全 文 ：高效液相色谱法同时分离测定仁用杏花芽中 8种植物激素
杨途熙　魏安智*　郑 元　杨 恒　杨向娜　张 睿
(西北农林科技大学林学院 ,杨凌 712100)
摘　要　采用 Shim-Pa rk C18 VP-ODS色谱柱 (150 mm ×4. 6 mm , 5 μm)、岛津 SPD-10A VP UV-检测器 , 以
V(甲醇)∶V(0. 075%冰乙酸水溶液)=45∶55为流动相 , 在流速 0. 7 mL /m in、柱温 30℃、检测波长 254 nm的条
件下 , 同时分离测定了仁用杏花芽中的腺素 、玉米素 、赤霉素 、生长素 、6-苄氨基嘌呤 、秋水仙素 、脱落酸和吲
哚-3-丁酸 8种植物激素。各峰的分离效果理想 ,加标回收率达到 95. 41% ～ 103. 48%;测量灵敏度达 0. 0001
vo lt;精密度 RSD%<0. 1。
关键词　高效液相色谱 ,仁用杏 , 花芽 ,植物激素
　 2006-12-29收稿;2007-04-28接受
本文系陕西省重大科技专项计划(No. 2006k z09-G6)资助项目
* E-m ail:w eianzhi@126. com
1　引　言
植物激素调控着植物的萌发 、生长 、分化 、发育 、开花 、果实成熟和器官老化等生活周期的各个方
面 [ 1, 2] 。用 HPLC法测定植物多种内源激素时经常发生分离差 、峰型不良及严重拖尾现象 [ 3] 。因此 ,选
择合适的植物激素提取方法和色谱条件尤为重要 。目前大多 HPLC法只能同时测定 3 ～ 5种植物激
素 [ 4, 5] 。本研究建立了同时分离测定仁用杏花芽中 8种激素含量的高效液相色谱方法。
2　实验部分
2. 1　实验材料
仁用杏花芽于 2006年 3月采自陕西省岐山县仁用杏试验园中 ,采集后立即在液氮中冷冻保存 。
2. 2　仪器和试剂
SCL-10A VP高效液相色谱仪 (日本岛津公司 ),包括 SPD-10A VP UV-检测器 、C lass-VP液相色谱工
作站 、KQ-100DE型超声波脱气机 、pHS-3B型精密 pH计和 SENCO R系列旋转蒸发器 。
玉米素 、赤霉素 、生长素 、脱落酸标样 (Sigm a,纯度≥99%);腺素 、激动素 、6-苄氨基嘌呤 、秋水仙素 、
吲哚-3-丁酸标样(科密欧 ,纯度≥95%);色谱纯甲醇 (德国 MERCK公司 );分析纯乙酸 、甲醇 、乙酸乙
酯 、石油醚(西安化学试剂厂);实验用水为超纯水。
2. 3　实验方法
2. 3. 1　色谱条件 　色谱柱:Sh im-Pa rkC18VP-ODS(150mm ×4. 6mm , 5μm );流动相为 V(甲醇 )∶
V(0. 075%冰乙酸水溶液 ) =45∶55;检测波长:254 nm;流速:0. 7mL /m in;进样量 10 μL;柱温:30℃。
2. 3. 2　标准溶液的配制　根据进单标峰高情况 ,结合预备实验检测的仁用杏花芽中各激素含量范围 ,
确定各激素标样浓度。以流动相为溶剂于 10 mL棕色容量瓶中 ,配制浓度分别为 0. 05 g /L腺素 、
0. 1 g /L玉米素 、20. 0 g /L赤霉素 、0. 5 g /L激动素 、1. 0 g /L生长素 、1. 0 g /L 6-苄氨基嘌呤 、1. 0 g /L秋
水仙素 、0. 1 g /L脱落酸和 0. 5 g /L吲哚-3-丁酸的标准溶液。
2. 3. 3　样品的处理和含量检测　参照文献 [ 6]的样品处理方法 。称取 1 g样品 ,在冰浴下研磨成浆 ,加
入 80%的冷甲醇 20mL,保鲜膜密封 ,在 4℃冰箱里冷浸过夜 。浸提液抽滤 , 10 mL甲醇润洗研钵 2次 ,
过滤后与浸提液合并 , 40℃下减压蒸发至没有甲醇残余。剩余水相完全转移到三角瓶中。用
30 mL石油醚萃取脱色 2次 ,弃去醚相。水相 pH调至 6. 4,加 0. 5 g PVP,超声 30 m in ,抽滤。滤液 pH
调至 2. 9 ,用 30mL乙酸乙酯萃取 3次 ,合并酯相 , 40℃下减压蒸干 。用流动相溶解残渣并定容 2mL,经
第 35卷
2007年 9月　　　　　 　　　　　　
分析化学 (FENXIHUAXUE)　研究简报
Chine se Journal o fAna ly tica lChem istry
　　　　　　　　　 　　 第 9期
1359 ～ 1361
0. 45μm微孔滤膜过滤得待测液 ,保存于 4℃冰箱中。取待测液 10μL,在选定的色谱条件下注入高效
液相色谱仪 (n =3),积分求色谱峰面积 ,以标准曲线计算样品中各激素的含量。
3　结果与讨论
3. 1　色谱条件的选择
3. 1. 1　流动相的选择　以甲醇-水作为流动相 , 9种激素不能完全分离 ,且色谱峰拖尾严重 ,峰形极差。
冰乙酸可以抑制样品的电离 、改善拖尾现象 ,因此需在流动相中加入冰乙酸 。实验显示 ,甲醇-冰乙酸水
溶液体积比大于 60∶40,各激素不能完全分开;其体积比小于 50∶50,各激素虽能完全分开 ,但各峰分离
度较小;其体积比小于 45∶55时 ,随着流动相中甲醇比例减小 ,激素灵敏度下降 、保留时间迅速增加。因
此 ,流动相中甲醇比例不能小于 45%。实验对冰乙酸的用量也进行了考察 。分别用 0. 05%、0. 075%、
0. 1%、0. 5%和 1. 0%的冰乙酸水溶液进行实验 ,结果显示 ,冰乙酸含量为 1. 0%时 ,部分激素峰重叠 ,不
能完全分离;冰乙酸为 0. 05%时 ,拖尾现象明显。因此确定水相中冰乙酸比例为 0. 075%,既能保证
9种激素完全分离 、有效去除拖尾 ,又能避免酸度过大损伤色谱柱填料 。
3. 1. 2　流速的确定　实验考察了 0. 6、0. 7、0. 8、1. 0 mL /m in 4个流速。流速为 0. 6 mL /m in时 ,吲哚-3-
丁酸保留时间为 37 m in ,检测时间变长;流速大于 0. 7 mL /m in时 ,玉米素和赤霉素 、6-苄氨基嘌呤和秋
　图 1　9种植物激素标样(a)和仁用杏花芽样品(b)色谱
图
F ig. 1　Ch rom a tog ram s of nine endogenous ho rmones m ixed
standa rds(a) and the sam ples o f aprico t floral bud(b)
1. 腺素(aden ine):2. 569m in;2. 玉米素(ZT):3. 701 m in;3. 赤
霉素(GA3):5. 038 m in;4. 激动素(6-KT):6. 306 m in;5. 生长素
(IAA):9. 624 m in;6. 6-苄氨基嘌呤(6-BA):11. 476 m in;7. 秋
水仙素(colch icine):12. 452 m in;8. 脱落酸(ABA):15. 562 m in;
9. 吲哚-3-丁酸(IBA):24. 419 m in。
水仙素的色谱峰重叠 ,分离效果差。流速为 0. 7
mL /m in时 ,各激素在 30m in内可完全分离。
3. 1. 3　色谱条件的优化　根据以上实验结果 ,选
择以 V(甲醇 )∶V(0. 075%冰乙酸 )=45∶55为流
动相 ,流速 0. 7 mL /m in、检测波长 254 nm、柱温
30℃为优化的色谱条件 ,在此条件下 9种标样能
够很好地分离 ,样品中共有 8种激素被检出 (见
图 1)。
3. 2　回归方程 、相关系数及精密度
以 9种激素标准溶液为原液 ,分别稀释 2、4、
6、8、10倍 ,在上述色谱条件下进行分析 。以各进
样浓度为纵坐标 ,峰面积为横坐标 ,绘制标准工作
曲线 ,计算回归方程及相关系数 。重复进样 6次 ,
记录保留时间和峰面积 ,计算相对标准偏差。各
成分的相关系数和精密度指标均能满足分析要求
(见表 1)。
表 1　回归方程 、相关系数及精密度
Table 1　Reg ression equa tion, coefficient and rela tive standard devia tion
样品
S amp le
回归方程
Reg ression equation
相关系数
r
保留时间精密度
RSD of retent ion tim e(%, n=5)
峰面积精密度
RSD of peak area(%, n=5)
腺素 Aden in e y=(1. 19×10 - 8)x - 4. 14×10 -4 0. 9999 0. 047 0. 024
玉米素 Zeatin (ZT) y=(1. 72×10 - 8)x - 3. 60×10 -4 0. 9998 0. 094 0. 031
赤霉素 G ibberllin (GA 3) y=(4. 67×10 - 7)x+2. 65×10 -2 0. 9999 0. 032 0. 044
激动素 6-K inetin (6-KT) y=(1. 12×10 - 7)x+6. 85×10 -4 0. 9997 0. 034 0. 039
生长素
Indo le-3-acetic acid (IAA) y=(8. 52×10 - 8)x+6. 93×10 -4 0. 9999 0. 021 0. 021
6-苄氨基嘌呤
6-Benzy lam inopu rine(6-BA) y=(8. 52×10 - 8)x+6. 93×10 -4 0. 9995 0. 019 0. 066
秋水仙素 Co lch icine y=(1. 48×10 - 8)x - 2. 46×10 -3 0. 9999 0. 029 0. 014
脱落酸 Ab scis ic acid (ABA) y=(1. 46×10 - 8)x+5. 29×10 -5 0. 9997 0. 019 0. 037
吲哚-3-丁酸
Indole-3-bu tyric acid (IBA) y=(1. 16×10 - 7)x+3. 86×10 -4 0. 9999 0. 011 0. 018
1360　　 分 析 化 学 第 35卷
3. 3　加标回收率实验
取 8份样品待测液 ,准确吸取 1mL于 8个离心管中 ,分别加入 8种植物激素各 1mg,测定各激素含
量 。重复 3次 ,计算加标回收率 (见表 2)。
表 2　各激素加标回收率测定结果
Table 2　S tandard addition re coveries of ho rm ones
样品
S amp le
样品中含量
Conten t(mg) 加标量Added (m g) 检出量Found(m g, n=3) 回收率Recovery (%)
腺素 Aden in e 0. 0029 1. 0000 0. 9641 96. 1
玉米素 ZT 0. 0034 1. 0000 0. 9803 97. 7
赤霉素 GA3 0. 8608 1. 0000 1. 9255 103. 5
生长素 IAA 0. 0470 1. 0000 1. 0285 98. 2
6-苄氨基嘌呤 6-BA 0. 0730 1. 0000 1. 0623 99. 0
秋水仙素 Co lch icine 0. 0412 1. 0000 1. 0555 101. 4
脱落酸 ABA 0. 0103 1. 0000 0. 9639 95. 4
吲哚-3-丁酸 IBA 0. 0291 1. 0000 1. 0530 102. 3
　
3. 4　样品中内源激素含量的测定
用上述色谱条件对样品中的 8种内源激素含量进行测定 ,结果为:腺素 8. 75、玉米素 12. 85、赤霉素
6113. 30、生长素 110. 31、 6-苄氨基嘌呤 228. 52、秋水仙素 209. 52、脱落酸 5. 32和吲哚-3-丁酸
40. 43 μg /g。由测定结果看出 ,样品中赤霉素 、6-苄氨基嘌呤 、秋水仙素和生长素等含量较高 ,而脱落酸
等含量较低 ,这可能与 3月份仁用杏花芽处于膨大期的生长发育时期有关。
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Smi ultaneousDeterm ination of 8 EndogenousHormones in Apricot
FloralBud by H igh Performance L iquid Chromatography
Yang Tu-Xi, W ei An-Zhi* , Zheng Yuan, Yang Heng, Yang X iang-Na, Zhang Ru i
(College of Forestry, Northwest Agriculture and ForestUn iversity, Yangling 712100)
Abstract　A me thod w as deve loped for the dete rm ination and separa tion of adenine, zea tin(ZT), g ibberllin
(GA 3), indo le-3-ace tic acid(IAA), 6-benzy lam inopurine(6-BA), Co lchicine, abscisic acid(ABA) and
indo le-3-by tyric aicd(IBA) in aprico t flo ral bud by using a Sh im-Park C18VP-ODS chrom atog raphic column
(150mm ×4. 6 mm , 5 μm) and a SH IMAZU SPD-10A VP UV de tec to r (λ=254 nm ). The mobile phase
w as composed ofme thanol and 0. 075% ace tic acid (45∶55, V /V), the flow ra te w as 0. 7mL /m in and the
co lumn temperature w as 30℃. These hormones w ere separated w e ll w ith the recoverie s of 95. 41% -
103.48%. The de te rm ination method had a sensitivity as high as 0. 0001V and a precision o fRSD%<0. 1.
Keywords　H igh perfo rmance liquid ch roma tography(HPLC), ap rico t, flo ral bud, endogenous ho rmone
(Received 29 December 2006;A ccepted 28 ap ril 2007)
1361第 9期 杨途熙等:高效液相色谱法同时分离测定仁用杏花芽中 8种植物激素