全 文 ：苜蓿根瘤菌菌剂的研究
常玮 ,王 炜 ,屈新兰
(新疆农科院微生物所 ,新疆乌鲁木齐 830000)
摘 要:根据新疆气候特点 , 筛选出一株在耐旱 、耐盐碱方面抗性较强的苜蓿根瘤菌 Rhizobium sp.XJ67 , 并对其
发酵条件及菌剂保存条件进行研究 ,结果表明该菌最适生长温度为 30℃, 最适 pH为 6.8 ,发酵液活菌数达
19 300×108 , 菌剂最佳保存条件为冻干剂。
关键词:苜蓿根瘤菌;发酵;保存
中图分类号:S551+.7 文献标识码:A 文章编号:1001-4330(2004)02-0102-03
Study on Biologicals of Rhizobium Meliloti Dangeard
CHANG Wei ,WANG Wei ,QU Xing-lan
(Institute of Microbiology ,Xinjiang Academy of Agriculture Sciences ,Urumqi 830000 , Chian)
Abstract:According to the character of weather in xinjiang ,we selected a Rhizobium meliloti dangeard-XJ67
which has more strong survival , and studying on the condition of ferment process and preservation of biologicals.the
results showed that XJ67 optimal temperature is 30℃, and optimal pH is 6.8 , the number of XJ 67 in fermentation
liquid is 1.93×1012 , the best preservation of biologicals is freeze.
Key words:rhizobium meliloti dangeard;fermentation;preservation
新疆畜牧业的迅速发展 ,对牧草的需求越来越大 ,不仅在数量上 ,而且在质量上均要求越来越高。
苜蓿不仅蛋白质含量高 ,产量高 ,而且抗性强是较好的牧草品种 ,也是目前市场上主要的销售品种 ,因此
研究以苜蓿根瘤菌为主 ,根据新疆特殊的地理气候条件筛选结瘤率高 、结瘤早 、抗性强的菌株 ,并研究其
发酵生产工艺条件及菌剂保存条件 。
1 材料与方法
1.1 材 料
(1)采用美国阿尔冈金苜蓿种子 。
(2)10L 贝朗全自动发酵罐 。
(3)恒温摇床;进口冻干机。
(4)光照培养箱 ,紫外分光光度计 。
1.2 方 法
(1)结瘤试验 水培法 。
(2)OD值测定 将待测菌液稀释 30倍在 540 nm波长下用紫外分光光度计测光密度吸收值 。
(3)菌种活化方法 菌种保藏管※YMA平板一次活化※转接 YM斜面※保存备用 。
(4)菌种复壮试验 参照结瘤试验。
(5)菌剂保存试验 分别以草碳泥载体 、蛭石载体 、冻干菌剂三种剂型试验 ,三种方法经一定时间保
存后测活菌数。
收稿日期:2004-12-22
作者简介:常玮(1967-),女 ,陕西人 ,助理研究员 ,主要从事发酵 、菌种保藏.
项目来源:威仕达生物股份公司招标项目“相关生物制品研究”
新疆农业科学 2004 ,41(2):102 ～ 104
Xinjiang Agricultural Sciences
(6)发酵试验 使用进口贝朗 10L全自动发酵罐完成 , 10L 罐基本工艺流程如下:斜面菌种—摇瓶培养
基—纯度检查—接种瓶—10L 发酵罐。
2 结果与分析
2.1 菌种筛选
2.1.1 结瘤试验
通过结瘤试验从目前菌库中所保存的苜蓿根
瘤菌及采集 、分离的苜蓿根瘤菌中 ,筛选出结瘤率
高 ,鲜瘤量重大 、结瘤早 、结瘤数多 、固氮酶活高的
4菌株:XJ67 、CX107 、CX69 、CX77 , 4菌株各项指标
均较高 ,因此通过结瘤试验确定这 4菌株为优良
菌株 ,并测其抗逆性 。表 1
表 1 结瘤试验结果
菌名 株高(cm)
结瘤数
(个/株)
结瘤率
(%)
植株干重
(g/株)
鲜瘤重
(g)
酶活
(nmc2H2/
stem/min)
XJ67 17.0 21 100 0.407 0.13 1.34
CX107 15.5 40 85 0.286 0.13 3.68
CX69 13.5 28 100 0.361 0.13 2.82
CX77 11.5 26 100 0.257 0.12 2.5
2.1.2 抗逆性试验
新疆特殊的地理气候条件要求所筛菌株必须具有抗旱 、抗盐碱 、耐温的特性 ,因此根据这些要求对
4菌株进行了抗旱 、抗盐碱 、耐温等抗逆性试验 ,选择适合新疆气候条件的抗逆性较强的菌株 。结果表
明 ,以 XJ67 、CX69两菌株抗逆性最强 ,其中 XJ67抗性最好 ,可在含盐达 3%、pH11 、含水量 10%条件下生
长 ,在 45℃条件下处理 10 min仍能生长。因此该菌株抗逆性强 ,可在新疆盐碱 、干旱的地理气候条件下
存活 、生长 ,用该菌株生产的苜蓿根瘤菌剂适于在新疆使用 。表 2
表 2 抗逆性试验结果
菌 名 耐 旱性 耐 盐性 耐硷 性
5% 10% 15% 1% 2% 3% pH9 pH10 pH11
XJ67 - ++ +++ ++++ ++ + ++++ ++++ ++
CX69 + ++ +++ +++ ++ - +++ +++ +
注:++++表示生长的很好 , +++表示生长的较好 , ++表示生长的一般 , +表示能生长 , -表示不生长。
2.2 发酵工艺
2.2.1 摇瓶培养基的筛选
培养基是发酵工艺的研究重点 ,在实验中 ,利用摇瓶发酵对发酵培养基进行筛选与优化 ,XJ67菌株
可利用葡萄糖 、蔗糖等碳源 ,其中以葡萄糖为碳源菌体长势最好 ,可利用蛋白胨 、酵母膏 、酵母粉等氮源 ,
但以酵母膏为氮源菌体长势最好 。通过试验筛选出最佳培养基配方:蔗糖 1%,酵母膏 1%, K2HPO4·
3H2O 0.05%,MgSO4·7H2O 0.02%,NaCl 0.02%,CaCO3 0.3%,NaMoO4 0.002%,H3BO4 0.002%。
2.2.2 10 L 罐发酵工艺
在摇瓶发酵试验基础上 ,通过多次 10L罐的发酵试验 ,对发酵工艺参数:通气量 、搅拌速度及发酵温
度等控制条件进行了研究 ,使发酵液菌体活菌数达到 19 300×108个以上 。在试验中发现 ,发酵过程中
pH值几乎不变 ,溶氧值在 12 h降到零 ,表明此时菌体生长最旺盛 ,至 36 h溶氧值开始增大 ,此时菌体生
长速度减慢 ,OD值为 0.263。因此发酵时间可控制在 36 h左右。图 1 ,图 2
图 1 发酵曲线
·103·2期 常 玮等:苜蓿根瘤菌菌剂的研究
图 2 生长曲线(每 6 h测 OD值)
2.3 菌剂保存试验
2.3.1 菌剂保存类型
试验结果以冻干菌剂保存效果最好 ,活菌数最高 。冻干菌剂不仅活菌数高 ,而且具有保存期长 、体
积小易运输 ,包装简便等优点 ,避免了草碳泥 、蛭石无菌分装劳动强度大 ,保存期短 ,活菌数低 、易污染等
缺点。冻干菌剂在冻干过程中 ,保护剂的种类对
其活菌数影响很大 ,使用不同保护剂 ,保存效果差
异很大 ,因此对保护剂的种类进行了选择试验 。
2.3.2 保护剂选择
选择不同保护剂冻干 ,测定活菌数。试验结
果以添加 1%奶粉效果最佳。表 3
表 3 不同保护剂保存效果 (个)
保护剂 菌泥活菌数 冻干后活菌数
0.3%奶粉 3×1013 0
0.5%奶粉 同上 0
1.0%奶粉 同上 1.4×1011
1.5%奶粉 同上 9.0×1010
10%蔗糖+2%明胶 同上 1.9×1010
3 小 结
3.1 所筛选的 XJ67苜蓿根瘤菌固氮酶活性高 、结瘤率高 、结瘤数多是一株优良菌株 。
3.2 XJ67菌株在耐旱 、耐盐碱等方面具有较强抗逆性 ,使用该菌株生产的苜蓿根瘤菌适于在新疆的气
候条件下使用。
3.3 XJ67菌株的最佳发酵工艺条件是:培养温度 30℃,转速 200 r/min ,通气量 1∶0.6v/v ,pH6.8 ,发酵周
期36 h。
3.4 菌剂类型采用冻干菌粉 ,活菌数高 ,保存期长 ,体积小 ,具有较好的质量和效果。
参考文献:
[ 1] 周德庆.微生物学教程[M] .北京:高等教育出版社 , 1993.
[ 2] 黄玲.新疆部分豆科植物根瘤菌的某些耐性试验[ J] .微生物学通报 , 1990 , 17(3):130.
[ 3] 宁国赞.豆科根瘤菌及其应用技术[ M] .河南:中原农民出版社 , 1998.
·104· 新疆农业科学 41卷