全 文 ：作物研究 ( 增刊 ): 7 3~ 78 14 9 9R C OP R E S E AR H C
兰麻花药和未授粉子房离体培养的研究
刘国民
何立珍
邓明其
周朴华
郑思乡
李宗道
【摘 要】 1 98 9一 1 9 91年试验结果表明 ,决定花粉愈伤组织发生率高低的关键因素是基因型 。 蔗糖浓度 、 低温
预处理 、热击 ( h ea t , h oc k) 等条件在一定程度上影响花粉愈伤组织发生率 . 添加有机附加物的培养基讨利于愈
伤组织生长 ,在 2 , 4一 D 配以微童 6一 B A 或 K T 最适宜于诱导兰麻单倍体愈伤组织 。 由未传粉子房的培养 ,不经
愈伤组织 、曾经直接获得一株白化苗 , 但至今为止尚未由花粉或未授粉子房来源的单倍体愈伤组织获得绿苗 。
一 、 材·料与方法
该试验的花药培养中所采用的主要供试品种是湘兰 3 号和 C Z一 14 在部分试验中还采用
了黄壳早 、 芦竹青 、 邻水牛皮麻 、 邻水桐皮麻 , . 沉江肉麻 、 鸡骨白 、 武冈本地麻 、 芷江青壳麻 、 稀归
州 青麻 、 汉寿肉麻 、 嘉禾牛蹄麻 、 宜章绩麻 、 邵阳青麻 、 安仁莞麻 、链沉水桐麻 、 平乐黄金麻 、 平江丛
莞麻 、琪县圆麻 、 平江丛莞麻 、 资兴绿麻等品种 . 子房培养中以湘兰 3 号 、 C Z一 1 4 、 黄壳早和芦
竹青作为供试品种 。
在 5一 8 月中旬长 日照条件下通过人工遮光 ,缩短 日照长度 ( 10 ~ l hl 光照 ) 获得兰麻花
序 , 然后从大田中取材 。 花药取回后置于冰箱中 ,用 3~ 5℃低温进行预处理 。~ d7 ,花药或子房
接种之前用 自来水冲 洗 10 ~ 15 m in , 除去表面的泥砂等杂物 , 沥干水后在超净工作台上用
7 5 %乙醇灭菌 l m in ,然后用饱和漂白精溶液灭菌 15 m in (或者用 0 . 1纬升汞溶液灭菌 7m in) ,
倒去灭菌剂 , 用无菌水将材料冲洗 5~ 6 次 。 在超净工作台上逐个剥取含有单核靠边期花粉的
花药接种到培养基上 。 接种的子房材料处于成熟胚囊期 。 花药材料接种后 ,在诱导愈伤组织阶
段置于 25 ~ 27 ℃条件下暗培养 。 愈伤组织转移到分化培养基上后 ,置于 日光灯光照条件下 (强
度约为 1 0 0 0 L u x )培养 , 每天提供 1 4h 光照 ( 8 : ~ 2 2 : 0 0 ) ,培养室温度保持 2 5 ~ 2 7℃ 。 在热击
沪 试验中 ,花药材料在接种后的最初 d7 用 30 ℃ 、 32 ℃ 、 34 ℃高温条件在培养箱 中进行暗培养 ,然
后移至 25 ~ 27 ℃条件下 , 继续暗培养 。 子房材料接种后 , 部分直接在光照条件下培养 , 部分材
料在诱导愈伤组织阶段进行暗培养 ,分化培养阶段再进行照光培养 。 光照 、温度条件同花药培
养 。
培养基的灭菌采用 了两种方法 , 一是 用 1 . kI g c/ m Z 、 10 5℃灭菌 12 ~ 1 5m in , 二 是用 .0
45 拼m 微孔滤膜过滤灭菌 。
二 、 结果与分析
(一 )花药离体培养
1
.不同品种对花粉愈伤组织 发生率的 影响
几年来的试验结果表明 , 不同兰麻品种花粉愈伤组织发生率差异很大 。 在同样的条件下 ,
有些品种如 C Z一 14 等的花药愈伤组织发生率可达 40 环~ · 50 % ,有些品种则如湘兰 3 号等则
较低 ;有些品种如鸡骨白等的花药愈伤组织发生率为零 (表 1 ) 。
表 1 不同兰麻品种的花粉愈伤组织发生率 ( 1 9 91)
品种 愈伤组织块数 /统计的花药数 愈伤组织发生率 (% )
C Z一 14
令卜水桐皮麻
湘兰 3 号
邻水牛皮麻
武冈本地麻
汉寿肉麻
鸡骨白
芷江青壳麻
15 4 / 3 1 7 4 8 5 8
7 7 / 56 4 13 6 5
8 3广 8共0
2 6 / 4 4 3
0 / 8 2 4
O / 5 2 4
0 了1 0 0
培养基成份 : SJ 一 l 无机盐和有机 附加物+ 2 , 4一 D 2 . sm g/ l斗 6一 B A 0 . Zm g/ l ,蔗糖浓度为 7 % 。
上表仅是一次实验的结果 。 综合几年的试验结果 , 我们认为 C Z一 1 4 、 邻水桐皮麻 、 邻水牛皮
麻 、 湘兰 3 号 、 芦竹青 、 黄壳早等品种花粉愈伤组织发生率较高 ,其中又以 C Z一 14 在各次试验中
均表现有较高的花粉愈伤组织发生率 。 可 以认定 , 兰麻花药愈伤组织发生率 ( 以及绿苗分化
率 ) , 受品种遗传基础的影响很大 。 因此 ,在进行花培研究时 ,应十分注重筛选合适的品种作为
试验材料 。
2
. 不 同基本培养基的影响
几年来 , 我们试验了 M S 、 B 、 H 、 N S 及 S J一 1 等品种基本培养基 。 实验结果表明 , 在其他条件
相同时 ,从愈伤组织发生率及生长情况来看 , 上述几种基本培养对兰麻花药培养的适应程度依
次为 SJ 一 1> B > M S> N 。> H , 即 SJ 一 1 培养基效果最好 , H 培养基效果最差 。 我们认为 ,这可
能与培养基中无机氮的形态及浓度有关 。 兰麻是旱生作物 、 喜硝态氮 ,氨态氮相对而言不如硝
态氮那样有利于兰麻的生长发育 。 故在无 N H犷的 SJ 一 1 培养基上 , 以及 N O 3一较高 、 N H 4 + 浓
度很低的 B 培养基上所培养的花药材料有较高的愈伤组织发生率 。 愈伤组织生长较快 , 质地
也较好 ; 相反地 , 在 N H ` + 很高的 N , 培养基上所培养的花药材料 , 愈伤组织发生率较低 , 生长
状况也差一些 。
3
. 不同蔗糖浓度对花粉愈伤组织发生率哟影响
多次试验结果表明 , 蔗糖浓度对兰麻花药培养效果的影响很不一致 。 就 C Z一 1 4 、 湘兰 3
号 、 黄壳早 、 芦竹青等品种来说 , 在其他条件大致相同的条件下 ,蔗糖浓度在 3% ~ 12 %范围内
均可诱导出花粉愈伤组织 。 但就同一品种来说 ,蔗糖浓度为 6% ~ 9%时 , 花粉愈伤组织发生率
较高 。 我们认为 , 当其他培养条件基本上适合时 , 决定愈伤组织发生率高低的关键因素仍是基
因型 ,蔗糖浓度虽有一定影响 ,但不是决定因素 , 因为在相当大的浓度范围内 (3 % ~ 10 % ) ,愈
伤组织发生率的差异并不是很大的 。 另一方面 ,有些品种无论蔗糖浓度高低 ,其愈伤组织发生
率均表现很低或为零 (表 2 ) 。
7 4
4
. 有机附加物的 影响
在不同基本培养基的基础上追加某些维
生素 、 氨基酸 、 氨基酸酚胺 、 水解乳蛋 日或水
解酪蛋白等有机附加物 ,或者适当地提高基本
培养基中某些有机成份的浓度 , 对于提高花
粉愈伤组织发生率和改善其生长状况有良好
效果 , 特别在防止愈伤组织过早褐化方面有
显著效果 。 实验中使用的有机物种类及浓度范
围分别为 : 肌醇 1 0 一 s 0 0 0 m g l/ 、 盐酸硫胺素
o : 5 ~ 2 0
.
om g / l
、 盐酸毗哆素 0 . 5 ~ 5 . om g / 1、
维生素 C S一 l o rn g / l 、 叶酸 o · 5一 x . Om g / l 、 甘
氨酸 2 ~ l o m g / l 、 丙氨酸 2 . 5~ l o m g / l 、 丝氨
酸 10 ~ l o o m g / l 、 谷氨酸 2 0 ~ s o om g / l 、 脯氨
酸 5 ~ Z om g / l 、 天冬氨酸 1 0 ~ Z o o m g / l 、 组氨
酸 5 一 Z o m g / l 、 亮氨 酸 1 0 0m g / l 、 精氨酸 5 一
Zo m g / l
、 天冬酞胺 5 0 ~ 2 5o m g / l 、 谷氨酞胺 5 0
~ 2 5 0八水解酪蛋白 2 0 0 ~ 5 0 0二 g / ] 、 水解乳蛋
白 2 0 0 ~ s o o m g / l 、 酵母提取汁 (或抽提物 ) 3 0 0
~ 50 0’m g l/ 。 总的说来 , 在培养基中加入若干
种上述有机附加物 , 或者适当地提高某些成份
的浓度 , 愈伤组织质地 比对照有明显改善 , 富
有生机 . 又难于褐化 。 特别是将肌醇浓度捉高
至 5 0 0 一 Z 0 0 0 m g / l , 盐 酸硫 胺浓 度 提 高 至
2 0 0 9 / 1
,并加入 5 ~ 2 0二 g / l 维生素 C 时 ,对于
抑制愈伤组织褐化有明显效果 。
5
. 植物生物调节剂的 影响
试验 中使 用过的植 物生长调 节剂 包括
I A A
、
I B A
、
N A A
、
M C P A
、
C P A
、
2
,
4 一 D 、 G A 、
K T
、
6一 B A 、 Z E A 、 A B A 、 C W 、 A d 等 。 一就诱导
花粉愈伤组织而言 , 以 2 , 4一 D Z一 3m g ,l/ ,配
以 6一 BA o
,
z一 。 , 2 5 m g / l 或 K T 效果最好 。 愈
表 2 不同蔗枪浓度对竺麻花粉愈伤组织
发生率的影响 ( 1 9 9 1 )
品种 蔗糖浓度 (% ) 愈伤组织发生度 ( 环)一 ,一一一3 3 5 . 4c Z一 14 : : ;’ {J任月oh一尸01勺369昭
湘兰 3 号
黄壳早 几.
24
-。7.68103
芦竹青
,了尸O, .…1心`ōh
招36912
邻水牛皮麻
69312
鸡骨白 : :
3 0
芷江青壳麻 丘 旦口 甘
1 2 0
砂产 、 注 : 培养基成份为 SJ 一 l 无机盐和有机附加物 + 2 , 4
一 D Z· s m g / l+ 6一 B A O· 2 5 m g / l。
伤组织发生率较高 、 质地较致密 。 如单独使用 2 , 4一 D 作诱导激素 , 虽有较高的愈伤组织发生
率 ,但质地松散 ,易长根或者呈水渍状 ,不利于芽的分化 。 N A A 、 I A A 或 BI A 诱导花粉愈伤组
织的效果明显比 2 , 4一 D 差 。 N A A 单独使用时 ,极容易使愈伤组织长根 , 但低浓度的 N A A (0 .
05 ~ .0 20 m g l/ )配以 G A 。 , 1~ Zm g 1/ 用于继代培养 , 则可使愈伤组织极为鲜嫩 ,质地较致密 ,表
面有小颗粒 突起 ,在以 M C P A 或 C P A 作为主要诱导激素的试验中 ,愈伤组织的发生率均为
零 。 但 M C P A .O 5~ .2 o m g l/ 配以 6一 B A 或 K T o . 5~ 2 . o m g l/ 用于继代培养 ,可诱导愈伤组织
产生结构松散的颗粒体 ,经再继代培养又可产生类似的颗粒体 。 我们曾单独使用 6一 B A 或
7 5
T K I
· 。 m g / l诱导二倍体试管苗茎段产生愈伤组织 , 其效果很好 。 所产生的愈伤组织转移到分
化培养基上后极容易分化 出绿苗 。 但若用 6一 B A 或 K T O . 25 ~ 2 . o m g l/ 来诱导花药材料 ,愈伤
组织发生率均为零 。 在继代培养中 , CW 和 A d 与适量生长素类激素配合使用 ,可以明显地改
善愈伤组织的质量 ,使之较为致密 、鲜嫩 。 但 C W 和 A d 浓度不宜太大 , CW 浓度以 5% ~ 10 写
为宜 , A d 以 20 ~ 30 m g l/ 为宜 。 若二者同时使用 ,浓度还需进一步降低 。 在诱导培养基中加入
C W 或 A d 对于愈伤组织的发生有一定抑制作用 。 但愈伤组织的质地相对来说要好一些 。
6
. 低温预处理与接种后的热击对花粉愈伤组织发生率的影响
兰麻花药材料接种之前是 否经过一段时 表 3 3~ 5℃低沮预处理对竺麻花粉愈伤
间 3 ~ 5℃低温处理 , 对于花粉愈伤组织发生
率的影响表现很不规则 , 在很大程度上 ,兰麻
花粉愈伤组织发生率的高低受基因型的影响 。
例如 C Z一 14 的花药即使不经低温预处理亦
有相 当高的愈伤组织发生率 , 处理 1一 4 天并
无明显促进效果 ,处理时间超过 5 天愈伤组织
发生率反而有所降低 ;而鸡骨 白 、 武 冈本地麻 、
汉寿肉麻等品种的花药材料 , 接种之前经 1~
d4 低温预处理 , 其愈伤组织发生率均很低 , 甚
至为零 。 作为一种短期内保存花药材料的手
段 ,将材料置于 3~ 5℃低温条件下处理 1 ~ d6
不失为一种有效的方法 。低温处理的时间一般
不应超过 7 ~ d8 , 否则材料会坏死 , 或者接种
后花药极容易被污染 。 因为有些低温微生物在
材料保存过程 中仍可繁殖并侵入营养丰富的
花药组织内部 , 灭菌时无法将其杀死 。 另外 ,取
材时材料的干湿程度对于低温处理的适宜时
间长度也有很大影响 , 露水未干时或雨天取回
的花药材料 ,最好应在 1~ d2 内接种到培养基
上 ,若置于冰箱中保存 3~ d4 以上 , 材料往往
发粘或坏死 ,其部分原因可能由于材料在保存
过程中因长时间浸没在水中进行无氧呼吸 , 产
生了较多的乙醇等有毒物质而 引起自身中毒
而坏死 (表 3 ) 。
组织发生率的影响
品种 处理时间 ( d) 愈伤组织发生率 (% )
0 4 2
.
6
2 4 3
.
6
4 4 1
.
7
C一 2一 1 4 6 3 4· 3
8
.
6
8
.
4
0口`Jì óōbOU
湘兰 3 号 1
0
.
6
.
00
ō卜ùn6八U自印-口3卜.10L
nU今妇J,ób只
武冈本地麻
0
,自J任ōbs
鸡骨白
OCù000,白魂ōbOU
汉寿肉麻
备注 : 1 . 培养基成份 : B ,无机盐和有机附加物 + 8%蔗精
千 2· s gm / 1 2
,
4一 D 山 0 . Zm g / 1 6一 B A
2
. 上午露水干后取材料 .
花药材料接种后 ,先置于 30 ~ 32 ℃条件下热击 7 ~ l do ,然后转移至 25 ~ 27 ℃条件下培
养 ,对于提高愈伤组织发生率有一定促进作用 。 同样地 ,基因型的影响是决定因素 。 对于那些
在一般条件下不能产生花粉愈伤组织或其频率极低的品种 ,热击并无明显的效果 。 试验表明 ,
热击温度不宜超过 34 ℃ , 时间也不宜太长 。 若用 34 ℃高温处理 7 ~ d8 以上 , 愈伤组织发生率会
明显下降 ,在某些基因型中甚至会使愈伤组织发生率为零 (表 4 ) 。
表 4 热击 d 7对竺麻花粉愈伤组织发生率的影响 ( 1 9 9 1 )
品种 温度 ( ℃ )愈伤组织发生率 ( % )与对照相比 (士 % )对然 遭( % )
十 3. 2
十 3. 5
一 1 8。 2…L OI户西孟é月,左ù峥习00白J吮`J任0,自J性心连`丹Oǎj3内J确几润八JC Z一 14
湘兰 3 号
13
.
6
14
.
4
小 4 . 0
+ 4
.
8
一 3 . 2
邻水牛皮麻
8 9 山 2 . 5
8
.
6 十 2 . 2
( ) 一 6 . 4
芷江青亮麻
十 1 . 4
+ 1
.
6
士 O
.146。
0,白连.,d比j目」
鸡骨白 ) 士 0 0
! 士 0
注 : 1 . 培养基成份一律为 sJ 一 1无机盐和有机成份一` .3 o m g / ! 2, 4一 D + .0 25吨 l/ 6一 B A。
2
.对照接种后一直置千 2 5~ 27 ℃条件下培养 ,其他各处理热击 7d 后移至与对照相同的沮度下培养 .
7
. 花粉愈伤组织 的器官分化
由兰麻花粉愈伤组织分化出根非常容易 ,单独使用 .0 05 一 .2 o m g 1/ I A A , BI A , 2 , 4一 D 或
N A A 等生长素类激素均可使之诱导出根来 ,特别是 N A A 诱导兰麻花粉愈伤组织生根的能力
极强 , 0 . o sm g l/ 即有明显效果 , 可使花粉愈伤组织产生大量气生根 。 甚至在各种同时含有生长
素类和细胞分裂素类激素的培养基上 ,只要细胞分裂素类激素的浓度稍为偏低 ,或者生长素类
激素浓度稍为偏高同样会使愈伤组织生根 , 这可能与兰麻愈伤组织内源生长素含量较高有关 。
在分化培养基中曾试用了 SJ 一 1 、 M S 、 B 及 H 等不同基本培养基 , 或在此基础上追加多种
氨基酸 、 维生素 、水解乳蛋白或水解酪蛋白等有机附加物 , 在某些配方中还加入了谷氨酞胺或
天冬酸胺 。 还进行了不同种类植物生长调节剂 (6 一 B A 、 K T 、 Z E A 、 CW 、 A d 或与生长素类 、 G A 3
和 A B A 搭配 ) ,不同浓度水平 (0 . 2~ 5 . Om g l/ )和不同激素组合的试验 。 但到 目前为止 , 尚未由
花粉愈伤组织诱导出单倍体植株来 。
(二 )未授粉子房的离体培养
试验结果表明 , 基本培养基和植物生长:调节剂种类与浓度适宜 , 同一兰麻品种未授粉子房
愈伤组织发生率往往 比花药愈伤组织发生率要高 。 植物生长调节剂对离体培养中未授粉子房
材料的发育方向影响很大 。 较高浓度的 2 , 4一 D 3~ s m g l/ 一般是可诱导产生愈伤组织 ; I A A 配
以 G A 3 ,则可使幼嫩的未授粉子房柱头端产生一条细小的白根 ,一般长达 3 ~ 4m m 就不再伸
长 , 即使转移到同类培养基上亦不再伸长 。 例如 , 19 9 1 年 6 月接种在含有多种氨基酸 、 维生素
并附加 4 . o m g l/ I A A 和 2 . o m g l/ G A 3 的 B 培养基上的一批未授粉子房材料 ,接种后 1d0 即可
见到几乎每枚子房均从柱头端长出一条白根 , 长达 2~ 3m m 。 其中有一枚未授粉子房长出的白
7 7
根不断伸长 ,继而现出下胚轴 , 最后长出子 叶 , 形成一株白化苗 ,但这株白化苗转移到发育培养
基上 10 多天后 , 子叶依旧卷曲 ,不产生叶绿素 ,也不长出新根和真叶 ,随后逐渐转黄而死去 , 重
复该配方时 ,没有再获得同样植株 。
6一 B A 、 K T 、 z E A 、 A d 和 C w 明显地抑制子房材料产生愈伤组织 ,往往致使子房明显膨
大 ,形成外观上正常 ,但体积 比自然结实的种子要大 1 . 5~ 2 倍的 “ 种子 ” 。这种“ 种子 ” 可能是由
瘦果的果皮增厚膨大而成 , 其内部因不具发育正常的胚 , 故将其转移到发育培养基上后 , 既不
长根 ,也不出芽 , 而且也不产生愈伤组织 。
与花粉愈伤组织分化试验的情况相类似 , 虽然几年来进行 了多种试验 ,但至今尚未由授粉
子房来源的愈伤组织获得单倍体植株 。
三 、 结 语
由花药或未授粉子房获取单倍体愈伤组织 目前 已取得成功 。 经压片镜检 ,观察到每个处于
分裂相的细胞含有 14 条染色体 , 即 n 一 1 4 ,从而证明是单倍体愈伤组织 。 几年来我们设计了数
以百计的分化培养基 ,试验了多种理化条件 ,试图由花粉或未授粉子房来源的愈伤组织诱导出
单倍体植株 ,但至今尚未成功 。 实验表明 , 从兰麻单倍体愈伤组织诱导出绿苗要 比从二倍体愈
伤组织困难得多 。 我们曾于 1 9 9 0 年度用 “ 湘芝三号 ’ ,试管苗茎段来源的二倍体愈伤组织作试
验 , 绿苗分化率可高达 25 % ~ 30 % 。 但即使几完全相同的条件处理单倍体愈伤组织 ,却不能使
之分化出苗来 。 寻找合迁的分化培养基是兰森毕倍体育种的关锐所在 ,这一关不能突破 ,花药
或未授粉的离体培养就无法取得最后成功 。 我们目前仍在努力探索 。
(参考文献略 )
(上接 6 6 页 )
讲 ,麻类作物光合产物向经济产量的转化要比收获籽实体的作物容易 。 因之麻类作物的光合作
用与产量的关系似应更加密切 。前人研究已经证明 , 麻类作物的光合作用与产量无例外地呈现
正相关 。 本研究以大量基因资源为材料 ,采用无破坏性方法测定田何连体叶片光合作用 ,再次
证明 ,兰麻光合作用与原麻产量间有肯定的正相关 。 因此 ,可根据 P n 来选择高产基因资源 。 笔
者还发现 ,三麻 P n 与产量的关系不如头 、 二麻那样密切 , 这可能是三麻收麻时已是生殖生长
期 ,而品种间生殖生长量差异悬殊所造成的 。
本试验中也发现每季麻都有 P n 较高而 产量低的情况 ,对单叶光合量以至整株光合量与
产量的关系问题 尚未涉及 ,均待进一步研究 。
(参考文献略 )