全 文 ：何首乌叶原生质体制备与融合研究
黄国文，管天球，赵雨云，陈莫林，刘宏辉 (湖南科技学院生化系，湖南永州 425199)
摘要 ［目的］研究何首乌叶片原生质体的制备和融合方法。［方法］用机械法制备何首乌叶片的原生质体，用 PEG结合高 Ca2 + -高 pH
诱导融合法来诱导其原生质体，研究原生质体的融合现象。［结果］何首乌叶片在 25 ℃和 35%的蔗糖溶液中处理 30 min能够制备出较
多的完整原生质体。用 20 %PEG融合液处理原生质体 20min能够有效地诱导何首乌原生质体的融合，2个细胞的融合效率为 11. 7%，
表明用机械法制备的原生质体也是有活性的。［结论］该技术为何首乌原生质体培育奠定了基础。
关键词 何首乌;原生质体;制备;融合
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2015)27 －008 －03
Ｒesearch on Preparation and Fusion of Protoplasts from Leaves of Fallopia multiflora (Thunb．)Harald
HUANG Guo-wen，GUAN Tian-qiu，ZHAO Yu-yun et al (Department of Biological Sciences and Chemical Engineerings，Hunan Col-
lege of Science and Technology，Yongzhou，Hunan 425199)
Abstract ［Objective］The aim was to study the preparation and fusion of protoplasts of Fallopia multiflora (Thunb．)Harald)leaves．
［Method］The protoplasts of Fallopia multiflora (Thunb．)Harald were prepared by mechanical method． The fusion of protoplasts was studied
by the PEG combined with high Ca
2 +
-high pH solution washing method． ［Ｒesult］The more protoplasts were prepared when the leaves of Fallo-
pia multiflora (Thunb．)Harald were steeped in 25 ℃ and 35% sucrose solution for at least 30 min． The protoplasts were fused effectively by
the 20% PEG fusion solution treated for 20 min and washed with high Ca2 + -high pH solution，in which the yield rate of fused protoplasts is
11． 7%，suggesting that the protoplasts are active． ［Conclusion］The technology will lay a foundation for the culture of fused protoplasts into
plants of Fallopia multiflora (Thunb．)Harald．
Key words Fallopia multiflora (Thunb．)Harald;Protoplast;Prepqration;Fusion
基金项目 湖南省科技计划重点项目(2014NK2021)。
作者简介 黄国文(1965 － ) ，男，湖南郴州人，讲师，博士，从事植物生
物学研究。
收稿日期 2015-08-03
何首乌［Fallopia multiflora (Thunb．)Harald］为双子叶蓼
科多年生草本植物，分布在我国广东、四川、湖南等省区，生
长于灌木丛中、山脚阴处或石隙中。茎缠绕，基部中空，多分
枝，基部木质化。叶心形，两面光滑，有膜质短筒状的托叶
鞘，圆锥状花序。瘦果椭圆形，光滑，黑色［1］。块茎供药用，
有滋补强壮作用，茎藤可治失眠症［2］。野生何首乌的块茎生
长缓慢，不能满足人类对药物的开发利用。植物原生质体培
育和融合是植物育种的重要技术之一。目前分离原生质体
的方法有机械法和酶法，常用的方法是酶法。笔者用机械法
制备何首乌叶片的原生质体，用 PEG 结合高 Ca2 + -高 pH 诱
导融合法来融合其原生质体，以期为何首乌多倍体植株的培
育奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 试验材料。何首乌新鲜成熟叶片。
1． 1． 2 主要仪器。血细胞计数板，光学显微镜，离心机，数
码相机。
1． 2 方法
1． 2． 1 原生质体制备。用机械法制备原生质体，具体操作
步骤见文献［3］。何首乌叶片经过质壁分离一定时间后切成
0． 5 cm宽的长条，转入到25%蔗糖溶液中放置8 min，过滤后
得到原生质体溶液。原生质体经过 27%蔗糖溶液洗涤一次，
再用 13%甘露醇 CPW溶液悬浮。悬浮液原生质体可用牛氏
记数板记数和细胞融合。原生质体得率 =记数室大方格原
生质体的平均个数 ×104 个(FW)。
1． 2． 2 渗透剂的选择。以 0． 9 mol /L NaCl、6% KNO3 和
35%蔗糖溶液作为高渗溶液，在 35 ℃水浴锅中处理何首乌
叶片 30 min后，制备原生质体，计算原生质体的得率，确定制
备原生质体的渗透剂类型。
1． 2． 3 影响原生质体得率的测定方法。设定原生质体质壁
分离的蔗糖浓度为 25%、30%、35%、40%、45%，处理温度为
4、15、25、35、45 ℃，处理时间为 10、30、50、70、90 min。将何首
乌叶片放置在特定蔗糖浓度和特定温度的条件下处理一定
时间，叶片经过切条后获得原生质体，测定原生质体的得率。
1． 2． 4 PEG 结合高 Ca2 + -高 pH 诱导法融合原生质体的方
法。经过质壁分离法获得的原生质体溶液，1 500 r /min下离
心 8 min，沉淀用少量 13%甘露醇 CPW溶液悬浮，为原生质
体溶液。用吸管取原生质体悬浮液滴两滴在载玻片上，静置
几分钟，使原生质体在载玻片上产生一薄层。取特定浓度
PEG融合液两滴，缓慢滴加到载玻片上的原生质体溶液中，
再静置一定时间，观察载玻片原生质体间的粘连。每隔 5
min，用吸管向原生质体液中滴两滴高 Ca2 + -高 pH溶液，共 3
次。盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的溶液即成临时装片。
用显微镜观察细胞融合，统计融合百分数。用数码照相机在
显微镜下拍照。
2 结果与分析
2． 1 渗透剂对原生质体得率的影响 用 0． 9 mol /L NaCl、
6%KNO3 和 35%蔗糖溶液作为何首乌叶片质壁分离的高渗
溶液，在 25 ℃下制备的原生质体数量分别为 0． 9 × 105、3． 8
×105 和 5． 8 ×102 个 /g(FW) ;且 KNO3 溶液会引起叶片流出
物大量成块，可能是原生质体数量减少的原因。NaCl溶液处
理的叶片制备的原生质体溶液虽然杂物少，但相对蔗糖溶液
而言细胞也较少。因此，以 35%蔗糖溶液作为高渗溶液处理
责任编辑 李占东 责任校对 李岩安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2015，43(27):8 － 10
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2015.27.004
何首乌叶片制备的原生质体数量较多，可用于制备原生质体
的条件优化。
2． 2 蔗糖浓度对原生质体得率的影响 在 25 ℃水浴锅中
用浓度分别为 25%、30%、35%、40%、45%蔗糖溶液处理何
首乌成熟叶片 30 min后，制备原生质体。测定原生质体得率
分别为 100、2． 3 × 104、3． 5 × 105、2． 2 × 105、0． 5 × 104。可见，
原生质体数目随着蔗糖浓度的增加先升高后降低。25%蔗
糖溶液处理制备的原生质体得率最少，为何首乌叶片细胞的
低渗溶液。35%蔗糖溶液处理制备的原生质体得率最多。
当蔗糖浓度高于 35%时，得到的原生质体数量逐渐减少，可
能是细胞失水过快过多导致细胞质壁分离复原活性降低的
原因。
2． 3 温度对原生质体得率的影响 在 5份 35%蔗糖溶液烧
杯中加入等量何首乌成熟叶片，分别放在 4、15、25、35、45 ℃
的水浴锅中处理 30 min后，制备原生质体。测定原生质体得
率分别为 70、0． 4 ×103、5． 7 ×105、2． 3 ×105、1． 3 × 103。可见，
质壁分离温度影响原生质体得率，在 25 ℃时处理的材料得
到的原生质体数量最多，温度过高或者过低得到的原生质体
数量减少。说明温度影响细胞内渗透压的变化。温度过低，
细胞活性低，导致细胞失水少，质壁分离的细胞数目少，因此
制备的原生质体数目少;温度过高，细胞内的活性过高，导致
细胞失水过快过多，质壁分离的细胞数目多，但细胞复原活
性降低，甚至引起细胞活性丧失，因此制备的原生质体数
量少。
2． 4 质壁分离时间对原生质体得率的影响 用 35%蔗糖
溶液在 25 ℃下处理何首乌叶片 10、30、50、70、90 min 后，制
备原生质体。测定的原生质体的得率分别为 2． 7 × 102、3． 2
×105、3． 4 ×105、4． 1 × 105、3 × 104。表明蔗糖处理时间影响
原生质体得率。蔗糖处理时间过短或者过长，原生质体的得
率减少。因此质壁分离时间决定原生质体质壁分离复原的
活性，从而影响原生质体的产率。在 35%蔗糖溶液处理 70
min时原生质体得率最多(图 1A)。考虑到原生质体脱水时
的生理活性变化，为了更好地保持原生质体的活力，选择以
35%蔗糖溶液在 25 ℃下处理 30 min时制备的原生质体，经
过离心用 13%甘露醇 CPW溶液悬浮后用于融合研究。
2． 5 融合液 PEG 浓度和处理时间对原生质体融合的影
响 以PEG 结合高 Ca2 + -高 pH 方法融合原生质体，变化
PEG融合液中 PEG 溶度，分别为 10%、20%、30%、40%，分
别处理 35%蔗糖溶液制备的原生质体 15、20、25、30 min，观
察各种条件下原生质体的融合效果(表 1)。在 20% PEG 溶
液条件下，融合 20 min 后，原生质体的融合效率最高，为
11. 7%。PEG之所以能介导原生质体融合，是因为在高浓度
的 PEG溶液中，PEG与水之间的氢键结合，使溶液中自由水
消失，导致原生质体发生膜结构变化，促使其发生融合［4］。
当 PEG浓度大于 20%时，PEG浓度越高和处理时间越长，融
合率越低。PEG浓度过高和时间过长，可能使原生质体反应
液环境黏滞度过高，阻碍高钙 －高 PH溶液的洗涤作用，导致
细胞融合减少。另外，PEG 浓度过高，可能会使细胞体积减
小，导致各细胞之间膜的接触面减少，细胞融合效率降低。
表 1 不同 PEG浓度处理条件下原生质体融合效率 %
PEG浓度
%
处理时间∥min
10 20 25 30
10 2． 2 5． 3 6． 7 1． 1
20 7． 1 11． 7 8． 1 2． 9
30 2． 5 1． 4 1． 1 0． 5
40 1． 3 0． 45 0． 27 0． 1
20%PEG 融合液融合原生质体 20 min，在显微镜(400
×)下观察到原生质体粘连在一起(图 1B)。经过 3 次高
Ca2 + -高 pH 溶液洗涤后，在显微镜下观察到 2个原生质体融
合现象(图 1C) ，融合率为 11． 7%，没有观察到 3个细胞的融
合现象。但在各种条件下用高 Ca2 + -高 pH溶液洗涤聚集的
原生质体时都发现大部分原生质体被成块地冲向一边，只有
少量的原生质体在原位，这可能是原生质体融合效率不高的
原因。
注:A．何首乌的原生质体;B．原生质体的粘连现象;C． 2原生质体融合现象。
图 1 何首乌叶片的原生质体制备和融合现象
3 讨论
植物原生质体的制备有机械法和酶法［5］。由于酶解法
操作简单方便，获得的细胞数量多，大多数研究采用酶解法，
但酶解法中使用的各种酶可能对分离的原生质体及其成分
有作用会引起不良后果［6］。机械法是将叶片放入高渗溶液
中进行质壁分离一段时间，然后采用切条或者研磨的方法将
943 卷 27 期 黄国文等 何首乌叶原生质体制备与融合研究
叶片破裂，然后将碎块放入低渗溶液中使细胞分离出来的方
法。用此种方法制备原生质体所用的时间短，成本低，没有
受到酶等化学试剂的影响，能够保持细胞的原有状态，是一
种值得研究的方法。但目前认为机械法制备原生质体数量
少，不能用于细胞下游试验。该研究根据细胞质壁分离和复
原的原理［7 －8］，以蔗糖溶液作为叶片细胞质壁分离的渗透
剂，对蔗糖浓度、质壁分离时间和温度进行了多个水平试验，
用切条办法破碎细胞，用能够保持原生质体活性的溶液 13%
甘露醇 CPW溶液作为质壁分离复原的试剂，分离到数量较
多的原生质体。该试验结果表明，在 25 ℃条件下将何首乌
叶片浸入 35%蔗糖溶液处理 30 min能够分离 3． 2 ×105 个 /g
(FW)。这些原生质体经过 20% PEG融合液作用 20 min，用
高 Ca2 + -高 pH溶液洗涤诱导融合，能够得到11． 7%的2个原
生质体融合的细胞融合体，说明用此种方法制备的原生质体
也是有活性的;同时说明融合效率不高，有待于进一步研究。
该研究结果为何首乌植株的细胞育种研究奠定了坚实的
基础。
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45 －46．
(上接第 7页)
过程来研究棉花生长情况，国内外已做大量的工作。但是，
由于不同地区气候和生产条件的不同，有关棉株干物质积累
与产量、品质关系的研究匮乏。如何充分认识棉株干物质积
累与产量的关系，了解影响棉花干物质积累各因素的特点利
弊，对我国棉花事业的发展具有重大作用。
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