全 文 ：去壁低渗法制备芦笋染色体标本的研究
周劲松1 ,陆 斌2 ,汤泳萍 1 ,罗绍春 1 ,陈光宇1
(1. 江西省农业科学院生物工程中心 ,江西 南昌 330200;2. 扬州大学 农学院 ,江苏 扬州 225009)
摘　要:应用去壁低渗法进行了芦笋染色体标本制备的研究 ,其结果是:芦笋种子根尖用 2mmol /L的 8 -羟
基喹啉预处理 2h, 2. 0%纤维素酶 +1. 0%果胶酶 37℃酶解 45m in,酶解前后各固定 1次 ,能得到效果较好的芦笋
染色体标本图;芦笋品种 “Atlas”的体细胞染色体数目为 2n=20。
关键词:芦笋;去壁低渗法;染色体标本
中图分类号:Q343. 2　文献标识码:B　文章编号:1001 -8581(2006)02 -0015 -02
芦笋(Asparagus officina lis L. )属百合科天门冬属多年生宿根性草本植物 ,是一种深受消费者喜爱的营养保
健型高档蔬菜 [ 1] 。近年来 ,我国上升成为世界芦笋种植第一大国 , 2003年种植面积已达 7. 5万 hm2 ,同时正在大
力开展芦笋遗传育种 、栽培与生理 、加工开发等研究 [ 1] 。其中 ,芦笋组织培养 、单(多)倍体育种 、种间杂交 、种质
资源分析等研究都需要进行染色体倍性鉴定甚至核型分析 ,因此优良的染色体标本制备方法将为这些研究提供
有力的技术支撑。在国外 , Lophen,H. (1976, 1979)[ 2, 3]先后报道了芦笋染色体的分带研究和芦笋的性染色体鉴
定 , Y. Uno等 [ 4]用 HC l解离 Feulgen染色常规压片方法进行了芦笋染色体标本制备;但国内尚未见芦笋染色体
标本制备的正式报道。 20世纪 70年代末 ,国内外一些研究工作者将人类及动物涂片法中可取之处应用到植物
上 ,创立了植物去壁低渗法 [ 5] ,该方法简单 ,效果好。陈瑞阳等 [ 6]应用此方法对我国 95科 331属 2834种植物的
染色体数目进行了研究 ,完成了 1045种植物核型分析 ,取得了很好的研究效果。为此 ,笔者采用去壁低渗法进
行了芦笋染色体标本制备的研究。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
供试材料为江西省农科院第二届国际芦笋区域试验品种 “Atlas”的种子。种子处理:将芦笋种子用 0. 1%
HgCl2溶液消毒 15m in,在温水中浸种 30h,放在培养皿中用滤纸法催芽 ,温度 22 ～ 28℃。
1. 2　试验方法
用去壁低渗火焰干燥法制备染色体标本。取材:上午 9:00 ～ 11:00挑选根长 1 ～ 2cm且长势好的种芽 ,切下
其 1㎝长的根尖。预处理:用 2mm ol /L的 8 -羟基喹啉处理 2h。固定:用 3份甲醇∶1份冰醋酸静置固定 30m in,
ddH2O洗 3次 ,最后一次浸 5m in作为前低渗。酶解去壁:2. 0%纤维素酶 +1. 0%果胶酶 , 37℃,酶解 30 ～ 60m in。
然后用 ddH2O洗 3次 ,最后一次浸 5m in作为后低渗。再固定:3份甲醇∶1份冰醋酸 ,静置 30m in。制片:涂片法 ,
火焰干燥。脱水:甲醇脱水 3 ～ 5s。染色:40份磷酸缓冲液∶1份 G iem sa染色液 , pH7. 2,染色 4 ～ 5h。自来水冲洗
分化 ,干燥。观察 30个分散良好的细胞 ,确定染色体数目。
2　结果与分析
植物去壁低渗法的原理是 ,植物根尖分生组织细胞经果胶酶和纤维素酶处理后 ,其中胶层的果胶质及纤维
素构成的细胞壁被消化 ,成为游离的原生质体;然后用低渗溶液处理 ,使细胞核中的染色体向细胞质中自然扩
散 ,经固定 、火焰干燥、染色 ,即可制备出染色体长度适中、集中而不重叠 、各部分形态结构清晰的优良染色体标
本。其中 ,除去细胞壁是该技术的关键。因此 ,本研究在最重要的影响因素酶解去壁的时间上设置了 3个水平:
30m in、45m in和 60m in;经过反复实验 ,发现 45m in酶解效果最好。图 1就是使用 2mmo l /L的 8 -羟基喹啉预处
理 2h,酶解 45m in后得到的染色体标本图。其中的染色体着色深 ,染色体形态比较完整均一 ,背景十分清爽 ,为
　江西农业学报　2006, 18(2):15 ～ 16　
Ac taAg ricu ltu rae Jiangxi　　　　　 　
收稿日期:2006- 01- 10
　作者简介:周劲松(1976 -),男,湖北黄梅人 ,硕士 ,从事植物生物技术研究工作。
染色体形态数目的观察创造了良好的条件。因此 ,可以初步确定 2mmol /L的 8 -羟基喹啉预处理 2h,酶解 45m in
是芦笋染色体标本制备较佳的实验处理条件。
同时 ,选择 30个染色体分散良好的细胞观察计数 ,所有细胞的染色体数目全为 20条 ,占计数细胞总数的
100%,因此确定芦笋品种 “Atlas”的体细胞染色体数目为 2n=20。
图 1　芦笋体细胞分裂中期 ,示染色体 2n=20(10×100)
3　讨论
植物体细胞制片包括切片法 、压片法和去壁低渗和孚尔根染色等方法 ,几种方法各有特点 [ 7] 。其中 ,去壁低
渗是最新的一种方法 ,该方法简单 ,不需要特殊药品和盖玻片 ,是目前研究细胞分裂和染色体动态变化的首选方
法。采用去壁低渗法 ,染色体分散性好 ,背景清爽 ,并且大部分可用于核型分析。此外 ,去壁低渗法将材料做成
细胞悬浮液滴片 , Giemsa染色后 ,可方便地在显微镜下直接观察。因此 ,去壁低渗法在染色体的研究工作中正显
示出愈来愈重要的作用。
植物去壁低渗法前人已做了许多研究 [ 5 ～ 7] ,本研究与前人的研究相比有以下 4个创新之处:其一是两次固
定。固定的目的是尽快杀死细胞 ,并使染色体结构尽可能保持不变和便于染色 ,酶解前增加一次固定还可以防
止酶解过程中因细胞膜失去半渗透性部分染色体分散到细胞质中去 ,因此增加了前固定的细胞分裂相常常较
多。其二是酶解温度。纤维素酶活性最佳温度约在 22 ～ 25℃,果胶酶活性最佳温度比纤维素酶的稍高 ,因此通
常酶解去壁的温度控制在 25℃左右 ,但酶解过程中混合酶液的 pH值才是更关键的因素 ,而且随着时间的延长
混合酶液的活性也降低 ,适当升高酶解温度可以缩短酶解时间 ,本研究采用 37℃不但完全可行而且显著缩短了
酶解时间。其三是以酶解前后 ddH2O清洗静置作为前 、后低渗处理 ,节约了实验时间。其四是通过甲醇脱水有
效地除去玻片上的杂质;染色后自来水冲洗分化 ,得到深浅不一的带型 ,达到染色体分带类似的效果。本研究使
用 2mm ol /L的 8 -羟基喹啉预处理种子根尖 2h,酶解 45m in后得到的染色体标本图优于 Y. Uno等 [ 4]用 HCl解
离 Feulgen染色常规压片方法所得到的效果 ,但是染色体还过于凝缩 ,着丝点不明显 ,不便直接进行核型分析 ,有
待于进一步优化试验条件。
致谢:本实验得到了江苏省植物功能基因组学重点实验室龚志云等老师的指导和帮助 ,特表感谢。
参考文献:
[ 1] 陈光宇.芦笋无公害生产技术 [M ].北京:中国农业出版社 , 2005.
[ 2] Lophen, H . G iemsa - banding o f them ito chromosome asparagus(Asparagusofficinalis L. )and spinach (Spinacia oleracea Linn. )[ J] . Z.
Pflanzenzücht, 1976, 76(3):225～ 230.
[ 3] Lophen, H . Identifica tion of the sex chromosome pair in asparagus(Asparagus officinalis L. )[ J] . Z. Pflanzenzücht, 1979, 82(2):162～
173.
[ 4] Y. Uno, Y. Li,M. Kanechi, et a.l Haplo id production from polyembryonic seeds ofAsparagus officinalis L[ A] . P roceedings of the 10th in ter-
national asparagus symposium [ C] . 217～ 224.
[ 5] 孙敬三 ,钱迎倩.植物细胞学研究方法 [M ].北京:科学出版社 , 1987.
[ 6] http:/ /tech. enorth. com. cn /system /2004 /04 /05 /000762263. sh tm .l
[ 7] 朱徵.植物染色体及染色体技术 [M ].北京:科学出版社 , 1982. 42～ 92.
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