全 文 ：第 8卷 第 6 期
1 9 92年 10月
生 物
Ch i ns e e
化 学 杂 志
B io eh em i e a l Jo u r n a l
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.
8
, N o
.
O e 七. , 1 9 92
岩豆凝集素寡糖链的纯化及组成研究 `
曹仲奎 郑 建 刘荣华 周 红
( 四川大学生化教研 室 , 成都 6 10 0 6 4 )
糖蛋白分子上的寡搪链是细胞间和分子间相互识别的基础 〔` ] 。寡糖链的结构研究首先是
寡搪链的分离纯化及糖基组成分析 。 寡糖链的组成分析多用气相色谱或高效液相色谱 〔 2一 S J 。
本文报道用气相色谱法对纯化的岩豆凝集素 ( M i l l e t i a d i e l s i a n a H a r m s · L e c t i n , 简称 M D L )
寡糖链糖基组成的研究结果 。
材 料 和 方 法
M D L按文献〔6」的方法纯化 。 M D L经无水麟腆解后 , 进行乙酞化反应 , 通过 D o w e x 50 ,
( H
+ 型 )柱 , 将双蒸水洗柱的流出液 , 减压干燥后 , 经 W ha t m an 3 号滤纸下行展层 ,双燕水洗
下寡糖链 ,冷冻干燥 。 此冻干寡糖链用 N a B H ` 还原 , H A C中止反应 , 反应混合液用 D o w e x 50 w
柱层析 , 收集用双蒸水洗脱的部分 , 减压蒸发干燥 , 获得还原末端为 N一乙酸氨基葡萄锗的 N -
连接的寡搪链混合物 。 再用 iB o 一G e l P一 4柱纯化 , 双蒸水洗脱 , 分部收集。 用苯酚 一硫酸法侧
各收集管的糖含量 , 分别合并各糖峰 , 冷冻干燥 , 得纯化的寡糖链 r , · , ’ 。
用气相色谱法测定寡糖链的糖基组成 。 采用 日本岛津公司的 G c一 7 A G型气相色谱和 C h r 。 -
m at o aP o G一 R 3 A积分仪作数据采集处理 。 层析柱为 OV 一10 1 + S E一 30 , 3 M 石英毛细管柱 , 展层
条件 : N : 为载体 , 4 0m L / m i n ,氢火焰检侧器 , T D (检测器温度 ) = T : (进样 口温度 ) = 26 0℃ ,
T c( 柱温 )为程序升温 :
2 0 0℃ / ( 3 2 m i n )
l m i n
上述纯化的寡搪链样品真空干燥后 , 加人 CH so H一 H CI 进行 甲醇解 , 经固体 A g声O : 中和
后 , 离心得上清液 , 减压蒸发干燥 。 此样进行重乙酞化反应 , 经 N : 吹干 , 真空干燥过夜 ,加
人硅烷化试剂 [ . ] ,室温反应 Z h , 即可进行色谱分析 。
结 果 和 讨 论
用腆解法从M D L中释放出与A s n 相连的寡糖链 , 经乙酞化后 , 寡搪链的末端糖从被乙酸
. 国家 自然科学羞金资助课题
收稿 日期 : 1 9 9 1一 0 8一 2 7 , 修回 日期 : 1 9 01 一 1 1 一 1 5
6 3 5
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 1992. 05. 024
化 , 用 D o w e 二 50 w 柱对寡糖链进行初步纯化 , 再经滤纸层析除去小分子物质 , 获得寡糖链的
混合物 。 这是一种简便 、 不需昂贵试剂 、 效果好的纯化寡糖链的有效方法 。 由于 iB 。 一G le P一 4
对分离 3一 24 个葡萄糖单位的寡搪链效果很好 〔 7 ] ,故实验选用 iB 。 一 G le P一 4 对寡搪链作进一步
纯化 。 iF g · l 中两个寡糖峰 工和 n ( 实验中峰 I 取 10 5一 113 管 , 峰 且取 1 2 6一 13 4管 ,两峰交叉处
弃去 ) 。 由此可见 M D L分子中仅有两种寡搪链 , ,
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. 士. F u e , 2 . X y l , 3 . M a n ,
通 . G a l , 5 . G a l N A e , 6 . G lc N A e , 7 . I n o s i t o l
应用毛细管气相色谱法对痕量寡糖进行分析是一种有效的方法 。 寡糖链经甲醇解 , 重乙
酸化 , 再制成单搪的硅烷化衍生物 , 即可进行色谱分析 。 与此同时选用糖蛋白中常见的几种
单搪 : F u e 、 x y l 、 G a l 、 M a n 、 G l e N A e 、 G a l N A e , 以肌醉作内标 ,对各种标准 单搪及其混合糖
作出标准糖的气相色谱 ( iF g . 2) 。 根据 图中各峰的自动积分值 、 出峰时间求出各单糖的相对保
持时间 ( T ab le l ) 。 同时我们还对各个标准单糖的层析谱也进行了测定 , 从而确定 F ig . 2中各峰
是由何种单搪所贡献 。
M D L分子中纯化的寡糖链样品 , 经甲醇解和乙酞化后 , 制备的三 甲基硅醚衍生物 , 以肌
醉作内标 , 在相同条件下进行气相色谱分析 , 结果见 iF g . 3和 iF g . 4 。 参照层析图谱和自动积
T a b l e 1 T h e r e l a t i v e r e t e n 七i o n 七im e s o f T M S d e r i v a七i v e s o f m o n o s a e e h a r i d e s
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分仪所得的结果 , 通过校正 , 得到两个寡糖链的糖基组成 (见 T a bl e 2) 。
根据各种单糖的分子量和 T汕 le Z中自动积分仪给 出的多种单糖的相对百分含量 , 可以计
算出 M D L 分 子中两个寡糖链的组成分别为 : 寡糖链 I : 「M an 6 F cu i lG c N A c Z孤 , 寡糖链 n :
[ M a n’ F cu , G cl N A “ 2〕。 。 再参照 M D L的分子量和搪含量 〔 6 ’ 可以确定 m和 n 的值均为 l 。 由此可以得
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3C api ll a rg y as ch o rm at og r aph y o f
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出 M D L 的两条寡糖链的组成分别为 : M a n . F u e : c l e N A e : 和 M a n oF u e : G l e N A e Z , 这种寡糖均属
于 N一型糖普键连接的高甘露搪型寡糖链 , 并且在糖链的五 搪 核 心结构上还结合了一个岩藻
糖 。 虽然高甘露搪型寡糖链已有许多报道 , 但在高甘露糖型搪链上连接有岩藻搪者 , 则较为
少见 , 这是 M D L寡搪链组成的特殊之处 。
T a b l e l和 T a b l e Z中的 G l e N A e 0 H为N 一乙酞氨基葡萄醇 , 是由糖链还原末端的 G l e N A e 经
N a H
.
B还原所得 。 在气相色谱中 cl c N A 。和 cl o N A o o H的行为有一定差异 , 故出现两个很接近的
峰 , 而 N a H ` B仅对还原性末端的半缩经基发生还原反应 , 故一条寡糖链上只有一个 lG “ N A 。被
还原成 G l e N A c 0 H 。在 F i g · 3和 4 及 T a b l e Z中可以看出 G l e N A e 和 G l e N A c 0 H的峰高和相对百分
含量都大体相同 。 综合前述结果都表明M D L分子内的两条寡糖链的组成为M o n o F uc : cl o N A c :和
M a n 一F u e l G l o N A c : 。
参 考 文 献
1 S h a
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G l y e o p r o t e i
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2 T a k a s a k i S
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. 对 e t h o d ` . E ” z梦仍。 王0 9梦 , 19 8 2 , 83* 2 6 3一 2 6 8
3 瓜新 , 等。 生物化 学与生物物理学报 , 1 9 9 0 , 2 2: 3 4 9一 3“
4 E r i e G D
, e t a l
.
T r 口” 心s 刀` o c而e 用 夕。 ` , 19 8 9 , 1 4 . 1 6 8一 1 7 2
5 A r b a r . k i i N P
, e 七 a l . B ` 0 0 , g K h ` . , 1 9日0 , 1 6 . 8 0 1一8 07
6 曾仲奎 , 等 。 生物化学杂志 , 19 92 , 8 . 9 3一 98
7 Y a m a o h i t a K
, e t a l
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M e ` h o “ . E o z 岁. 0 10 , 梦, 19 . 2 , 日3 . 1 0 5一 1 2 6
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S w e e l y C C
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J C几 , o m a l o g 尹a户几, , 29 78 , 1 4 7* 3 1 7一 3 26
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( B ` 0 1 0 9犷 D 口护a 护忿m e ” ` , S `c h “ a . U . 落v o r s 落咨梦, C h e . g J` 6 10 0 6 4 )
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2
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63 8