全 文 ：第 30卷第 2期 武汉 科技 大学 学报 (自然 科学 版 ) Vol. 30 ,No. 2
2007年 4月 J. of Wuhan Uni. of Sci. &Tech.(Natural Science Edit ion) Apr. 2007
　　收稿日期:2006-09-20
作者简介:程　华(1978-),男 ,武汉科技大学讲师 ,博士. E-mai l:hbchh2008@163. com
通讯作者:余龙江(1966-),男 ,华中科技大学教授 ,博士. E-mai l:yulongjiang@hu st . edu. cn
岩黄连离体细胞培养及生物碱成分分析
程　华1 ,余龙江2
(1. 武汉科技大学医学院 ,湖北 武汉 , 430065;2. 华中科技大学生命科学与技术学院 ,湖北 武汉 , 430074)
摘要:选取岩黄连不同组织部位作为外植体诱导愈伤组织 , 调整基本培养基和初始 pH 值 ,经多次继代培养 ,
获得稳定生长的岩黄连离体细胞;采用薄层层析(T LC)、紫外扫描(UV)和高效液相色谱(HPLC)等方法对细
胞和植株中生物碱成分进行分析测定。结果表明 ,叶片最适于诱导愈伤组织;最佳基本培养基为 B5 , 初始 pH
值为 6. 0;岩黄连离体培养细胞的生长周期为 20 d 左右 ,第 15 天生物量最高 ,达到 15. 3 g /L(DW);细胞和植
株中生物碱成分有较大差别 ,但都含有脱氢卡维丁 ,细胞中脱氢卡维丁的含量为 0. 58 mg /g 。
关键词:愈伤组织;细胞培养;岩黄连;脱氢卡维丁
中图分类号:Q282. 13　　文献标志码:A　　文章编号:1672-3090(2007)02-0207-04
　　岩黄连(Corydalis saxico la Bunting)为紫堇
科紫堇属植物 ,多年生草本[ 1] ,主要活性成分为脱
氢卡维丁(Dehydrocavidine)[ 2] ;具有显著的抗菌 、
消炎 、镇痛和强安定作用 ,是桂西北山区用于消炎
止痛 、排毒 、治疗急慢性肝炎和肝硬化等疾病的一
种常用中草药[ 2 ～ 4] 。其分布局限于石灰岩山区 ,
属石山特有种 ,野生资源较少 ,被列入中国南部石
灰岩濒危植物名录[ 1] 。已制成的岩黄连总生物碱
注射液 ,用于临床主治肝炎特别是乙型肝炎 、肝硬
化 、肝癌等[ 2 ～ 4] ,最近发现其对肾病综合征 、出血
热也有较好疗效[ 5] 。由于岩黄连经济价值的显
现 ,引起人们大量采挖和收购 ,导致岩黄连资源极
度匮乏。为了缓解资源危机 ,植物细胞培养提供
了一种可行的替代方法 ,也是一种可持续开发利
用植物资源的重要措施 ,因而引起国内外广泛关
注[ 6 ～ 8] 。迄今为止 ,有关岩黄连离体细胞培养方
面的研究国内外未见报道 。本文旨在获得快速生
长的岩黄连离体细胞 ,确定其活性生物碱成分 ,为
后续细胞培养生产岩黄连生物碱以及生物碱合成
代谢的研究奠定基础 。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
将采自广西东南县的野生岩黄连植株移栽到
花盆中 ,待生长良好时 ,取不同部位作为组织培养
的外植体 。脱氢卡维丁标准品购于中国生物制品
检定所 ,乙腈为色谱级 ,其他试剂均为国产分析
纯。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　组织培养
分别以岩黄连植株的根 、茎 、叶作为外植体 ,
在 70%乙醇中浸泡 30 s ,转入 0. 1%的升汞溶液
中消毒 8 ～ 10 m in ,用无菌水漂洗 5 ～ 8 次 ,接入
B5 琼脂培养基中诱导愈伤组织 ,8周后 ,观察愈伤
组织形成情况(诱导率=出现愈伤组织的外植体
个数 /接种外植体个数)。挑选出生长快速的愈伤
组织 ,在 B5 培养基上进行反复继代培养 。培养基
为:B5 +0. 5 mg /L 2 , 4-D +2 mg /L BA ;培养条件
为:25±1 ℃,16 h 光照 。
1. 2. 2　测定生物量
培养物经布式漏斗抽滤 ,得细胞鲜重(FW),
然后将所得细胞置于 50 ℃烘箱干燥至恒重(约
48 h),称重得细胞干重(DW)。重复三次实验。
1. 2. 3　TLC分析
取稳定期细胞和岩黄连植株于 50 ℃烘干至
恒重 ,研成粉末作为样品 ,各取 1 g ,加 75%乙醇
(含 1%盐酸)20 mL ,室温下超声提取 3次 ,每次
1 h ,过滤去沉淀 ,滤液用氨水调 pH 为 9. 0 ,用 20
mL 氯仿萃取三次 ,合并氯仿提取液 ,加少量无水
硫酸钠 ,过滤 ,滤液加热蒸干 ,加入 0. 1 mL 甲醇
溶解作为制备液。取上述样品制备液各 10 μL ,
分别滴于同一硅胶 G(CMC)薄层板上 , 将正丁
武汉科技大学学报(自然科学版) 2007年第 2期
醇 、冰醋酸 、蒸馏水按 7∶1∶2(体积比)配制成展开
剂 ,展距 15 cm , 取出挥干 , 先置紫外灯下(365
nm)观察荧光 ,后喷以改良碘化铋钾试剂(Dra-
gendorf f)显色。
1. 2. 4　UV检测
取上述制备液各 10 μL ,用甲醇稀释适当倍
数 ,在 190 ～ 500 nm 区间扫描(UV 240 ,日本岛津
产品)。
1. 2. 5　HPLC 测定
参考吕光华等[ 9] 的方法 。精确称取 100 mg
细胞和植株样品 ,加 5 mL 75%乙醇(含 1%盐
酸),室温超声提取 3次 ,每次1 h ,过滤去沉淀 ,滤
液用氨水调 pH 为 9. 0 ,用 5 mL 氯仿萃取三次 ,
加少量无水硫酸钠 , 过滤 , 滤液加热蒸干 ,加入
0. 1 mL 甲醇溶解备用 。上样前过 0. 45 μm
滤膜 ,取 10 μL 上样 ,采用Waters 510液相色谱
仪 ,C18柱(Dikma DiamonsiL , 5μm , 250 mm ×
4. 6 mm),将乙腈 、水按 4∶6(φB)配制成流动相 ,
每升流动相加 3. 4 g 磷酸二氢钾和 1. 7 g SDS ,检
测波长 345 nm ,流速 1 mL /min ,柱温 25 ℃。
2　结果与分析
2. 1　愈伤组织诱导
不同外植体对于岩黄连愈伤组织的诱导
有较大影响(见图 1)。其中叶片的诱导率最高 ,
达 67. 1%。岩黄连根比较细小 ,在诱导过程中易
褐化 、坏死;而叶片诱导出愈伤组织的速度较快 ,
约 20 d左右 ,颜色淡黄 ,质地松散;茎诱导出愈伤
组织的速度较叶片慢 , 30 d 左右有愈伤组织出
现。结果表明叶片是最合适的诱导材料 。
图 1　不同外植体对岩黄连愈伤组织形成的影响(SD)
2. 2　基本培养基对细胞生长的影响
挑选质地松散 、生长快速的愈伤组织在 B5 +
0. 5 mg /L 2 , 4-D +2 mg /L BA 培养基上进行继
代培养 ,剔除培养过程中褐化严重和坏死的愈
伤组织 ,得到稳定生长的岩黄连细胞(见图 2)。
分别以 MS , B5 ,White 为基本培养基 ,添加 0. 5
mg /L 2 ,4-D ,2 mg /L 6-BA 和 3%蔗糖 ,接种 10 g
图 2　岩黄连离体培养细胞
岩黄连鲜细胞到 100 mL 培养基中 ,培养 15 d后
收集 ,烘干称重 ,不同基本培养基对岩黄连细胞生
长的影响如图 3所示 。从图 3 中可以看出 , B5 培
养基所得到细胞干重值最高。
图 3　基本培养基对岩黄连细胞生长的影响
2. 3　初始 pH 值对岩黄连培养细胞的影响
以 B5 为基本培养基 ,添加 0. 5 mg /L 2 , 4-D ,
2 mg /L 6-BA和 3%蔗糖 ,调节培养基的初始 pH
值分别为 4. 5 , 5. 0 , 5. 5 ,6. 0 , 6. 5 ,以 10%的接种
量接入岩黄连鲜细胞 ,培养 15 d后收集 ,烘干称
重。初始 pH 值对岩黄连细胞生长的影响如图 4
所示 。从图 4中可见 ,当 pH 为 4. 5 ～ 6. 0 时 ,随
pH 值的增加 ,收获的细胞干重增加 ,至 pH 值为
6. 0时达最大值 。当 pH 值为 6. 0 ～ 6. 5时 ,随
pH 值的增加 ,收获的细胞干重反而减少。
图 4　培养基初始 pH 值对岩黄连细胞生长的影响
2. 4　岩黄连离体培养细胞的生长曲线
在 B5 培养基上 ,岩黄连细胞的生长周期为
20 d左右(见图 5)。细胞鲜重和干重增长的时间
曲线相似 ,头 3天 ,细胞生长缓慢 ,有明显的延迟
期 ,之后 ,生物量迅速提高 ,为指数生长期 ,第 15
天鲜重和干重都达到最高值 ,分别为 401. 2 g /L
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2007年第 2期 程　华 ,等:岩黄连离体细胞培养及生物碱成分分析
和 15. 3 g /L 。15 d后 ,生物量开始缓慢下降。
图 5　岩黄连细胞培养生长曲线
2. 5　 TLC检测
取稳定期岩黄连细胞(Cell)和岩黄连植株
(Plant),提取生物碱成分进行 T LC 检测 ,结果如
图 6所示 。生物碱成分与改良碘化铋钾试剂反应
呈橙红色 ,在365 nm下显黄绿色荧光 。从图6中
看出 ,细胞培养物与岩黄连植株中的生物碱成分
并不完全相同 。细胞中出现 5个橙红色斑点 ,而
植株主要显示 6个斑点;细胞中未出现图中白箭
头所示斑点 ,而植株中没有燕尾型箭头所示斑点;
细胞和植株中都含有图中黑箭头所示斑点 ,在
365 nm紫外照射下显黄绿色荧光 ,R f 值为 0. 38。
图 6　生物碱 TLC图
A—365 nm 紫外照射;B—改良碘化铋钾显色
2. 6　UV 扫描
岩黄连细胞和植株中生物碱的 UV 扫描结
果如图 7所示 。从图 7中可以看出 ,两者之间存
在明显差异:细胞中生物碱波长为 210 nm 处出
现吸收谷 ,而植株中生物碱在 210 nm 处出现吸
收峰;细胞中生物碱在 230 nm 处有最大吸收峰 ,
而植株中生物碱在 225 nm 处有最大吸收峰;细
胞中生物碱在330nm处有吸收峰 ,植株中生物
图 7　岩黄连细胞和植株中生物碱的 UV扫描图
碱在 330 ～ 345 nm 处有吸收峰 。
2. 7　HPLC鉴定
对细胞和植株的总生物碱成分进行液相色谱
分离 ,结果如图 8 所示 。图 8 中 , 2号峰与标准品
脱氢卡维丁(17. 4 min)的保留时间一致 ,确定细
胞和植株中含有脱氢卡维丁;1号峰两者均有;3 ,
4 ,5号峰可能为培养细胞中产生的新生物碱成分。
经测定 ,细胞中脱氢卡维丁含量为 0. 58 mg
g - 1 ,为植株中脱氢卡维丁含量的 1 /10(见图 9)。
图 8　样品(A , B)和标准品(C)的液相色谱图
A —细胞;B—植株;C—脱氢卡维丁标准品.
图 9　细胞和植株中生物碱含量
3　讨论
本文以濒危植物———岩黄连为材料 ,诱导愈
伤组织 ,通过反复继代培养的方法得到快速生长
的岩黄连离体细胞。实验中选取岩黄连不同组织
部位作为外植体诱导愈伤组织 ,发现岩黄连叶片
最适合诱导愈伤组织;对基本培养基进行选择优
化 ,发现 B5 培养基和 MS 均适合岩黄连细胞的生
长 ,而 B5 更佳;初始 pH 对岩黄连细胞的生长有
一定影响 ,最佳初始培养基 pH 值为 6. 0 ,此时获
得的细胞生物量最高;岩黄连离体培养细胞的生
长周期为 20 d左右 ,最大生物量出现在第 15天 ,
表明该培养基适合岩黄连细胞的生长 ,可作为继
代培养基使用 。
对离体细胞中的生物碱成分进行提取分析 ,
发现与原植株中的生物碱有较大不同(见图 6 ,图
7 ,图 8)。细胞中可能出现了新的生物碱成分 ,如
图 8中的 3 , 4 , 5 ,这可能与组织特异型基因的表
达相关 ,在去分化的细胞中 ,某些生物碱合成的关
键酶基因没有被启动表达 ,而另一些被启动表达 ,
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武汉科技大学学报(自然科学版) 2007年第 2期
也有可能是诱导培养导致基因突变 。Ramachan-
dra Rao 等[ 6]认为 ,植物细胞培养可能产生原植物
中没有的新的代谢产物 ,但具体机制还没有定论。
岩黄连的主要活性成分———脱氢卡维丁 ,在培养
的细胞和植株中都存在 ,细胞中的含量虽然比植
株中低 ,但细胞生长快速 ,一个周期只需 20 d ,另
一方面 ,离体细胞可以进行大规模放大培养获得
较大生物量 ,从而弥补有效成分含量低的缺点。
由于脱氢卡维丁是主要的药用成分 ,因此还有必
要从改进培养方式和代谢调控等方面进行深入研
究 ,以期提高离体培养细胞中脱氢卡维丁含量 。
4　结论
以岩黄连叶片作为外植体 ,选取 B5 培养基作
为基本培养基 ,并调整初始培养基 pH 值为 6. 0 ,
诱导得到岩黄连愈伤组织 ,并通过反复继代培养
的方法可以得到快速生长的岩黄连离体细胞 ,其
生长周期为 20 d左右 。该离体细胞与原植株相
比 ,生物碱成分有较大不同 ,但均含有岩黄连的主
要活性成分———脱氢卡维丁。该结果为后续细胞
培养生产岩黄连生物碱以及生物碱合成代谢的研
究奠定了基础。
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Generation of alkaloids in cell cultures of Corydalis saxicola Bunting
Cheng Hua1 , Y u Long j iang 2
(1. Medical Colleg e , Wuhan Univer sity of Science and Techno log y , Wuhan 430080 , China;
2. Schoo l o f Life Science and Techno lo gy , Huazhong University of Science and Techno log y , Wuhan 430074 , China)
Abstract:This study is conducted to establish the cell cultures of Co rydalis saxico la Bunt ing w i th the
method o f tissue cul ture and invest igate the generation o f alkaloids in cell cultures. To tal alkaloids ex-
t racted f rom the cell cul tures and plants of Corydalis saxicola Bunting are analyzed by means o f TLC ,
UV and HPLC. The results show that:the leaf i s the most favo rable explants fo r callus induct ion;
the B5 basal medium is best for cell g row th;and the fav orable initial pH value of medium is 6. 0. The
grow th period of the cell cultures is around 20 day s w ith the highest biomass (15. 3 g /L , DW) found
on Day 15. T he alkaloid components o f the cells are different f rom tho se of the plant , though they all
contain dehydrocavidine , w ith the content of dehydrocavidine in cells being 0. 58 mg /g. The results of
the study may provide some reference for the larg e-scale production of Corydalis saxicola Bunting alka-
loids using plant cell cultures.
Key words:callus;cell culture;Corydalis saxicola Bunting ;dehydrocavidine
[责任编辑　彭金旺]
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