全 文 ：2005年 12月
第 20卷第 6期
中国粮油学报
Jou rnal o f the Chinese C erea ls andO ilsA ssocia tion
Vo .l 20, N o. 6
Dec. 2005
陈化籼米固态发酵法生产柠檬酸的研究
周建新　鞠兴荣　杨晓蓉　许蓓蓓　吴　定　陈　伟
(南京财经大学 ,江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室 ,南京　210003)
摘　要　研究了原料预处理及相关因素对以陈化籼米为原料 、黑曲霉进行柠檬酸固态发酵的影响作用。
确定出以 PDA为黑曲霉活化培养基 ,原料采用陈化籼米粉碎后 ,每 100 g米粉中加水 60 g后蒸煮 (121℃、
15m in)的预处理;得出黑曲霉进行柠檬酸固态发酵的优化工艺条件为:发酵前补水至 52. 9%,发酵温度 25℃,
发酵时间 84 h,柠檬酸的含量可达 135. 4 g /kg干物质 ,并且基质发酵后蛋白质含量提高 60%。
关键词　陈化籼米　黑曲霉　固态发酵　柠檬酸　发酵条件
0　前言
我国每年因粮食储备 、粮食收储企业的库存周
转 、仓储设施老化与不足等原因产生了大量的陈化
粮 [ 1] ,陈化粮食用品质差 ,安全性又得不到保障 ,因
此国家规定陈化粮不能进入口粮市场[ 2] ,大部分仅
作为饲料 ,经济价值低 [ 3] ,因此急切需要找到合适的
途径来处理陈化粮 ,一种经济 、有效的方法就是把它
作为发酵基质生产一些有用的产品 ,如目前刚商业
化生产的乙醇和沼气 [ 4] 。
柠檬酸广泛应用于食品 、医药和化学工业 ,是一
种重要的商业产品 ,全球的年产量超过 70万吨 ,年
需求量以 3. 5% ～ 4%的速度增长[ 5] 。而微生物发酵
法是目前国内外生产柠檬酸的主要方法 ,它又可分
为浅盘液态表面发酵法 、固态发酵法和深层通风发
酵法 3种 [ 6] 。浅盘液态表面发酵法 ,设备占地面积
大 ,发酵时间长 ,生产能力低。深层通风发酵法 ,发
酵速度高 ,设备占地面积小 ,生产规模大 ,原料消耗
低 ,但要求技术水平高 。固态发酵法是我国传统的
发酵技术 ,与其他发酵方式相比有如下优点:原料多
为便宜的天然基质或工业生产的下脚料 ,且来源广
泛;投资少 ,能耗低 ,技术较简单;基质含水量低 ,可
减少废水处理 ,环境污染较少 ,后处理加工方便;发
酵过程一般不需要严格的无菌操作 ,因而利用固态
发酵法生产柠檬酸受到人们的重视 [ 7 -9] 。
基金项目:江苏省高校高新技术产业发展面上项目(项目编号
JH03 - 047)
收稿日期:2005 - 01 - 19
作者简介:周建新 ,男 , 1964年生 ,副教授 ,食品微生物学与发酵
　　本文以黑曲霉为菌种 、陈化粮为基质通过固态
发酵法生产柠檬酸的研究 ,属首次报道 ,对拓宽陈化
粮深度开发的途径 ,提高其经济价值 ,具有重要的现
实意义。
1　材料与方法
1. 1　试验材料
黑曲霉 N JUE - 5:南京财经大学食品微生物学
实验室选育和保存;
籼稻谷(1998年产 ,经质量评定为陈化粮):江苏
睢宁国家储备粮库提供;
麸皮:南京海悦面粉厂提供。
1. 2　主要仪器设备
fa lling numbe r 3100型粉碎机 , SPB602 - N型电
子天平 , PYX - DHS - 40 ×50型隔水式电热恒温培
养箱 , YQ STX - 280型手提式高压蒸汽消毒锅 ,
HG101 -2型电热鼓风干燥箱 , THZ - C型恒温振荡
器 , TDL -5 -A型台式离心机等。
1. 3　菌种活化培养基
分别采用 CA、PDA和麦芽汁培养基 [ 10] 对黑曲
霉菌种活化 ,选择适宜的黑曲霉菌种活化培养基 。
1. 4　种子培养基制备
取新鲜麸皮 ,用 60目筛子筛去细粉 ,以减少淀
粉含量。按麸皮∶水 =1∶1. 0 ～ 1. 3比例加入水 ,拌匀
至无干粉又无结团现象。拌匀后分装在 1000 mL的
三角瓶中 ,每只装湿麸皮大约 40 g,用 8层纱布封扎
瓶口 ,高压蒸汽灭菌 (121℃、40 ～ 60 m in),趁热摇散
至 35℃,培养 1 d,对未发现异常气味或染菌的三角
瓶 ,冷却后接入 1 ～ 2环已活化的斜面菌种 , 30 ～ 32℃
第 20卷第 6期 周建新等　陈化籼米固态发酵法生产柠檬酸的研究
培养 ,每隔 12 ～ 24 h摇瓶一次 ,待长出的黑色孢子布
满丰盛后 ,即可使用 ,经测定孢子数为 108个 /g。
1. 5　柠檬酸固态发酵工艺
稻谷→脱壳 、去皮→大米→粉碎→称取 50 g→
加辅料 (每 100 g米粉加入 8. 5 g麸皮 、1 g碳酸钙 、
0. 4 g尿素和 60 g水 )、拌匀→三角瓶 、8层纱布封扎
瓶口→高压蒸汽灭菌 (121℃、20 m in)→冷却 、补水 、
接种(接种量为 0. 2% ～ 0. 3%)→培养箱发酵→测定
(取 4次平行实验数据的平均值为结果)
采用单因素试验 ,探讨原料预处理 、补水量 、发
酵温度 、发酵时间对以陈化籼米为原料固态发酵法
生产柠檬酸过程的影响 ,并通过正交试验优化生产
柠檬酸的工艺条件。
1. 6　分析方法
1. 6. 1　基质初始含水量的测定
接种前 ,精确称取发酵基质 5 ～ 10g, 105℃烘干
至恒重 ,再精确称量 ,计算:含水量(%)=(原重 -干
重 ) /原重 ×100%[ 11]
1. 6. 2　柠檬酸测定
称取发酵基质 3 ～ 6g,放入 40mL、80℃水中浸泡
20 m in,离心 20 m in,取上清液 25 mL,加入 1 ～ 2滴
1%酚酞指示剂 ,用 NaOH标准溶液滴定至微红 [ 10] :
柠檬酸 (g kg- 1干物质 ,简写 , g kg -1 DM )=
112. 64MV /m(1 - x)
M ———标准 N aOH溶液的浓度 /mo l L- 1;
V———消耗标准 NaOH溶液的体积 /mL;
m———滴定称取的基质的质量 /g;
x———基质初始含水量 /%。
1. 6. 3 　蛋白质测定
凯氏定氮法 [ 12] 。
2　结果及讨论
2. 1　菌种活化培养基的优化
实验表明 ,黑曲霉在 CA培养基上的菌落呈白
色 ,产生极少的孢子 ,在麦芽汁培养基中 ,菌丝白色 ,
生长旺盛 ,但产孢子量少 ,而在 PDA培养基上 ,菌落
由白色逐渐变至棕色 ,呈绒毛状 ,布满培养基表面 ,
孢子区域为黑色 ,故选用 PDA为菌种活化培养基 。
2. 2　原料预处理对柠檬酸产量的影响
将米粉分别进行干料蒸煮 (121℃、20 m in)后加
无菌水和加水后蒸煮 ,使含水量达到 52. 9%, 30℃培
养后测定柠檬酸 ,结果分别为 14. 3 g /kg DM和 57. 1
g /kg DM ,说明加水后蒸煮进行发酵 ,结果优于干料
蒸煮后加无菌水的。蒸料的目的除灭菌外 ,可使淀
粉适度糊化 ,有利于菌的利用 。但由于米粉中淀粉
含量较高 ,加水后蒸煮的方法中加水量的控制显得
非常重要 ,实验中发现 ,加水量过大 ,基质易黏结成
团 ,影响通气 ,不利于菌体的生长 ,所以加水量的控
制应保证基质蒸煮后不黏。通过反复实验 ,确定为
每 100 g米粉中加水 60 g后蒸煮 ,基质分散性较好 ,
不黏结 ,发酵前可根据需要补水。
为了研究发酵培养基的 pH值对黑曲霉的生长
及产物柠檬酸合成的影响 ,使用 pH值分别为 2、4、6、
8以及一份自然 pH(=7)的水 , 25℃发酵 84h后测定
柠檬酸。结果如图 1表示 ,由图 1可知 ,在实验过程
中 ,不需改变发酵基质的 pH值可保持最高产量 69. 2
g /kg
-1
DM。故以下实验的原料预处理均采用每 100
g米粉中加水 60 g后蒸煮 (121℃、20 m in),不用调节
pH值 。
图 1　pH值对柠檬酸产量的影响
2. 3　发酵条件对柠檬酸产量的影响
2. 3. 1　发酵时间对柠檬酸产量的影响
原料预处理后补水至基质含水量为 52. 6%,置
于 30℃培养箱内培养 。每隔 24 h测定柠檬酸含量。
由图 2可知 ,发酵时间对柠檬酸产量有一定影响 ,柠
檬酸在发酵最初的一段时间就产生 ,并在培养 72 h
后达到最高 ,接近 70 g /kg DM。若再继续发酵 ,产量
反而会下降 ,原因是乳酸被黑曲霉利用 [ 13] 。
图 2　发酵时间对柠檬酸产量的影响
2. 3. 2　基质含水量对柠檬酸产量的影响
5
中国粮油学报 2005年第 6期
　　水是发酵的主要媒质 ,基质含水量是决定固态
发酵成功与否的关键因素之一。基质的含水量应根
据原料的性质 (细度 、持水性等 )、微生物的特性 (厌
氧 、兼性厌氧或需氧)、培养室条件 (温度 、湿度 、通风
状况)等来决定[ 13] 。含水量太高 ,导致基质多孔性
降低 ,减少了基质内气体的体积和气体交换 ,降低产
物浓度 ,增加后处理费用 ,从而失去固态发酵的优
势 。含水量太低 ,造成基质膨胀程度低 ,微生物生长
受抑制 ,后期由于微生物生长及蒸发造成物料较干 ,
微生物难以生长 ,产量降低 。
原料预处理后 ,补入不等量的无菌水 , 30℃发酵
72h后测定柠檬酸。结果如图 3所示 ,由图 3可知 ,
补水量为 20 mL(含水量为 55. 1%)时 ,柠檬酸产量
最大 ,达 89. 6 g /kg DM。
图 3　补水量对柠檬酸产量的影响
2. 3. 3　发酵温度对柠檬酸产量的影响
对微生物反应而言 ,温度是一个敏感因素。微
生物都有一个较窄的适宜生长的温度范围。在此范
围内 ,温度的活化作用占主导地位 ,反应速度随温度
的升高而加快。若温度过低 ,微生物细胞内的酶活
性受到抑制 ,生物反应处于停滞状态;若温度过高 ,
则生物不可逆失活占主导地位 ,使反应速度减小 ,直
到微生物完全死亡[ 13] 。
原料预处理后 ,补水量为 15 mL的样品分别置
于不同温度的温箱内 ,发酵 72h后测定 。由图 4可
知 ,柠檬酸固态发酵的适宜温度为 25℃。
图 4　发酵温度对柠檬酸产量的影响
2. 3. 4　正交试验优化发酵工艺条件
在上述单因素试验的基础上 ,按表 1设计了正
交试验 [ 14] ,极差 R越大 ,表明因素对柠檬酸产量的
影响越大 ,本试验中 ,因 R2 >R1 >R3 ,所以三因素对
柠檬酸产量影响的重要性依次为发酵温度 (B) >基
质含水量 (A)>发酵时间(C)。由此可以看出 ,特别
要求在生产过程中控制好发酵温度 ,其次要考虑基
质含水量和发酵时间 。优化的工艺条件为 A 1B1C3 ,
而表中没有按 A 1B1C3的工艺 ,需要通过补做实验加
以证实 ,即在基质含水量 52. 9%,发酵温度为 25℃、
时间为 84 h下 , 最终柠檬酸的产量为 135. 4 g /kg
DM。说明该条件确实为最适发酵工艺条件 。此柠
檬酸产量高于 Luciana等[ 6]报道的 88 g /kg DM(原料
为木薯渣 )水平 ,略低于戚以政等 [ 11]报道的 160 g /kg
DM(原料为木薯 )水平 。
表 1　正交试验设计
水平 基质含水量(A) /% 发酵温度(B) /℃ 发酵时间(C) /h
1 52. 9 25 72
2 55. 1 28 78
3 57. 3 31 84
3　结论
本文在优化黑曲霉菌种活化培养基的基础上 ,
探讨了原料预处理 、基质含水量 、发酵温度 、发酵时
间对以陈化籼米为原料固态发酵法生产柠檬酸过程
的影响 ,并通过正交试验优化了发酵工艺条件。确
定出以 PDA为黑曲霉活化培养基 ,原料预处理采用
陈化籼米粉碎后 ,每 100 g米粉中加水 60g后蒸煮
(121℃、20 m in),可使淀粉适度糊化 ,基质分散性较
好 ,不黏结成团 ,发酵前需补充无菌水 ,有利于菌的
生长 ,基质的 pH不需调节。得出的固态发酵优化的
工艺条件为发酵前补水至含水量 52. 9%,发酵温度
25℃,发酵时间 84 h。此时柠檬酸的产量达 135. 4 g /
kg DM。另外根据对基质发酵前后蛋白质含量的测
定 ,表明蛋白质从 7. 5%上升到 12. 1%(干基 ),因此
柠檬酸提取后含较高蛋白质的基质可被利用为动物
饲料 。
参　考　文　献
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Non - glutinous Rice by Solid - state Fermentation
Zhou Jianxin　Ju X ingrong　Yang X iaorong　Xu Be ibei　Wu D ing　ChenW ei
(Jiangsu Provincia lKey Lab ofQ ua lity C ontro ls and Furthe r processing o f g rain and o ils ,
Nan jing Un iversity of F inance and Econom ics , Nan jing 210003)
Abstract　Pretreatment of raw m aterials and rela ted factors w ere investiga ted for citric acid production by so lid
- sta te fermen tation w ith A spe rg illus nige r and by using aged long - g ra in nong lu tinous rice as raw ma te ria.l The
proper pre treatment of the raw materials is obtained as follow s:using PDA as the culturemedium forA spe rg illus ni-
ge r, adding w ater in to the ground rice by 60% w /w , and steam ing thew a tered g round rice at 121℃ for 20m in. The
optimum cond itions of fermen tation are:initia lw a te r content o f substrate 52. 9%, cu lture temperature 25℃, and cul-
ture time 84h. A t the optimum conditions the y ield o f citric acid is 135. 4 g /kg (dry basis) and the pro tein content o f
the substrate afte r fermentation raises by 60%.
Key words　aged long - grain non - g lutinous rice, A sperg illus n iger, solid - sta te fermentation, citric acid, fe r-
men tation cond itions
7