全 文 ：江西农业学报　2009, 21(11):30 ～ 32ActaAgriculturaeJiangxi
雌雄芦笋过氧化物酶及酯酶同工酶的比较研究
李 霞 , 牟 萌 ,李书华 ,杨 林 ,逄少堃 ,刘宁 ,包艳存 ,李芳 ,李保华 ,郑红霞
　　收稿日期:2009-09-24
基金项目:山东省自然科学基金项目(2006ZRA07005)。
作者简介:李霞(1976-),女,山东莱芜人 ,助理研究员 ,硕士 ,主要从事芦笋遗传育种研究。
(潍坊市农业科学院,山东潍坊 261061)
摘　要:采用聚丙烯酰胺不连续垂直平板电泳(PAGE)技术 , 对芦笋雌雄株叶片的过氧化物酶(POD)同工酶及酯酶
(EST)同工酶酶谱进行了比较分析。结果表明 ,芦笋过氧化物酶同工酶及酯酶同工酶在雌雄株叶片中存在差异, 过氧化物酶
同工酶在雄株中多了 Rf值为 0.78的一条酶带;酯酶同工酶在雄株中多了 Rf值为 0.93的一条酶带。
关键词:芦笋;雌雄异株;过氧化物酶同工酶;酯酶同工酶
中图分类号:S644.6　文献标识码:A　文章编号:1001-8581(2009)11-0030-03
ComparativeStudyonPeroxidaseandEsterasePatternsinMale
andFemale-PlantsofAsparagusofficinalis
LIXia, MUMeng, LIShu-hua, YANGLin, PANGShao-kun, LIUNing,
BAOYan-cun, LIFang, LIBao-hua, ZHENGHong-xia
(WeifangAcademyofAgriculturalSciencesinShandongProvince, Weifang261061, China)
Abstract:Inthispaper, peroxidase(POD)andesterase(EST)intheleavesofmaleandfemaleplantsinAsparagusoficinalis
L.werecomparativelyanalyzedbyusingpolyacrylamidegelelectrophoresis(PAGE)andbiochemicalstaining.Theresultsindicated
thatthepaternsofPODandESTisozymewereobviouslydiferentinmaleandfemaleplant.Themale-planthadanotherband(Rf=
0.78)ofPODandanotherband(Rf=0.93)ofEST, whichdidnotexistatallinfemale-plant.Sotheycanbeusedasthemarkers
insexidentificationofAsparagusoficinalis.
Keywords:Asparagusoficinalis;Dioecious;Peroxidase;Esterase;Isozyme
　　同工酶是植物基因表达较直接的产物 ,其变异与性
状遗传有着密切关系 ,每个品种的同工酶谱带的数量基
本稳定。同工酶的形成是生物在进化过程中对代谢适应
的结果。同一种群中的不同个体、不同性别 、同一个体的
不同发育阶段以及同一个体不同组织 、不同器官中同工
酶的表达都存在差异 。同工酶作为遗传 、生化指标已广
泛应用于动植物遗传多样性、生物进化、种系发生 、资源
评价等方面的研究[ 1 ～ 6] 。植物的性别主要是受基因调控
的 ,同工酶是分子水平的指标 ,其变化先于性别的表现。
因此 ,通过分析同工酶差异鉴定雌雄异株植物植株性别 ,
探索植物性别的决定和分化机制是可行的 ,并且已经在
银杏[ 7] 、构树[ 8] 、野生葡萄[ 9]等雌雄异株植物的研究中
有初步的进展。
芦笋(AsparagusoficinalisL.),又名石刁柏 ,属百合
科天门冬属多年生草本植物。芦笋嫩茎营养丰富 ,脆而
多汁 ,风味独特 ,是一种具有较高药用 、营养和保健价值
的蔬菜。芦笋是雌雄异株宿根性植物 ,开花前无法判定
性别 。由于雄株高产 ,生产上亟需全雄优良品种 ,而分株
繁殖虽能获得少量遗传一致的植株 ,但难以大规模进行。
聂一农等 [ 10]对芦笋雌雄株过氧化物酶同工酶进行了研
究 ,结果表明雌株酶带均比雄株多一条。范双喜等 [ 11]也
得出了同样的结果。洪达等 [ 12]对芦笋雌雄株叶片中的 4
种同工酶进行了分析研究 ,结果表明芦笋雌雄株之间的
过氧化物酶同工酶及酯酶同工酶酶谱存在显著差异。说
明芦笋性别差异与过氧化物酶同工酶及酯酶同工酶谱带
的数目有关。本研究对芦笋雌雄株的过氧化物酶同工酶
及酯酶同工酶的酶谱差异进行分析 ,旨在为进一步揭示
芦笋性别决定的机制提供理论参考。
1　材料与方法
1.1　材料　供试材料鲁芦笋一号均从潍坊市农科院试
验场种植取得 ,随机取 10株雌株 , 10株雄株 ,单株取样 ,
植株性别根据花器官鉴定 。
1.2　方法
1.2.1　同工酶样品制备　分别剪取已知性别的芦笋幼
嫩叶片 0.5g,加入 1.5mL提取缓冲液(Tris12.1 g,加水
定容至 1000 mL, pH8.0),冰浴下充分研磨 , 3500 r/min
离心 15 min,取上清备用。每个实验重复 10次 。
1.2.2　过氧化物酶同工酶测定　电泳:采用垂直平板聚
丙烯酰胺不连续凝胶电泳技术 ,分离胶(8.13%),浓缩
胶(3.56%)。电泳缓冲液为 Tris-甘氨酸缓冲液(Tris6
g,甘氨酸 28.8 g,加水定容至 1000 mL, pH8.3,用时稀释
10倍 。)。每管上样 40μL,点好样后在矮板面加 2滴
0.1%溴酚蓝指示剂 。室温下先 180 V电泳 ,等指示剂进
入分离胶后改为 220 V,待指示剂距离胶下边缘 1 cm左
右时停止电泳。染色:采用醋酸联苯胺染色法 [ 13] ,其中
有所改动。染色液的配制:称取联苯胺 0.2 g加 10 mL
无水乙醇溶解 ,依次加入 20 mL5 mol/L乙酸 , 20mL1.5
mol/L乙酸钠 , 150 mL蒸馏水 ,染色前加 500 μLH2O2 ,
混匀后将胶轻轻剥入其中 ,染色 10 ～ 15 min。出现酶带
后 ,立即冲洗 ,照相 。
1.2.3　酯酶同工酶测定　电泳:电泳方法同过氧化物
酶。染色:采用坚牢蓝 RR盐法[ 14] ,其中有所改动。染色
液配制:0.2g坚牢蓝 RR盐、0.1gα-乙酸萘酯和 0.1 g
β -乙酸萘酯 ,分别溶于 10 mL丙酮中然后倒入 300 mL
0.1mol/LpH值 6.4的磷酸缓冲液(2.847 gNa2HPO4·
12H2O, 3.441 gNaH2PO4· 2H2O)中 。混匀后将胶轻轻
剥入其中 ,染色 10 ～ 15 min。出现酶带后 ,立即冲洗 ,
照相 。
1.2.4　酶带分析　分析参照 Gosling[ 15]的方法 ,即以各
种酶谱的相对迁移率(Rf=d/l, d为酶带迁移距 , l为指
示剂迁移距离)由小到大依次命名。
2　结果与分析
2.1　芦笋雌雄株 POD同工酶的酶谱分析　由图 1可
以看出 ,芦笋雌雄株叶片中的过氧化物酶同工酶共分离
出 6条谱带 ,其 Rf值由小到大依次为 0.13、0.33、0.49、
0.58、0.60、0.78, 6条谱带中有 3条共有带 ,即 POD-1、
POD-2、POD-3。POD-4与 POD-5在 10株雄株中都
存在 ,雌株中有 3个单株存在 ,并且 POD-4与 POD-5
在雌雄株表现的强弱不同。 POD-6为雄株中的特
有带。
2.2　芦笋雌雄株酯酶同工酶酶谱分析　由图 2可以看
出 ,芦笋雌雄株叶片中的酯酶同工酶共分离出 6条谱带 ,
其 Rf值由小到大依次为0.04、0.27、0.47、0.73、0.84、
0.93, 6条谱带中有 5条共有带 ,即 EST-1、EST-2、EST
-3、EST-4、EST-5。EST-6为雄株中的特有带。
图 1　芦笋雌雄株 POD同工酶图谱(左 10株是雌株 ,右 10株是雄株)
图 2　芦笋雌雄株 EST同工酶图谱(左 10株是雌株 ,右 9株是雄株)
3　讨论
同工酶是广泛应用于动植物遗传多样性、生物进
化、种系发生等方面研究的分子标记之一[ 1～ 6] ,也可用来
分析生物性别间的生化和遗传差异。过氧化物酶普遍存
在于高等植物中 ,并在高等植物的生长发育中起重要作
用。由于过氧化物酶是基因表达的产物 ,因此我们希望
通过雌雄株间过氧化物酶同工酶谱带的差异研究 ,对雌
雄株间的差异有进一步的了解。酯酶为水解萘乙酸酯的
酶 ,属非特异性酶。酯酶存在于植物各部位和不同发育
时期 ,并且无论在哪个部位或生长发育阶段变化都很小 ,
即酶谱比较稳定 ,可作为遗传特性分析的生化指标 。菠
菜酯酶同工酶在叶片中分别存在 1条雄性特异的谱带。
结果还发现除花中的酯酶酶谱外 ,两种同工酶在同一性
别的不同个体间的酶谱无明显差异 [ 16] 。芦笋雌雄株叶
片间的谷氨酸脱氢酶和淀粉酶同工酶酶谱具有相同的谱
带 ,而在过氧化物酶和酯酶同工酶谱带间存在显著差
异 [ 12] 。本实验在芦笋雌雄株叶片中也发现了过氧化物
酶和酯酶同工酶的雄性特异性谱带 ,其 Rf值分别为
0.78、0.93。经过 20株开花植株 10次的重复实验验证 ,结
果均一致。进一步证实了洪达等[ 12]的研究结果的准确性。
而与范双喜等[ 11]在过氧化物酶同工酶研究上有差异。虽
然同工酶指标在一定情况下可用来鉴定雌雄异株植物的
性别 ,但由于这一指标的测定易受环境因素等的影响 ,过
氧化物酶和酯酶是否可以作为芦笋性别鉴定的可靠手段
还需要进一步的研究 ,在研究同工酶作为芦笋性别标记的
同时需要进一步探索其作用机制和表达特性 。
31　11期　　　　　　　　　　　　李霞等:雌雄芦笋过氧化物酶及酯酶同工酶的比较研究
参考文献:
[ 1] BasagliaF, MarhetiMG, SalvatoreliG.Genetic, Developmen-
talandComparativeAnalysisofLDH, MDHandGPIIsozymesin
theSheepsheadBream(DiploduspuntazoGm.)[ J] .Compara-
tiveBiochemistryandPhysiology-PartB:ComparativeBio-
chemistry, 1990, 96(2):257～ 266.
[ 2] AlekhovaT, SofinA, KobelkovaT, etal.Sex-linkedDifer-
encesinActivityofEnzymesintheBloodoftheUrodeleAmphib-
ianPleurodeleswaltl[ J] .ComparativeBiochemistryandPhysiol-
ogy-PartA:Molecular＆ IntegrativePhysiology, 2001, 130
(4):819～ 825.
[ 3] 秦玉星 ,龚榜初.基于分子生物技术的栗属植物遗传多样性研
究进展 [J].湖南农业科学 , 2007, (4):38～ 40.
[ 4] 赵沙沙 ,张海娣 ,张建垒 ,等.“黄金冠”桃及其品系亲缘关系分
析研究 [J].安徽农业科学 , 2008, 36(34):14944 ～ 14945.
[ 5] 唐雪峰 ,李建柱.血液生化遗传多态性研究进展及其在绵羊遗
传育种中的应用 [ J] .安徽农业科学 , 2007, 35(29):9271 ～
9272, 9278.
[ 6] 赵晓平 ,荣威恒 ,刘玲玉 ,等.5种杨树种间及品种间同工酶的
比较分析 [J].安徽农业科学 , 2008, 36(6):2262～ 2264.
[ 7] 钟文海 ,杨中汉 ,朱广廉.根据过氧化物酶同工酶图谱鉴定银
杏植株的性别 [ J].林业科学 , 1982, 18(1):1 ～ 5.
[ 8] 赵云云.雌雄构树过氧化物酶同工酶的比较研究 [ J] .首都师
范大学学报(自然版), 1996, 17(2):84～ 87.
[ 9] 晁无疾.我国葡萄野生种植资源的同工酶研究初报 [ J] .中国
果树 , 1981, (4):41 ～ 44.
[ 10] 聂一农 ,胡绍燕.用过氧化物酶同工酶酶谱鉴定芦笋(Aspar-
agusofficinalisL.)植株性别的研究初报 [ J] .北京农学院学
报 , 1988, 3(3):26～ 29.
[ 11] 范双喜 ,宋雪峰.石刁柏性别表现与同工酶的关系 [ J] .华北
农学报 , 1995, 10(2):67～ 71.
[ 12] 洪达 ,孙富从 ,姬艳克 ,等.芦笋雌雄性别间同工酶酶谱的比
较分析 [ J] .河南师范大学学报(自然科学版), 2008, 36(1):
111～ 114.
[ 13] 雷宁菲 ,苏智先 ,陈劲松.同工酶技术在植物研究中的应用 [J] .
四川师范学院学报 (自然科学版), 2000, 21(4):321～ 325.
[ 14] 赖德 CC,泰勒 CB.范培吕译.生物学研究概说—同工酶
[ M].北京:科学出版社 , 1987.
[ 15] GoslingEM.GeneticVariabilityinHatchery-producedPacific
Oysters(CrassostreagigasThunberg)[ J] .Aquaculture, 1982,
26(3-4):273 ～ 287.
[ 16] 高武军 ,肖理会 ,卢龙斗 ,等.菠菜的性别相关同工酶标记分
析 [ J].河南师范大学学报(自然科学版), 2006, 34(4):147
～ 150.
(上接第 29页)
烟区烤烟的化学成分较协调 ,但多重比较结果显示 ,环
神农架烟区化学成分指标中只有烟碱和糖碱比与津巴
布韦差异不显著 ,其他指标均达到了 0.05的显著水平 ,
说明该区域的化学成分与津巴布韦仍有一定差距;在感
官评吸质量方面 ,神农架、房县、保康县的部分样品达到
了津巴布韦烟叶的水平 ,大部分样品的评吸各项指标得
分稍逊于津巴布韦 ,说明环神农架烟叶的感官质量与津
巴布韦烟叶有一定的差距。
(3)生态因素对烟叶的质量及风格的形成具有重要
作用 [ 14] ,我们在追求津巴布韦、巴西等国外烟叶优良品
质的同时 ,应该认识到由于生态条件 、农业耕作制度等
因素的影响 ,我国烟叶很难也不需要与国外优质烟叶质
量风格相同 ,我国幅员辽阔 ,资源丰富 ,烟叶风格的多样
性也是其他产烟国不能企及的。我们需要做的是找出
与国外烟叶的差距 ,通过改善生态环境和因地制宜的栽
培、烘烤措施来进一步提高我国烟叶的整体质量 ,形成
具有中国特色的烟草制品。
参考文献:
[ 1] 闫克玉 ,赵献章.烟叶分级 [ M].北京:中国农业出版社 , 2003.
[ 2] 许自成 ,王林 ,王金平 ,等.湖南烤烟化学成分与土壤有机质含
量的关系分析 [ J] .生态学杂志 , 2006, 25(10):1186.
[ 3] 肖吉中 ,江锡瑜 ,黄立栋 ,等.烤烟叶片重量与质量关系的初步
研究 [ J].烟草科技 , 1995, (2):30.
[ 4] 黎妍妍 ,黄元炯 ,许自成 ,等.河南烟区烟叶质量可用性的综合
评价 [ J].安徽农业科学 , 2006, 34(9):1903.
[ 5] 章新军 ,任晓红 ,毕庆文 ,等.鄂西南烤烟主要化学成分与评吸
质量的关系 [ J] .烟草科技 , 2006, (9):58.
[ 6] 于建军 ,庞天河 ,章新军 ,等.鄂西南烤烟吸食质量与致香物质
的关系 [ J].华中农业大学学报 , 2006, 25(4):355～ 358.
[ 7] 周冀衡 ,刘建利 ,余砚碧 ,等.津巴布韦烤烟生产技术现状分析
[J].烟草农业科学 , 2006, 2(2):113 ～ 117.
[ 8] 朱维华.开发替代进口烟叶思路初探 [ J] .贵州烟草 , 2004,
(4):25～ 27.
[ 9] 罗勇 ,李明海 , 李国州 ,等.强化服务意识创新管理模式落实
“两个解放”—遵义市 2004年部分替代进口烟叶生产示范项
目工作概况 [ J] .贵州烟草 , 2005, (4):1～ 7.
[ 10] 肖协忠.烟草化学 [ M].北京:中国农业出版社 , 1997.
[ 11] 史宏志 , 刘国顺.烟草香味学 [ M] .北京:中国农业出版
社 , 1998.
[ 12] 于建军.卷烟工艺学 [ M].北京:中国农业出版社 , 2003.
[ 13] 王瑞新.烟草化学 [ M].北京:中国农业出版社 , 2003.244
～ 275.
[ 14] 许自成 ,刘国顺 ,刘金海 ,等.铜山烟区生态因素和烟叶质量
特点 [J].生态学报 , 2005, 25(7):1748.
32 江　西　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　 　　　　　　21卷