全 文 ：书收稿日期:2014 － 02 － 16。
基金项目:国家自然科学基金资助项目 (31060210，21167013) ;江西省自然科学基金资助项目(20114BAB204019) ;国家
重点实验室基金资助项目 (SKLF-ZZB-201305，SKLF-ZZA-201302，SKLF-KF-201203)。
作者简介:张国文(1966—) ，男，教授，博士，博士生导师，gwzhang@ ncu． edu． cn。
引文格式:张国文，胡玉婷．维生素 B1、B2 和 B3 对石吊兰素与 BSA 结合作用的影响［J］．南昌大学学报:工科版，2014，36
(2) :103 － 107．
文章编号:1006 － 0456(2014)02 － 0103 － 05
维生素 B1、B2 和 B3 对石吊兰素与
BSA结合作用的影响
张国文，胡玉婷
( 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)
摘要:在模拟人体生理条件下，联合应用紫外 －可见光谱法、荧光光谱法以及圆二色谱(CD)技术，研究了 3 种
B族维生素(VB1、VB2、VB3)分别对石吊兰素与牛血清白蛋白(BSA)结合作用的影响。计算了 3 种维生素分别存
在下石吊兰素 － BSA体系的猝灭常数(Ksv)、结合常数(K)、结合位点数(n)和结合距离(r)等参数，探讨了 3 种维
生素对石吊兰素 － BSA相互作用可能的影响方式。结果显示:VB1、VB2、VB3 的加入使得石吊兰素 － BSA 体系的
Ksv和 K增大，n 基本不变，r 稍有减小，表明 VB1、VB2、VB3 均能够增加石吊兰素 － BSA 体系的稳定性。VB1 使得
BSA －石吊兰素体系的主要作用力类型从以氢键和范德华力为主转变为以疏水作用力为主，而 VB2、VB3 的存在没
有改变 BSA －石吊兰素体系的主要作用力。CD分析结果表明:3 种 B族维生素的加入均能使 BSA的 α －螺旋含量
有所增加。推断 VB1、VB2、VB3 与 BSA的结合导致了 BSA分子构象变化是维生素影响 BSA －石吊兰素结合的主要
方式。
关键词:石吊兰素;B族维生素;荧光猝灭;圆二色谱
中图分类号:O657． 3 文献标志码:A
Studies of the influence of vitamin B1 ，B2 and B3
on the interaction between lysionotin and BSA
ZHANG Guowen，HU Yuting
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China)
Abstract:The influence of the three kinds of B vitamins，VB1，VB2 and VB3 on the interaction between BSA
and lysionotin in physiological buffer (pH =7． 4)was investigated by various spectroscopic methods including UV-
vis absorption，fluorescence and circular dichroism (CD)spectroscopy． The binding parameters such as the Stern-
Volmer dynamic quenching constant(Ksv) ，binding constant(K) ，the number of binding sites(n)and binding dis-
tance(r)were calculated，and the influence mode of the vitamins were explored． The results indicated that the val-
ues of Ksv and K were increased，r values were decreased，while the values of n remained unchanged in the presence
of VB1，VB2 and VB3，respectively，which means all of VB1，VB2 and VB3 could increase the stability of lysionotin-
BSA system． The main acting force of lysionotin-BSA interaction was changed from hydrogen bonding and van der
Waals forces to hydrophobic forces in the presence of VB1，whereas VB2 and VB3 did not change the type of acting
force． The analysis of CD spectra showed the content of the α-helix of BSA was increased． The molecular conforma-
tional change of BSA induced by the vitamins-BSA binding was a main interferential quomodo of the B vitamins．
Key Words:lysionotin;B vitamins;fluorescence quenching;circular dichroism spectroscopy
石吊兰素(lysionotin)是从苦苣苔科植物石吊兰 中提取的一种黄酮类化合物，具有抗菌、抗肿瘤和清
第 36 卷第 2 期
2014 年 6 月
南昌大学学报( 工科版)
Journal of Nanchang University( Engineering ＆ Technology)
Vol． 36 No． 2
Jun． 2014
DOI:10.13764/j.cnki.ncdg.2014.02.001
除自由基的功能，常用于淋巴结核、肺结核和骨结核
的辅助治疗，也可用于支气管炎的治疗［1 － 2］。血清
白蛋白是血液循环系统中最丰富的蛋白质，可与许
多内源性和外源性物质发生可逆性结合，发挥其储
存、运载和保护机体等生理功能［3］。研究石吊兰素
与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用有利于从分子水
平认识石吊兰素在血液循环系统中的转运和代谢过
程。由于生命体系的复杂性，生命过程中的物质分
子间的相互作用远不仅仅限于两者之间，因此，研究
共存物质对药物 －蛋白质结合的干预，有助于探索
多元复杂体系内药物 －蛋白质相互作用规律及中药
科学用药规律。目前，共存物质的研究中主要以金
属离子的参与居多［4 － 5］，维生素的参与研究还很少。
本课题组前期研究了维生素 C(VC)、维生素 B2
(VB2)等对植物活性成分杜鹃素与牛血清白蛋白
(BSA)结合的扰动行为［6］。发现 VC、VB2 与 BSA
结合导致 BSA 分子构象变化是该营养物质扰动
BSA －杜鹃素结合的共通方式和主要方式。维生素
是维持生命正常生理活动所必需的一类营养素，本
文采用多种光谱技术，探讨了 3 种 B族维生素 VB1、
VB2、VB3(也称烟酸)对 BSA －石吊兰素相互作用的
影响及影响方式，以期为了解维生素对药物 －蛋白
质作用的影响提供有益信息。
1 实验部分
1． 1 主要仪器与试剂
UV －2450 紫外 －可见分光光度计(日本岛津
公司) ;F － 7000 型荧光光度计(日本日立公司) ;
pHS － 3C 型酸度计(上海雷磁仪器厂) ;MOS － 450
圆二色光谱仪(法国 Bio-Logic公司)。
石吊兰素(中国药品生物制品检定所)储备溶
液配制:准确称取 4． 3 mg 石吊兰素，加入 25 mL 的
无水甲醇溶解，配制成 0． 50 mmol·L －1的储备液;
BSA(上海伯奥生物科技有限公司)溶液配制:用 pH
7． 4 的 Tris-HCl缓冲溶液(其中含有 0． 10 mol·L －1
NaCl)配制成 0． 55 μmol·L －1的溶液;维生素 B1、
B2、B3 分别用超纯水配制成 0． 50 mmol·L
－1的溶
液;上述溶液保存于 4 ℃的冰箱中备用;其他试剂均
为分析纯，实验用水为超纯水(0． 182 MΩ·m)。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 紫外吸收光谱
分别移取一定量的 VB1、VB2、VB3 溶液 3． 0 mL
至比色皿中，扫描紫外光谱，然后分别加入一定量的
石吊兰素溶液，混匀后放置 3 min，扫描 200 ～ 400
nm范围的吸收光谱，并测定相应游离浓度的维生素
和石吊兰素的吸收光谱。
1． 2． 2 荧光光谱的测定
分别准确移取 3． 0 mL BSA(0． 55 μmol·L －1)
溶液、BSA －维生素混合溶液于石英荧光池中，扫描
其荧光光谱后，再逐次用移液枪移取一定体积的(6
μL /次)石吊兰素储备溶液(0． 50 mmol·L －1)加入
其中，混合均匀并静置 3 min，测定其荧光发射光谱
(λex /λem = 280 /348 nm)。
1． 2． 3 圆二色光谱(CD光谱)
在 200 ～ 250 nm 波长范围内，分别测定浓度为
0． 55 μmol·L －1游离 BSA和 BSA －石吊兰素混合物
以及 BSA －石吊兰素 －维生素混合物的 CD光谱。
2 结果与讨论
2． 1 维生素(VB1、VB2、VB3)与石吊兰素体系的紫
外 －可见光谱
图 1 为 VB1、VB2、VB3 与石吊兰素相互作用的
紫外 －可见光谱图。VB1 与石吊兰素混合物的吸收
光谱(VB1 － L)明显不同于游离的 VB1 与石吊兰素
简单加和的吸收光谱(VB1 + L) ，表明 VB1 与石吊
兰素发生了相互作用，可能是 VB1 中的季氮离子
N + 与石吊兰素中 5—OH 和 4—OH 发生了作
用［7 － 8］，导致吸收光谱的改变。而VB2、VB3与石吊
λ/nm
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
350300250200 400
A
VB1+L
VB1-L
VB1
L
c(VB1)= 0． 50 mmol·L －1，c(lysionotin)= 10． 0 μmol·L －1。
(a)VB1 与石吊兰素作用的紫外吸收光谱
λ/nm
1.2
0.9
0.6
0.3
0.0
350300250200 400
A
VB2+L VB2-LVB2
L
c(VB2)= 0． 50 mmol·L －1，c(lysionotin)= 10． 0 μmol·L －1。
(b)VB2 与石吊兰素作用的紫外吸收光谱
·401· 南昌大学学报(工科版) 2014 年
λ/nm
0.6
0.4
0.2
0.0
350300250200 400
A
VB3+L
VB3-L
VB3
L
c(VB3)= 0． 50 mmol·L －1，c(lysionotin)= 10． 0 μmol·L －1。
(c)VB3 与石吊兰素作用的紫外吸收光谱
图 1 VB1、VB2、VB3 与石吊兰素作用的紫外吸收光谱
Fig． 1 UV-vis spectra of the lysionotin-vitamin B systems
素混合物的吸收曲线几乎与游离的 VB2、VB3 和石
吊兰素简单加和的吸收曲线重叠，表明 VB2、VB3 没
有与石吊兰素发生结合作用。
2． 2 VB1、VB2、VB3 存在下石吊兰素对 BSA 內源
荧光的影响
BSA中因含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨
基酸残基而具有内源荧光。图 2 显示 25 ℃时 VB1、
VB2、VB3 分别存在下石吊兰素对 BSA 內源荧光的
猝灭。从图 2 可以看出:VB1、VB2、VB3 均可以使
BSA荧光强度发生一定程度的降低(曲线 b) ，表明
VB1、VB2、VB3 均可以与 BSA 发生作用。在一定浓
度的 VB1、VB2、VB3 分别存在下，石吊兰素仍能有规
律地猝灭 BSA的荧光并使峰位发生一定的蓝移，且
体系的荧光猝灭率分别从 64． 1%增加到 69． 2%、
70． 9%和 69． 3%。VB1、VB3 存在下体系没有出现
新的荧光发射峰。但 VB2 存在下，在 532 nm 处出
现了一个新峰，该峰为 VB2 的荧光特征峰，且随着
石吊兰素的加入此荧光峰逐渐降低，406 nm 处等发
射点受到严重干扰，而且在 488 nm处形成了一个新
的等发射点，文献报道，VB2 可以与 BSA 发生相互
作用并在468 nm处形成等发射点［9］，说明石吊兰
F
λ/nm
lysionotin
800
600
400
200
0
a
k
450400350300 500
c(BSA)= 0． 55 μmol·L －1，curves a→k:c(lysionotin)= 0，1． 0，
1． 99，2． 98，3． 97，4． 95，5． 93，6． 90，7． 87，8． 84，9． 80 μmol·L －1。
(a)石吊兰素与 BSA的相互作用
λ/nm
F
800
600
400
200
0
a
1
450400350300 500
VB1
c(BSA)= 0． 55 μmol·L －1，curves a→k:c(lysionotin)= 0，1． 0，
1． 99，2． 98，3． 97，4． 95，5． 93，6． 90，7． 87，8． 84，9． 80 μmol·L －1，
c(VB1)= 20． 0 μmol·L －1。
(b)VB1 存在时石吊兰素与 BSA的相互作用
λ/nm
F
800
600
400
200
0
a
1
400300 600500
VB2
VB2
c(BSA)= 0． 55 μmol·L －1，curves a→k:c(lysionotin)= 0，1． 0，
1． 99，2． 98，3． 97，4． 95，5． 93，6． 90，7． 87，8． 84，9． 80 μmol·L －1，
c(VB2)= 20． 0 μmol·L －1。
(c)VB2 存在时石吊兰素与 BSA的相互作用
λ/nm
800
600
400
200
0
a
1
450400350300 500
VB3
F
c(BSA)= 0． 55 μmol·L －1，curves a→k:c(lysionotin)= 0，1． 0，
1． 99，2． 98，3． 97，4． 95，5． 93，6． 90，7． 87，8． 84，9． 80 μmol·L －1，
c(VB3)= 20． 0 μmol·L －1。
(d)VB3 存在时石吊兰素与 BSA的相互作用
图 2 不存在 /存在 VB1、VB2、VB3 时
石吊兰素对 BSA的荧光猝灭光谱
Fig． 2 Fluorescence quenching spectra of lysionotin binding
to BSA without /with the effect of VB1，VB2 and VB3
素、VB2、BSA三者之间可能发生相互作用形成了三
元复合物。为了进一步阐明荧光猝灭机制，由荧光
滴定实验数据计算出不同温度下营养物质不存在 /
存在下的动态猝灭常数(KSV)、结合常数(K)、结合
·501·第 2 期 张国文，等:维生素 B1、B2 和 B3 对石吊兰素与 BSA结合作用的影响
位点数(n)、结合距离(r)、焓变(ΔH°)、熵变(ΔS°)
以及生成自由能变(ΔG°) ，结果列于表 1 中。不加
维生素时，KSV随着温度的升高而降低且猝灭速率常
数 Kq 达到 10
13 L·mol － 1·s － 1量级，远大于各类猝
灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数 2． 0 ×
1010 L·mol －1·s －1［10］，可以推断此荧光猝灭机制为
生成基态复合物的静态猝灭［11］，而维生素的存在并
没有改变 BSA －石吊兰素体系的静态猝灭方式。
表 1 维生素不存在 /存在下，石吊兰素 － BSA体系的猝灭常数、结合常数、结合距离、结合位点数及热力学参数
Tab． 1 Without /with the existence of vitamins，Stern-Volmer quenching constant (Ksv)，apparent association constant (K)，
binding distance (r)，the number of binding sites (n)and thermodynamic parameters of lysionotin-BSA system
维生素 T /K
KSV /
(105 L·mol － 1)
r /nm
K /
(105 L·mol － 1)
n
ΔH° /
(kJ·mol － 1)
ΔG° /
(kJ·mol － 1)
ΔS° /
(J·mol － 1·K －1)
不存在
298
304
310
1． 40 ± 0． 01
1． 32 ± 0． 01
1． 01 ± 0． 01
4． 06
1． 86 ± 0． 04
1． 41 ± 0． 05
0． 98 ± 0． 04
1． 03 ± 0． 01
1． 01 ± 0． 01
1． 00 ± 0． 01
－ 40． 81 ± 0． 08
－ 30． 10 ± 0． 16
－ 29． 89 ± 0． 16
－ 29． 67 ± 0． 16
－ 35． 93 ± 0． 27
VB1
298
304
310
1． 84 ± 0． 01
1． 80 ± 0． 01
1． 57 ± 0． 01
3． 88
5． 25 ± 0． 17
7． 68 ± 0． 15
8． 99 ± 0． 14
1． 10 ± 0． 03
1． 13 ± 0． 03
1． 16 ± 0． 03
34． 52 ± 0． 41
－ 32． 73 ± 0． 81
－ 34． 08 ± 0． 82
－ 35． 43 ± 0． 82
225． 66 ± 1． 35
VB2
298
304
310
2． 02 ± 0． 01
1． 84 ± 0． 01
1． 69 ± 0． 01
3． 75
24． 2 ± 0． 14
13． 2 ± 0． 17
6． 50 ± 0． 16
1． 23 ± 0． 03
1． 18 ± 0． 03
1． 13 ± 0． 03
－ 84． 16 ± 0． 25
－ 36． 48 ± 0． 49
－ 35． 52 ± 0． 50
－ 34． 56 ± 0． 50
－ 160． 01 ± 0． 82
VB3
298
304
310
1． 89 ± 0． 01
1． 64 ± 0． 01
1． 54 ± 0． 01
3． 81
9． 33 ± 0． 16
4． 82 ± 0． 12
2． 52 ± 0． 16
1． 15 ± 0． 03
1． 10 ± 0． 02
1． 04 ± 0． 03
－ 83． 54 ± 0． 03
－ 34． 07 ± 0． 06
－ 33． 07 ± 0． 06
－ 32． 06 ± 0． 06
－ 167． 05 ± 0． 10
25 ℃时，维生素的存在诱导石吊兰素与 BSA的
结合常数增加，增加程度为 VB2 ＞ VB3 ＞ VB1，说明
维生素的存在使得石吊兰素对 BSA 的亲和能力增
强。维生素存在 /不存在时的 r值均小于 7 nm，且满
足 0． 5Ｒ0 ＜ r ＜ 1． 5Ｒ0，表明石吊兰素与 BSA 之间发
生了非辐射能量转移可能性较大［12］。r值的差异表
明 3 种维生素对石吊兰素 － BSA体系的干扰程度不
同［13］。与石吊兰素 － BSA 二元体系相比，3 种维生
素的存在均引起石吊兰素对 BSA 荧光的猝灭能力
增强，K 值增大，r 值稍有减小，n 值基本不变，表明
维生素的存在加强了石吊兰素 － BSA 的结合能力，
这有利于石吊兰素被血液贮运，并能有效地维持血
浆中血药总浓度和延长药物的作用时间。
此外，表 1 中热力学参数变化表明，VB1 存在下
石吊兰素与 BSA 的作用力类型从原来的以氢键和
范德华力为主转变为以疏水作用为主，这可能是由
于 VB1 中的季氮离子 N
+与石吊兰素中 5—OH 与
4—OH发生了结合，使得石吊兰素再与 BSA形成氢
键，由于空间位阻的增加使得其疏水作用力增加，这
与紫外吸收光谱所得结果一致，而 VB2 和 VB3 的存
在没有改变石吊兰素 － BSA体系的作用力类型。
2． 3 对 BSA二级结构的影响
CD光谱测量是一种灵敏、有效的检测蛋白质构
象变化的光谱学方法。图 3 显示:石吊兰素 － BSA
－维生素三元体系中 BSA 双负峰(210 nm 和 221
nm处)强度较之石吊兰素 － BSA 二元体系有所增
加，表明 BSA 的 α －螺旋含量有所增加。这可能源
于 BSA分子构象的转变，因为 VB1、VB2、VB3 分别
与BSA结合后，BSA分子构象发生应激改变，使其
CD
/m
de
g
λ/nm
4
0
-4
-8
-12
240230220210200 250
a
c
VB1存在下
c(BSA)= 2． 0 μmol·L －1，a→c:BSA，BSA-lysionotin (1∶1) ，
BSA － lysionotin － VB1。
(a)VB1 存在时的圆二色谱图
λ/nm
CD
/m
de
g
4
0
-4
-8
-12
240230220210200 250
a
c
VB2存在下
c(BSA)= 2． 0 μmol·L －1，a→c:BSA，BSA － lysionotin (1∶1) ，
BSA － lysionotin － VB2。
(b)VB2 存在时的圆二色谱图
·601· 南昌大学学报(工科版) 2014 年
λ/nm
CD
/m
de
g
4
0
-4
-8
-12
240230220210200 250
a
c
VB3存在下
c(BSA) = 2． 0 μmol·L －1，a→c:BSA，BSA － lysionotin (1∶
1) ，BSA － lysionotin － VB3。
(c)VB3 存在时的圆二色谱图
图 3 VB1、VB2、VB3 存在下石吊兰素与
BSA作用的圆二色光谱
Fig． 3 CD spectra of lysionotin binding to BSA in the
presence of VB1，VB2，VB3
分子上容易与石吊兰素结合的 N、O 氨基酸残基更
加暴露，导致石吊兰素与 BSA 分子的结合更加容
易［14］，这也可能是 3 种 B族维生素影响石吊兰素 －
BSA结合的主要方式。
3 结论
研究结果表明，VB1、VB2、VB3 的加入使得 BSA
－石吊兰素体系的猝灭常数 Ksv和结合常数 K 有一
定程度的增大，结合距离 r稍有减小，而结合位点数
n基本不变，表明维生素的存在加强了石吊兰素 －
BSA的结合能力，这有利于石吊兰素被血液贮运，并
能有效地维持血浆中血药总浓度和延长药物的作用
时间。VB1 的存在导致石吊兰素 － BSA体系的主要
作用力类型从以氢键和范德华力为主转变为以疏水
作用力为主，而 VB2、VB3 的存在并没有改变石吊兰
素 － BSA体系的主要作用力类型。CD 光谱分析表
明，VB1、VB2、VB3 的加入使得 BSA的 α －螺旋含量
有所增加，可能是由于 VB1、VB2、VB3 与 BSA 结合
后诱导了 BSA发生应激改变，使其分子上容易与石
吊兰素结合的 N、O氨基酸残基更加暴露，导致石吊
兰素更容易与 BSA结合，这也可能是 3 种 B 族维生
素影响石吊兰素 － BSA结合的主要方式。
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