器与材料
·86· 化　　学　　世　　界　 2009 年
UV2265型分光光度计 ,实验用微波萃取器为
惠尔浦 VIP272 双重微波系统家用微波炉改造而
成 ,其基本框架与家用微波炉类似 ,可调功率 ,有时
间设置 ,可用酒精温度计测量温度 ,在微波炉顶部开
有小孔 ,以便安装回流冷凝管 ,为防止微波泄漏 ,在
开孔处加装了 11 cm 长的不锈钢管作截止波导;电
子分析天平(精确至 10-4 g), pHS-2S 型 pH 计 ,恒
温电热套 ,恒温水浴锅 ,电动粉碎机 ,旋转蒸发仪 ,索
式提取器 ,循环水真空泵 ,七叶一枝花块根(产于三
峡库区),纤维素酶(酶活力≥15 u/g), Liebe rmann-
Barchard试剂 ,分析纯的乙酸酐与浓硫酸以 19∶1
体积比混合备用 。其它试剂均为分析纯 。
1.2　七叶一枝花干燥粉末的制备
将七叶一枝花根茎切片置于80°C恒温箱中 24
h ,烘干后于粉碎机中粉碎 ,过40目筛 ,密封保存 ,备
用。
1.3　薯蓣苷元对照品的制备及验证
准确称取干燥的七叶一枝花根茎粉末 50 g ,于
250 mL 圆底烧瓶中 ,加 300 mL 70%乙醇于恒温电
热套中回流提取 2 次 ,每次 2 h。合并滤液 ,于旋转
蒸发仪中浓缩至 50 mL ,乙醚萃取 3次后加正丁醇
萃取 3次 ,合并萃取相 ,浓缩蒸干 ,即得总皂苷粗提
物 ,取少许粗制皂苷 , 以几滴乙酸酐溶解 , 加入
Liebennann-Barchard试剂数滴 ,皂苷变成绿色 ,另
取少许总苷溶于少量乙醇中 ,将醇液滴在滤纸上 ,喷
洒 25%三氯醋酸乙醇溶液 ,挥干试剂后 ,加热滤纸
到60°C时显现红色。以上两个呈色反应均能说明粗
提物中含有甾体皂苷。向剩余总苷粗提物中加 50
mL 6%硫酸溶液 ,于恒温电热套中至120°C酸解 4
h ,冷却后用石油醚(bp60 ～ 90°C)萃取 5 次。 30
mL/次 ,合并萃取液 ,水洗至中性 ,回收醚层 ,于水浴
上浓缩 ,冷却 ,静置 ,析晶。将析出的晶体溶于少量
热的石油醚 ,静置 ,析晶(如此重复 ,结晶 4次)。于
105°C烘箱中烘干晶体至恒重 。即得精制薯蓣皂苷
元。
1.4　标准曲线的绘制
精确称取上述对照品 9.7 mg ,于50 mL 容量瓶
中 ,用氯仿定容至刻度线。以硅胶 G 铺板 ,自然干
燥后放入105°C烘箱中活化 30 min ,展开剂分别为
石油醚(bp60 ～ 90℃)-乙酸乙酯(4∶1),氯仿-乙醇
(95∶5),氯仿-乙酸乙酯(9∶1)。取试样溶液 1 mL
稀释 10倍后点样 , 10%硫酸喷雾显色 。结果显示 ,
三快板上均能得到较好的黄色均一斑点。如此说
明 ,上述对照品中薯蓣皂苷元纯度较高。七叶一枝
花中甾体皂苷的苷元以元苷苷元为主 ,其他苷元微
量 ,但不排除上述对照品中可能还含有少量偏诺皂
苷元 ,因其只是在薯蓣皂苷元结构上增加了一个羟
基 ,硅胶薄层上具有相同的 R f 值[ 1] 。精密量取上
述溶液 0.0 ,1.0 ,2.0 ,3.0 ,4.0 , 5.0 ,6.0 mL 分别置
于 25 mL 容量瓶中 ,加 CHCl3 稀释至 14 mL 左右。
加入 10 mL Liebermann-Barchard 试剂 , 摇匀 , 用
CHCl3 滴加至刻度线 ,塞上塞子 , 50°C恒温水浴显
色 40 min ,取出冷至室温。空白试剂作对照 , 460
nm 处进行比色测定[ 2] 。其吸光度分别 0.1046 ,
0.2101 ,0.3147 ,0.5238 ,0.6284 。根据最小二乘法 ,
得一元线性回归方程为 y =0.000 353 666+0.018
593 4 x , r=0.999 9。(x 为浓度 10-6 g/mL , y 为吸
光度)。
1.5　样品浓度的测定
准确称取七叶一枝花根茎粉末 10 g ,选择正交
表(表 1)中的不同技术 ,经破壁 ,提取 ,酸解后 ,最终
将含有苷元的浓缩液用氯仿定容至 250 mL 容量瓶
中 ,取出 1 mL 照 1.4方法显色测其吸光度 ,代入回
归方程计算苷元得率。
1.6　单因素优化
1.6.1　破壁方式优化
1.6.1.1　微波破壁技术条件优化
①以物料含水率 ,微波功率及破壁时间为 3因
素 ,每因素取 3水平 ,作如下因素水平表。
表 1　微波破壁技术因素水平
水平 含水率 A/% 微波强度 B 破壁总时间 C/min
1 10 低火 3
2 20 中火 4
3 30 中高火 5
　　②据表 1选择不同的因子水平 。微波处理后 ,
向料液中加 100 mL 水 ,微波中高火提取 5 m in(单
次辐射 1 min ,冷至室温后辐射 1 min , 共辐射 5
min)。小心取出微波提取后的提取液 50 mL ,水浴
上挥发尽溶剂 ,得皂苷粗提物 ,于恒温箱中干燥至恒
重 ,称量 。
　　据表 2 可得优化水平为 A3B3C1 ,即含水率为
30%,微波中高火破壁 3 min ,因素的影响强弱为:
微波强度>含水率>破壁时间(因破壁时间对其几
乎无影响 ,故选用 3 min)。
③同理可得预发酵优化水平:40°C条件下预发
酵 16 h[ 3] 。
④同理可得酶酵解优化水平:纤维素酶用量
15u/g 生药 ,酶解 pH =4.5 ,酶解温度 45 ℃,酶解时
间 6 h[ 4] 。
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表 2　微波破壁工艺正交实验设计及结果
实验号 A B C 总苷提取量/ g
1 1 1 1 0.20
2 1 2 2 0.32
3 1 3 3 0.88
4 2 1 3 0.28
5 2 3 2 1.01
6 2 2 1 0.48
7 3 1 2 0.32
8 3 2 3 0.72
9 3 3 1 0.96
K 1 1.40 0.80 1.64
K 2 1.76 1.52 1.64
K 3 2.0 2.82 1.88
R 0.6 2.02 0.24
表 3　微波破壁工艺方差分析表
方差来源 差方和 Q 自由度 f 均方 F值 显著性
A 0.015 2 2 0.007 6 3.455 Δ
B 0.178 4 2 0.089 2 40.55 ＊＊
C 0.003 2 2
e 0.005 6 2 0.002 2
总 0.202 4 8
1.6.2　同理可得助提方式优化
①微波助提优化水平:固液比为1∶14 ,微波强
度为中高火 ,提取 2次 ,每次 4 min[ 5] 。
②醇提优化水平:70%乙醇 ,固液比为1∶4 ,提
取 3次 ,每次 2 h[ 6] 。
③水提优化水平:固液比为 1∶4 ,提取 3次 ,每
次 2 h。
1.6.3　同理可得酸解方式优化
①单相酸解优化水平:120°C ,固液比为 1∶6 ,
6%H2SO 4 ,酸解 6 h[ 3] 。
②双相酸解优化水平:(有机相为石油醚 bp60
～ 90°C)80°C ,6%H 2SO4 酸解 6 h[ 3 , 7] 。
③双相酸解优化水平(有机相为甲苯):100°C ,
6%H2SO 4 酸解 6 h 。
1.7　多因素正交优化
1.7.1　根据以上所述 ,以破壁方式 ,助提方式 ,酸解
方式为因素 ,设计如下因素水平表(表 4)。
1.7.2　由表 5可得优化水平为 A3 B1C3 。在各因子
最优水平基础上 ,采用酶酵解 ,微波助提及双相酸解
(有机相为甲苯)联合技术 ,可最大得率回收薯蓣皂
苷元 。
表 4　七叶一枝花薯蓣皂苷元分离提取工艺因素水平表
破壁方式 A 助提方式 B 酸解方式 C
1 微波破壁 微波助提 单相酸解
2 预发酵 醇提 双相酸解(有机相为石油醚)
3 酶酵 水提 双相酸(有机相为甲苯)
表 5　七叶一枝花薯蓣皂苷元分离提取工艺正交设计及结果
实验号 A B C 薯蓣皂苷元得率/ %
1 1 1 1 1.016
2 1 2 2 1.262
3 1 3 3 1.263
4 2 3 2 1.26
5 2 2 1 1.057
6 2 1 3 1.357
7 3 3 1 1.398
8 3 2 2 1.605
9 3 1 3 1.608
K 1 3.541 3.978 3.471
K 2 3.674 3.927 4.127
K 3 4.611 3.9212 4.228
R 1.07 0.057 0.757
表 6　多因素正交方差分析表
方差来源 差方和 Q 自由度 f 均方 F 值 显著性
A 0.226 6 2 0.1133 5.834 ＊＊
B 0.000 6 2
C 0.112 6 2 0.0563 2.899 Δ
e 0.003 3 2 0.0194
总 0.343 1 8
1.8　验证实验
将七叶一枝花干燥粉末在50°C , pH=4.5 ,纤维
素酶用量为 15 u/g 生药条件下酶解 6 h后采用微
波技术:微波强度为中高火 ,固液比为 1∶14 ,提取 2
次 ,每次 4 min , 微波提取后 ,(因溶剂差不多挥发
尽),加 50 mL 6%H 2SO 4 溶液 ,再加 100 mL 甲苯
于恒温电热套中100°C双相酸解 5 h ,过滤 ,得滤液。
先用饱和碳酸钠溶液中和 ,分层 ,取上层醚液 ,下层
水相用石油醚萃取 2次 ,合并石油醚液 ,浓缩 ,用氯
仿定容至 250 mL。取 1 mL 照 1.4方法显色测其
吸光度 ,计算苷元得率 。测得薯蓣皂苷元平均含量
为 1.873%, RSD%为 0.791(n=5)。
1.9　结合实际工业生产考虑 ,比较优化工艺与传统
工艺[ 8]
由表 5 、表7 、表8可知 ,综合苷元得率 、时间损
·88· 化　　学　　世　　界　 2009 年
表 7　各技术消耗时间
技术 时间/ h
微波破壁 A 1 0.0833
微波助提 B1 0.1333
单相酸解 C1 4+5
预发酵 A 2 16
醇提 B2 6
双相酸解(石油醚)C2 5
酶酵 A 3 6
水提 B3 6
双相酸解(甲苯)C3 5
表 8　优化工艺 , 传统工艺各工业参数比较
工艺 时间消耗/ h 溶剂消耗 苷元得率/ %
传统工艺
A2B 2C1
31
V+12倍物料的
70%乙醇 1.057
优化工艺
A3B 1C3
11 V 1.873
耗及溶剂成本三方面考虑 ,优化水平 A3B1C3 缩短
了 66.7%的工艺流程时间 ,节约了大量的溶剂成
本 ,并且苷元得率提高 77.2%。
2　结果与讨论
　　(1)破壁处理对薯蓣皂苷元得率影响最大 ,助
提方式影响最小。采用酶酵解(纤维素酶用量
15 u/g生药 ,pH4.5 ,温度 45°C ,酵解 6 h),微波助提
(微波强度为中高火 ,固∶液为 1∶14 ,提取 2次 ,每
次 4 min),双相酸水解(料∶酸液∶甲苯=1∶6∶
6 ,6%的硫酸 ,100°C酸解6 h)联合技术 ,苷元得率提
高了77.2%,工艺时间缩短了 66.7%,溶剂耗量减
少了 12倍物料的 70%乙醇 。
(2)微波技术原理是微波能自由透过胞壁直达
植物细胞的维管束和腺细胞内(总苷存在于其中)。
胞内水能最大程度的吸收微波 ,在极短时间内即达
到其汽化温度 ,液态水大量汽化蒸发 ,胞内压强增
大 ,涨破细胞壁。内部皂苷外流 ,溶解于溶剂中 ,若
溶剂被同时加热 ,则增加了流体湍动程度 ,使温度升
高 ,强化了传质 ,即有利于皂苷的溶解提取 。
(3)七叶一枝花皂苷的水解过程中 ,因反应较
为剧烈 ,常有副反应发生 ,若用盐酸水解 ,则有可能
发生羟基氯代 ,故选用硫酸。考虑到薯蓣苷元易脱
水而使含量降低的特点 ,采用双相酸解体系 ,加入与
水不相溶的溶剂 ,使酸解后的苷元立即溶于有机相
中 ,起到保护苷元 、提高薯蓣苷元收率的作用。
(4)实验中得到破壁处理对苷元得率影响最
大 ,助提方式影响最小 ,分析其原因可能酸解时间够
长 ,总苷能够充分溶出 ,故相对而言 ,之前的助提步
骤影响不大 ,而细胞的破壁程度倒显得尤其重要 ,细
胞破壁得越完全 ,越有利于酸解过程中总苷的溶出
与水解 。
(5)优化后的结果是同时结合最大的苷元收率
及最低的生产成本双向选择 ,为七叶一枝花资源的
工业化生产提供一定的参考 。
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　　　　　自 力更 生　　艰 苦 奋 斗
　　　　　不 畏艰 辛　　奋 力 拼 搏
·89·第 2 期 化　　学　　世　　界