全 文 ：中药新药与临床药理 2016年 3月第 27卷第 2期
收稿日期：2015- 08- 09
作者简介：谭润雅，女，硕士研究生，研究方向：中药新药研发及中药质量控制。Email：13973177730@163.com。通信作者：雷鹏，副教授，研
究方向：中药新药研发及中药质量控制。Email：lp7222003@163.com.
基金项目：全国名老中医药专家传承工作室建设项目（国中医药人教发〔2014〕20号）。
枸橘为芸香科枳属植物枸橘 Poncirus trifoliata
（L.）Raf.的干燥幼果或未成熟果实[1]，又名绿衣枳实。
枸橘以枳之名，最早见于《周礼》（战国后期约公元前
三世纪），主要分布于河南、河北、山东、湖南、安
徽、福建等地。其味苦、性温，归肝、脾经，具有疏
肝和胃、理气止痛、消积化滞的功效，是中药制剂胃
HPLC法同时测定枸橘中欧前胡素和异欧前胡素的含量
谭润雅 1，2，雷 鹏 1，周 政 1，2，刘丽萍 1，2，黄 琪 1，刘海涛 1（1. 中南大学湘雅医院药学部， 湖南 长沙
410008；2. 中南大学药学院，湖南 长沙 410013）
摘要：目的 建立高效液相色谱（HPLC）法同时测定枸橘中欧前胡素和异欧前胡素含量的方法，并比较不同采
收期枸橘中呋喃香豆素类成分含量的动态变化。方法 采用 Promosil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流
动相为乙腈 - 水（70∶30），流速为 1.0 mL·min-1，检测波长为 248 nm，柱温为 25℃。结果 枸橘中欧前胡素、
异欧前胡素分别在进样量为 0.0390～0.9740 μg（r=0.9999）、0.0054～0.1352 μg（r=0.9999）范围内与峰面积线性
关系良好；平均加样回收率分别为 100.8 %（RSD=2.0 %），102.7 %（RSD=1.7 %）。不同采收期样本中欧前胡素与
异欧前胡素的含量在 5月中旬达到最高。结论 该方法简便、重复性好，结果准确可靠，可用于枸橘药材的质
量控制，可为确定枸橘最佳采收期提供依据。
关键词：枸橘；欧前胡素；异欧前胡素；高效液相色谱法；采收期
中图分类号：R284.1 文献标志码：A 文章编号：1003- 9783（2016）02- 0255- 04
doi：10.3969/j.issn.1003- 9783.2016.02.022
Simultaneous Determination of Imperatorin and Isoimperatorin of Fructus Ponciri Trifoliatae by HPLC
TAN Runya1，2，LEI Peng1，ZHOU Zheng1，2，LIU Liping1，2，HUANG Qi1，LIU Haitao1（1. Department of Pharmacy，
Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410008 Hunan，China；2. School of Pharmaceutical Sciences，
Central South University；Changsha 410013 Hunan，China）
Abstract：Objective To establish a method for simultaneous determination of imperatorin and isoimperatorin of
Fructus Ponciri Trifoliatae by HPLC， and to compare the content of furocoumarines of Fructus Ponciri Trifoliatae
collected at different harvest periods. Methods The samples were separated on a Promosil C18 column（4.6 mm×250
mm，5 μm）with acetonitrile- water（70∶30）as the mobile phase，the flow rate was 1.0 mL·min-1，the temperature of
column was 25 ℃ ， and the detection wavelength was 248 nm. Results Good linearity of imperatorin and
isoimperatorin was shown in the range of 0.0390- 0.9740 μg（r=0.9999），0.0054- 0.1352 μg（r=0.9999），respectively.
The average recovery of imperatorin was 100.8 %（RSD=2.0 %）. The average recovery of isoimperatorin was 102.7 %
（RSD=1.7 %）. The samples collected in the middle of May had the highest amount of imperatorin and isoimperatorin
than those which were collected in other periods. Conclusion The developed method is sensitive，rapid and accurate，
and can be used to control the quality of Fructus Ponciri Trifoliatae and to define the optimal harvest periods for Fructus
Ponciri Trifoliatae.
Keywords：Fructus Ponciri trifoliatae；imperatorin；isoimperatorin；HPLC；harvest periods
255· ·
Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2016 March，Vol． 27 No． 2
得安的主要成分。有关研究[2]表明枸橘中含有黄酮类、
挥发油类、香豆素类、生物碱类、有机酸类、萜类等
化学成分。潘馨等[3- 5]用气相色谱法测定了枸橘中柠
檬烯和蒎烯的含量，并用 GC- MS进行了枸橘挥发油
类成分的研究；贺肇东等[6]利用 HPLC法对绿衣枳实
中柚皮苷进行了测定，而枸橘中香豆素类成分的定量
报道甚少。香豆素类成分是枸橘中另一大类成分，其
对心血管疾病有较好的疗效 [7- 10]，具有镇痛、抗炎、
抗菌等药理活性，与枸橘止痛的功效吻合。为此，本
文开展了枸橘香豆素类成分研究及药材的采收期对枸
橘药用部分有效成分累积影响的研究，旨在为枸橘的
质量评价提供依据。
1 材料
1.1 药品及试剂 欧前胡素（批号：14031710）、异欧
前胡素（批号：13052110），成都普瑞法科技开发有限
公司；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），美国天地有限
公司；水为去离子水，其余试剂为分析纯。枸橘药材
共 19批，其中 13批自采样品分别来自河南新郑、湖
南益阳。不同采收期样品来自河南新郑同一个地区，
从 2014年 5月 1号到 7月 1号，每间隔 10天采收 1
次，共计 7批，采摘后晒干。经中南大学湘雅医院药
剂科曾嵘教授鉴定为芸香科枳属植物枸橘 Poncirus
trifoliata（L.）Raf.的干燥幼果或未成熟果实。各批次干
燥药材粉碎成细粉（药典 2号筛），置于密闭容器中，
避光密封保存。
1.2 仪器 Agilent 1100 Series高效液相色谱仪，美国
安捷伦科技有限公司；AG- 285电子天平（十万分之
一），瑞士 Mettler公司； FW177型中药粉碎机，天
津泰斯特仪器有限公司；101- 1- BS型电热恒温鼓风
干燥箱，上海跃进医疗器械厂；KS- 600D超声波清
洗器，宁波科生仪器厂。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Promosil C18（250 mm×4.6
mm，5 μm）；流动相：乙腈 - 水（70∶30）；检测波
长：248 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；进
样量：10 μL。在上述条件下，欧前胡素及异欧前胡
素与其他杂质峰达到了基线分离，与相邻色谱峰的分
离度大于 1.5，理论板均不低于 5000，对照品和样品
色谱图见图 1。
2.2 对照品溶液制备 精密称取欧前胡素对照品
4.87 mg、异欧前胡素对照品 5.41 mg，分别置于
25 mL、100 mL容量瓶中，加入一定量甲醇溶解，定
容，摇匀，制得每 1 mL 含 194.8 μg 欧前胡素、
54.1 μg异欧前胡素的对照品储备液。精密移取欧前
胡素对照品储备液 2 mL、异欧前胡素对照品储备液
1 mL，置 10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即
得 1 mL含有欧前胡素 38.96 μg、异欧前胡素 5.41 μg
的混合对照品溶液。
2.3 供试品溶液制备 将 50 g枸橘药材打粉（药典 2
号筛）从中取粉末约 0.8 g，精密称定，置 25 mL容量
瓶中，加入 80 %甲醇约 20 mL，超声提取 60 min，
取出放冷，加提取溶剂定容至刻度，摇匀，过滤，取
续滤液。进样前用 0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试
品溶液。
2.4 线性关系考察 精密移取 2.2项下的混合对照品
溶液 1，5，10，15，20，25 μL，注入高效液相色谱
仪，按 2.1项下色谱条件测定，测定其峰面积。以进
样量（μg）为横坐标 X，峰面积为纵坐标 Y，进行线性
回归计算，得到欧前胡素及异欧前胡素回归方程分别
为 ： Y=193.12X- 0.0537（r=0.9999）； Y=19.933X-
1. 欧前胡素；2. 异欧前胡素；A.混合对照品；B.样品
图 1 混合对照品及样品的 HPLC图
Figure 1 HPLC chromatograms of reference substances and samples
t /min
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10
1
2
A
160
140
120
100
80
60
40
20
0
2
1
0 2 4 6 8 10
B
256· ·
中药新药与临床药理 2016年 3月第 27卷第 2期
1.0294（r=0.9999）。结果表明欧前胡素进样量在
0.0390～0.9740 μg，异欧前胡素进样量在 0.0054～
0.1352 μg之间呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液 10 μL，
按 2.1项下色谱条件连续进样 6次，测定峰面积值。
结果欧前胡素峰面积的 RSD值为 0.57 %，异欧前胡
素峰面积的 RSD值为 0.49 %，表明仪器精密度良好。
2.6 重复性试验 精密称取同一批药材粉末，按 2.3
项下方法平行制备 6份供试品溶液，吸取 10 μL注
入高效液相色谱仪，以 2.1项下色谱条件进行含量测
定，记录欧前胡素、异欧前胡素峰面积。结果测得欧
前胡素、异欧前胡素的平均含量分别为 0.959 mg·g-1、
0.125 mg·g-1，RSD值分别为 1.68 %、1.08 %，表明
本方法重复性良好。
2.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，按 2.1
项下色谱条件，分别于 0，4，6，8，10，12 h进样
10 μL，记录欧前胡素及异欧前胡素的峰面积，结果
供试品溶液中欧前胡素峰面积的 RSD值为 0.30 %，
异欧前胡素峰面积的 RSD值为 1.66 %，表明供试品
溶液在 12 h内稳定性较好。
2.8 加样回收率试验 取已知含量的同一批枸橘样品
约 0.4 g，精密称定，共 6份，分别精密加入欧前胡
素对照品储备液 2.0 mL、异欧前胡素对照品储备液
1.0 mL，按 2.3项下方法制备样品，按 2.1项下色谱
条件进行含量测定，计算欧前胡素的平均回收率为
100.8 %，RSD值为 2.0 %；异欧前胡素的平均回收
率为 102.7 %，RSD值为 1.7 %。见表 1。
表 1 加样回收率试验结果（n=6）
Table 1 Recoveries of 2 ingredients in Fructus Ponciri Trifoliatae
2.9 样品含量测定 取不同批次的枸橘药材，按 2.3
项下方法制备供试品溶液，按 2.1 项下色谱条件测
定，以外标法计算各批次药材中欧前胡素及异欧前胡
素的含量。见表 2。
表 2 枸橘样品中欧前胡素及异欧前胡素含量
Table 2 Content of imperatorin and isoimperatorin in Fructus
Ponciri Trifoliatae
3 讨论
在流动相的选择中，本实验比较了乙腈 - 水、
甲醇 - 水溶剂系统，发现乙腈 - 水洗脱能力较强，
柱效较高，在乙腈 - 水为（70∶30）时各峰分离度均
大于 1.5，得到的欧前胡素及异欧前胡素的色谱峰峰
形尖锐，基线稳定，且分离度高。在选择欧前胡素和
异欧前胡素的提取方法时，采用超声提取法考察了
70 %、80 %、90 %、100 %的甲醇、乙醇，结果发
现同浓度甲醇、乙醇，甲醇的提取率略高于乙醇，
80 %甲醇的提取率达到最大；进一步考察了超声和
回流两种提取方法对提取效率的影响，结果显示超声
提取效果较好，提取率高，操作简便。最后，对提取
时间进行了考察，比较了 15，30，60，90 min对提
取率的影响，结果显示，在 60 min时，欧前胡素及
异欧前胡素的含量均能达到最大值，因此，确定提取
条件为 80 %甲醇超声提取 60 min。
成分
欧前胡素
异欧前胡素
含量
/μg
383.89
383.41
383.60
383.69
383.79
383.69
49.74
49.72
49.68
49.71
49.73
49.71
加入量
/μg
389.60
389.60
389.60
389.60
389.60
389.60
54.10
54.10
54.10
54.10
54.10
54.10
测得量
/μg
781.30
777.24
768.87
782.72
783.89
765.16
105.65
103.68
104.97
105.17
106.53
105.58
回收率
/%
102.0
101.1
98.9
102.4
102.7
97.9
103.3
99.7
102.2
102.5
105.0
103.3
平均值
/%
100.8
102.7
RSD
/%
2.0
1.7
NO.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
产地
河南
河南
安徽
河北
云南
河北
湖南益阳（自采）
湖南益阳（自采）
湖南益阳（自采）
湖南益阳（自采）
河南新郑（自采）
河南新郑（自采）
河南新郑（自采）
河南新郑（自采）
河南新郑（自采）
河南新郑（自采）
河南新郑（自采）
河南新郑（自采）
河南新郑（自采）
批号 /采集日期
130821
20131101
6187869
-
2013120478
-
2014.05.01
2014.05.10
2014.05.20
2014.06.01
2014.05.01
2014.05.10
2014.05.20
2014.06.01
2014.06.10
2014.06.20
2014.07.01
2012.07
2013.08
欧前胡素
/mg·g-1
0.959
0.813
1.132
1.432
0.634
0.644
0.022
0.053
0.054
0.065
0.404
0.919
0.681
0.664
0.286
0.429
0.652
0.738
1.924
异欧前胡
素 /mg·g-1
0.125
0.149
0.203
0.116
0.112
0.109
0.081
0.134
0.340
0.331
0.096
0.150
0.125
0.123
0.074
0.090
0.114
0.165
0.194
总含量
/mg·g-1
1.084
0.962
1.335
1.548
0.746
0.753
0.104
0.187
0.394
0.396
0.500
1.069
0.806
0.787
0.360
0.519
0.766
0.903
2.118
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Traditional Chinese Drug Research ＆ Clinical Pharmacology，2016 March，Vol． 27 No． 2
通过对不同批次枸橘中欧前胡素和异欧前胡素进
行分析，表明市售药材欧前胡素和异欧前胡素差异较
大。6批市售样本欧前胡素含量在 0.634～1.432 mg·g-1
之间波动，异欧前胡素含量在 0.109～0.203 mg·g-1之
间波动。这可能与产地、气候、生长年限、采收时
期、果实的生长发育及成熟度等因素有关。
采收期是影响有效成分累积的重要因素。然而《中
药大辞典》以及上海、福建、江苏省等地方标准对枸
橘的采收时间并没有统一的标准[11- 12]，本实验对河南
新郑地区 2014 年 5～7 月自采样本进行含量测定
（见表2），结果表明不同采收期对枸橘中香豆素类成
分含量的影响非常大，来自河南新郑的 7 批样品欧
前胡素含量变化幅度较大，异欧前胡素变化幅度较
小。香豆素类化合物的含量在 5 月上旬迅速增加；
5 月中旬到 6 月中旬之间含量逐渐下降，之后欧前
胡素与异欧前胡素之和再次缓慢上升，两者含量之
和在 0.360～1.069 mg·g-1之间波动，在 5月中旬达到
最大值 1.069 mg·g-1。
芸香科植物果实生长发育天数为 150~390 d，枸
橘果实的发育天数为 150 d左右[13- 17]。期间，果实的
生长发育经历了缓慢生长期（以细胞分裂为主）、快速
增质期（以细胞膨大为主）、果实生长缓慢期（此期主
要与果实品质及果实品质变化有关）3个时期[18- 19]。有
研究认为，果实的成熟度可从果皮色泽等方面判断。
从表 2可看出，枸橘果实体内欧前胡素和异欧前胡素
的含量与果实发育及果实成熟度呈正相关。
枸橘原植物栽培适应性强，于我国南北方均可栽
种，但地理环境差异以及气候差异对枸橘药材中有效
成分含量的影响是不容忽视的。来自同一采收期的河
南新郑和湖南益阳样本含量差异较大，靠近北方的样
本含量较高。此外，药材的贮存年限、树木的生长年
限以及气候条件的变化等都对其含量影响较大，有待
进一步研究。
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（编辑：邓响潮）
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