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第 31 卷第 1 期 分析试验室 Vol. 31． No． 1
2012 年 1 月 Chinese Journal of Analysis Laboratory 2012 － 1
收稿日期:2011-08-22;修订日期:2011-09-26
基金项目:广西科技厅科技开发计划项目(桂科攻 0992003A-7)、国家科技部中澳国际合作项目(2009DFA31230)和广
东省产学研项目(2009B090300276)资助
作者简介:梁镇然(1987 －) ，男，硕士研究生;E － mail:lzr2148@ gmail． com
高速逆流色谱与硅胶柱层析联用分离岩黄连中的
2 种原小檗碱型季胺生物碱
梁镇然1，蔡锐燕1，蒋 林1，赵志敏1，杨得坡1，2，朱龙平1，2，王冬梅* 1
(1．中山大学药学院天然药物与中药研究所，广州 510006;
2．广东省现代中药工程技术研究开发中心，广州 510006)
摘 要:建立了分离岩黄连 2 种生物碱的方法。岩黄连醇提物经溶剂萃取后的
水相提取物，经过硅胶柱层析粗分离，对其中一个流分采用高速逆流色谱法，以
正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水-氨水(体积比为 0. 4:1. 5:4:0. 4:5:0. 11)为两
相溶剂系统，下相为固定相，上相为流动相，通过一次高速逆流色谱，即可从
64. 81 mg 样品中分离得到 9. 28 mg 纯度为 97. 0% 的去氢碎叶紫堇碱
(dehydrocheilanthifoline)和 4. 38 mg 纯度为 90. 7% 的脱氢异阿朴卡维汀
(dehydroisoapocavidine) ，并通过与对照品 HPLC 保留时间的比较，以及 ESI-MS
测定分子量，确认了化合物的结构。该方法降低了反复的柱层析导致的样品损
失，也为上述两种化合物的药理研究提供了物质基础。
关键词:高速逆流色谱;岩黄连;生物碱
中图分类号:O657. 7 文献标识码:A 文章编号:1000-0720(2012)01-98-04
岩黄连，系罂粟科(Papaveraceae)紫堇属多年
生草本植物石生黄堇 Corydalis saxicola Bunting 的
全草［1］，其主要有效成分为生物碱［2］，民间多用于
治疗肝炎、肝硬化、肝癌等疾病［3，4］。
目前分离岩黄连生物碱的方法，最常用的是反
复的硅胶柱层析，Shephadex LH-20、C18反相硅胶、
MCI gel CHP-20P 柱层析也有使用［2，5，6］。岩黄连
醇提取物经不同极性有机溶剂分步萃取后，余下的
水相提取物中仍含有大量水溶性较好的季胺生物
碱，如果经硅胶柱层析初步分离后，继续采用硅胶
柱层析进行较为精细的分离，会产生十分严重的不
可逆吸附，既影响收率，也容易产生拖尾现象，影响
分离效果。凝胶柱层析和 C18反相硅胶柱层析分离
效果比硅胶柱层析好，但不可逆吸附始终存在，仍
然会造成损失，而且成本也较高。
高速逆流色谱(HSCCC)由于使用普通溶剂而
不是固相载体作为固定相，可以最大限度地避免因
固相载体的不可逆吸附所导致的损失、污染、失活
变性等问题，提高分离效率［7］。有文献报道
HSCCC用于分离岩黄连中的脱氢卡维汀［8］，但用
于岩黄连系统分离则未见报道。
本文将硅胶柱层析和 HSCCC 的特点相结合，
先用硅胶柱层析对岩黄连水相提取物进行初步分
离，之后对硅胶柱层析得到的流分进行 HSCCC 分
离，旨在建立一种操作简单，从岩黄连水相提取物
中分离得到生物碱单体化合物的方法。
1 实验部分
1. 1 试剂与仪器
柱层析硅胶(48 ～ 75 μm，青岛海洋化工) ;正
己烷、乙酸乙酯、氯仿、甲醇、正丁醇、氨水、乙酸、乙
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DOI:10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2012.0024
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酸铵均为分析纯，HPLC 分析所用乙腈为色谱纯
(天津星马克) ，水为超纯水。去氢碎叶紫堇碱和
脱氢异阿朴卡维汀对照品、岩黄连醇提取物为本实
验室自制。
QuilPrepTM ChassisMK V 500 /Series II HPLC
Pump高速逆流色谱仪(英国 AECS /美国 SSI) ，配
有自动流分收集器。岛津 LC-20AB 泵、岛津 SIL －
20A自动进样器、岛津 SPD-M20A二极管阵列检测
器(日本岛津)。TSQ Quantum 液质联用仪(美国
Finnigan)。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 硅胶柱层析 岩黄连醇提物用适量水分
散后，经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到水相
提取物。取水相提取物 2. 8 g 样品干法上样进行
硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，用硅胶薄层层析
(展开剂为氯仿:甲醇 = 75:25)检测，合并组成相
同流分，得到 8 个流分。选择含有目标化合物的流
分 6(Fr. 6) (315. 72 mg)作为 HSCCC的分离对象。
1. 2. 2 HSCCC 两相溶剂系统的选择 将不同溶
剂以不同体积比配制两相溶剂系统，测定其分层时
间，以及 Fr. 6 中目标成分的分配系数 K。步骤如
下:按比例配好两相溶剂系统，剧烈振摇，静置分层
后，记录分层时间;若少于 30s，加入少量样品，剧
烈振摇并分层后，取相等体积的上、下相用 HPLC
检测，在 280 nm波长下计算上相和下相的峰面积，
上相峰面积与下相峰面积之比即为 K值。
1. 2. 3 HSCCC分离 按照选定好的两相溶剂系统
的组成比例配制溶剂，充分混合后静置分层。取下
相作为固定相，上相作为流动相，超声去除气泡。用
输液泵将固定相注满线圈(线圈体积 118 mL)后，启
动 HSCCC主机，调节转速为 860 r /min，以尾进头出
方式、1. 5 mL /min的流速注入流动相。当流动相从
出口流出且不再有固定相流出时，说明体系已经达
到流体动力学平衡，记录流出的固定相体积，计算固
定相保留率。分别量取 4 mL 上相和下相溶剂混合
后，加入 Fr. 6样品适量进行溶解，进样，进行 HSCCC
分离，出口在 280 nm下检测。自动流分收集器每 5
min收集一个流分。分离结束后，停止转动线圈，用
甲醇将线圈内的固定相置换出来。
1. 2. 4 HPLC检测 采用 HPLC检测水相提取物、
硅胶柱层析各流分、测定峰面积和 HSCCC分离后各
流分中化合物的纯度。色谱条件:GeminiTMC18色谱
柱(5 μm，250 mm × 4. 6 mm i． d．，Phenomenex
Inc．，USA)。流动相为乙腈和20 mmol /L乙酸铵溶
液(乙酸调节 pH为 4. 66) ，梯度洗脱，其中乙腈的梯
度为:0 ～ 10 min，15% ～ 20%;10 ～ 20 min，20% ～
22%;20 ～25 min，22%;25 ～ 30 min，22% ～ 24%;30
～45 min，24% ～ 29%;45 ～ 55 min，29% ～ 80%;55
～65 min，80% ～90%，流速为 1 mL /min。柱温为室
温，进样量 30 μL，检测波长 280 nm。
2 结果与讨论
2. 1 硅胶柱层析所得流分 6 的 HPLC分析
水相提取物(DW)及其硅胶柱层析粗分离所
得流分 Fr. 6 的 HPLC图谱见图 1。与对照品 HPLC
分析的保留时间进行对照，得知色谱峰 I、II、III 分
别为去氢碎叶紫堇碱、脱氢异阿朴卡维汀和巴
马汀。
图 1 水相提取物和硅胶柱层析流分 6 的 HPLC 色
谱图
Fig． 1 HPLC chromatograms of water phase
extract and its Fr. 6 obtained by silica gel
column chromatography
Ⅰ －去氢碎叶紫堇碱;Ⅱ －脱氢异阿朴卡维汀;Ⅲ －
巴马汀
据文献报道，脱氢异阿朴卡维汀和去氢碎叶紫
堇碱在乙肝病毒转染的 HepG2. 2. 15 细胞实验模
型中，具有显著的抑制细胞分泌 HBsAg 和 HBeAg
的活性［6，8］，为岩黄连抗乙肝的重要活性成分。经
硅胶柱层析初步分离，Fr. 6 中较好地富集了这两
个化合物，故将 Fr. 6 确定为下一步 HSCCC 分离的
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研究对象，为以后进一步探讨两者的药理作用机制
提供必要的物质基础。
2. 2 HSCCC两相溶剂系统的选择
一个适合用于 HSCCC的溶剂系统需要满足一
定条件，例如分层时间短(一般要求少于 30 s) ，K
值在 0. 5 ～ 2 之间，被分离化合物的 K 值之间要有
一定差别，样品的溶解度要好，上下相体积相差不
大以减少溶剂的浪费，等等。
本研究比较了正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(溶
剂系统 A)和正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水(溶
剂系统 B)两个溶剂系统，发现采用溶剂系统 A
时，化合物集中分配于下相，上相中分配得非常少，
可能是由于该溶剂系统上相以正己烷和乙酸乙酯
为主，而原小檗碱型季胺生物碱在这两种溶剂中的
溶解度都比较小，故不采用此溶剂系统。对于溶剂
系统 B，对各溶剂的组成比例进行筛选，并加入少
量的氨水，发现选择正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-乙
醇-水-氨水(体积比为 0. 4:1. 5:4:0. 4:5:0. 11)体
系时，两相分层时间为 28 s，化合物去氢碎叶紫堇
碱与脱氢异阿朴卡维汀的 K 值分别为 0. 400 和
0. 876，二者之间分离因子较大，故选定此溶剂系统
作为 HSCCC分离的溶剂体系。
2. 3 HSCCC分离结果
取 64. 81 mg Fr. 6 样品进行 HSCCC分离，分离
时间 210 min，固定相保留率 69. 5%。从图 2
HSCCC 图谱可见，主要分为 3 个峰。进行 HPLC
分析并用峰面积归一法测定纯度，在 50 ～ 80 min
的流分可得到 4. 38 mg纯度为 90. 7%的化合物 II，
与对照品的保留时间一致，ESI-MS 测得［M +］为
m/z 336，故确定该化合物为脱氢异阿朴卡维汀。
在 145 ～ 180 min的流分可得到 9. 28 mg纯度为
图 2 流分 6 的高速逆流色谱图
Fig． 2 HSCCC chromatogram of Fr． 6
97. 0%的化合物 I，与对照品的保留时间一致，ESI-
MS测得［M +］为 m/z 322，故确定该化合物为去氢
碎叶紫堇碱(图 3)。
图 3 高速逆流色谱分离产物的 HPLC色谱图
Fig． 3 HPLC chromatograms of products separated
by HSCCC
流分 I:去氢碎叶紫堇碱;流分 II:脱氢异阿朴卡维汀
3 结论
本实验采用正己烷 －乙酸乙酯 －正丁醇 －乙醇
－水 －氨水(体积比为 0. 4:1. 5:4:0. 4:5:0. 11)的溶
剂系统，建立了从岩黄连水相提取物的硅胶柱层析
流分 6中分离得到脱氢异阿朴卡维汀和去氢碎叶紫
堇碱 2种化合物的方法，可为深入的药理研究提供
必要的物质基础。作为一种新型分离技术，HSCCC
具有简便、节省溶剂、分离效果好、成本低的特点。
硅胶等传统柱层析填料容易与生物碱产生不可逆吸
附，影响分离效果，造成样品的损失，而 HSCCC作为
不使用固体填料的分离方法，非常适用于生物碱的
分离，尤其是极性较大的水溶性生物碱成分。随着
HSCCC技术的日渐成熟，其在天然产物分离中的使
用将会越来越广泛，具有广阔的应用前景。
参考文献
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［9］ 王冬梅，王一飞，杨得坡，等． 中国发明专利，
201110030042. 6，2011 － 06 － 01
Separation of two quaternary protoberberine alkaloids in corydalis saxicola bunting by high-speed
counter-current chromatography combined with silica gel column chromatography
LIANG Zhen-ran1，CAI Rui-yan1，JIANG Lin1，ZHAO Zhi-min1，YANG De-po1，2，ZHU Long-ping1，2 and WANG
Dong-mei* 1(1． Institute of Natural Products and Chinese Medicine，School of Pharmaceutical Sciences，Sun Yat-
sen University，Guangzhou 510006;2． Guangdong Technology Research Center for Advanced Chinese
Medicine，Guangzhou 510006) ，Fenxi Shiyanshi，2012，31(01) :98 ～ 101
Abstract:A method was developed for the separation of two quaternary protoberberine alkaloids． After
partitioned by different organic solvents，the water residue of the ethanolic extract of Corydalis saxicola Bunting
was fractioned by silica gel column chromatography． The fraction contained dehydrocheilanthifoline and
dehydrocheilanthifoline was chosen for the further separation by high-speed counter-current chromatography with
two-phase solvent system composed of n-hexane-ethylacetate-n-butanol-ethanol-water-ammonia (0. 4∶ 1. 5∶ 4∶ 0. 4
∶ 5∶ 0. 11 in volume ratio)． The lower phase was used as stationary phase and the upper phase as mobile phase．
As the result， 9. 28 mg of dehydrocheilanthifoline (purity 97. 0%， HPLC ) and 4. 38 mg of
dehydroisoapocavidine (purity 90. 7%，HPLC)were obtained from 64. 81 mg of sample． The structures of the
isolated compounds were confirmed by the comparison of their retention time in HPLC and ESI-MS spectra with
those of standard references．
Keywords:High-speed counter-current chromatography;Corydalis saxicola Bunting;Alkaloids
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