全 文 ：收稿日期:2008-07-02
基金项目:浙江宁波市科技局青年基金项目(2005A620014)。
作者简介:张莉静(1965-), 女(汉族), 浙江宁波人 , 副教授 , 主要从事中药及天然药物活性成分的药理活性研究 ,
Tel.0574-88222795, E-mailzhanglj@mail.zphc.net。
文章编号:1006-2858(2009)04-0307-05
杨梅树皮提取物及杨梅素抗肿瘤活性
张莉静1 , 刘志国 2 , 孟大利2 , 夏明钰 3
(1.浙江医药高等专科学校 药学系 , 浙江 宁波 315100;2.沈阳药科大学 中药学院 ,辽宁 沈阳 110016;
3.沈阳药科大学 生命科学与生物制药学院 , 辽宁 沈阳 110016)
摘要:目的 对杨梅树皮提取物 、提取物的大孔吸附树脂各洗脱部位及杨梅素单体化合物进行体外
抗肿瘤研究。方法 采用 MTT法测定细胞死亡率;采用倒置显微镜观察细胞形态学变化;用琼脂糖
电泳观察 DNA片段化 。用 Western印迹法分析药物对蛋白质水平的影响。 结果 杨梅树皮提取物
及其大孔吸附树脂洗脱物 、杨梅素单体化合物体外对人宫颈癌 HeLa细胞 、人黑色素瘤A375-S2细
胞 、人乳腺癌MCF-7细胞和人肝癌 HepG2细胞均具有明显的细胞毒作用。杨梅素明显抑制 HeLa
细胞的增殖 , 诱导 HeLa细胞调亡。Caspase-3、Caspase-9抑制剂可明显抑制 50 mg·L-1杨梅素诱导
的凋亡。 Western印迹结果显示 50 mg·L-1杨梅素作用 36 h后Caspase-3前体及其底物 ICAD和
PARP发生降解。结论 杨梅树皮提取物及其大孔吸附树脂洗脱物具有明显的细胞毒作用 , 杨梅素
(50mg·L-1)通过激活 Caspase途径诱导 HeLa细胞凋亡。
关键词:杨梅树皮;杨梅素;Hela细胞;抗肿瘤
中图分类号:R96　　　文献标志码:A
　　杨梅(MyricarubraSieb.etZucc.)是原产中
国的亚热带果树之一 ,野生种生长史已有 7 000
多年 ,人工栽培已有 2 000多年 。我国产杨梅属
植物约 5种 ,主要分布于西南至东部地区。杨梅
素 ,又称杨梅树皮素 ,是从杨梅树皮中提取的多羟
基黄酮类化合物 。杨梅树皮在民间用作抗菌消炎
药 ,杨梅树皮中主要含有杨梅素和杨梅素甙 ,但其
相关活性研究甚少;以往对杨梅素的研究也多集
中在其对血小板活化因子的拮抗作用[ 1-2] 、降血
糖 [ 3-4] 、抗氧化 [ 5]等方面 ,而对杨梅中分离得到的
杨梅素的抗肿瘤活性 ,国外曾有报道 [ 6] , 但国内
至今尚未见有报道。杨梅树皮资源在我国极为丰
富 ,经过修剪丢弃的杨梅树枝可做为长期大量的
植物来源。因此 ,为了深度开发及利用杨梅资源 ,
丰富其药用途径 ,本文作者首次对杨梅树皮提取物
及其大孔吸附树脂洗脱物 、杨梅素单体化合物的体
外抗肿瘤活性作用进行了考察。
1　仪器与材料
酶联免疫分析仪(奥地利 Techan公司),二氧
化碳培养箱(上海福玛实验设备有限公司),倒置
生物显微镜(德国 Motic公司), 96孔培养板(丹
麦 Roskilde公司)。
RPMI1640培养基(美国 Gibco公司),胎牛
血清(北京元亨圣马生物技术研究所),琼脂糖 、
溴化乙锭 、DNA分子量标准 、甲基噻唑蓝(thia-
zolylbluetetrazoliumbromide, 简称 MTT)、Hoe-
chest33258、二甲基亚砜 (dimethylsulfoxide, DM-
SO)均购于美国 Sigma公司 , z-IETD-fmk, z-LEHD-
fmk(美国 EnzymeSystems公司), 抗 ICAD抗体
(美国 SantaCruzBiotechnology公司),抗Caspase-
3抗体(美国 SanDiego公司), 5-氟-2, 4-三氧代嘧
啶(fluorouracil, 5-FU,美国 Sigma公司),各种药
物用 DMSO溶解后用 RPMI1640稀释至所需质
量分数 (DMSO终质量分数 ≤0.1%)。HPD100
型大孔吸附树脂 (河北沧州宝恩化工有限公
司),柱色谱试剂 (分析纯 , 康科德科技有限公
司)。
杨梅素乙醇提取物 、大孔吸附树脂体积分数
为 60%乙醇洗脱物 、大孔吸附树脂体积分数为
95%的乙醇洗脱物 、杨梅素 (含量质量分数 >
98%)均由浙江医药高等专科学校药学系提供。
人宫颈癌 HeLa细胞 、人黑色素瘤A375-S2细
胞 、人乳腺癌 MCF-7细胞和人肝癌 HepG2细胞
第 26卷 第 4期
2 0 0 9 年 4 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
JournalofShenyangPharmaceuticalUniversity
Vol.26 　No.4
Apr.2009 p.307
(美国 Americantypeculturecolection公司)。细
胞接种在含质量分数为 10%的胎牛血清 、质量分
数为 2%的谷氨酰胺的 RPMI1640培养液中 ,在
37 ℃,体积分数为 5%的 CO2培养箱中培养。
2　方法
2.1　样品的制备
杨梅树皮经体积分数为 80%的乙醇溶液回
流提取 3次 ,每次 3h,提取液减压回收乙醇 ,得样
品 1;样品 1用水溶解 ,经大孔树脂水洗脱后 ,分
别用体积分数为 60%和体积分数为 95%的乙醇
梯度洗脱 ,得样品 2和 3;大孔树脂体积分数 95%
乙醇洗脱液回收溶剂 、浓缩 ,所得水溶液依次用石
油醚 、乙酸乙酯 、正丁醇分步萃取。乙酸乙酯萃取
物得样品 4,其经硅胶吸附柱色谱氯仿 -甲醇梯度
洗脱 ,体积比为 100∶10部分得到样品 5,经理化
常数测定 ,并与对照品共薄层 ,鉴别其为杨梅素 。
2.2　细胞生长抑制
每孔 5×103 个细胞的密度接种于 96孔板
中 ,每孔 100 μL,培养过夜后加入各浓度药物分
别于 48 h用 MTT法测定细胞死亡率[ 7] 。
2.3　细胞形态学变化的观察
每瓶 1×106个细胞的密度接种于 50 mL细
胞培养瓶中 ,培养 24 h后加入质量浓度为 0和
50 mg·L-1的杨梅素 ,用倒置显微镜观察 。
2.4　荧光染色
每瓶 1×106个细胞的密度接种于 50 mL细
胞培养瓶中 ,培养 24 h后加入质量浓度为 0和
60 mg·L-1的杨梅素 ,培养 36 h,收集细胞 ,用磷
酸盐缓冲液(PBS)洗 1次 ,用质量分数为 3.7%
的多聚甲醛室温固定 1 h, 1 000 r·min-1离心
5 min,弃去上清液 ,用 PBS洗 1次 ,将细胞重悬于
100μLPBS中 ,取细胞悬液 10 μL,加入 Hoechst
33258(1 mmol·L-1)2 μL, 37 ℃染色 15 min,荧
光显微镜下观察 [ 8] 。
2.5　DNA片断化电泳
收集 1×106个以上的细胞 ,用 PBS洗 2次 ,
加入 100 μL细胞裂解液(10 mmol·L-1、pH7.4
的 Tris-HCl、10mmol·L-1 、pH8.0的 EDTA,质量
分数为 0.5%的 TritonX-100)4 ℃裂解 10 min,
25 000 r·min-1离心 20 min, 收集上清液。加入
40 ng· L-1 RNase, 37 ℃孵 育 1 h后 加入
40 ng·L-1 proteinkinaseK, 37 ℃孵育 1 h,加入
20 μL5 mol·L-1盐酸溶液和 120 μL异丙醇 ,
-20 ℃过夜。 25 000 r·min-1离心 15 min,弃去
上清液 ,再次 25 000 r·min-1离心 5 min,弃去上
清液 ,用 Tris-EDTA(pH7.5)缓冲液溶解沉淀。
用质量分数为 2%的琼脂糖凝胶 100 V电泳 ,
0.5mg·L-1溴化乙锭染色后紫外灯下观察 [ 9] 。
2.6　Western印迹法
药物处 理后收集悬浮及贴壁的 细胞 ,
1 000 r·min-1 离心 10 min,以 PBS洗 2次 ,用细
胞裂解液(50mmol·L-1 HEPES,质量分数为 1%
的 Triton-100, 100 mmol·L-1 NaF, 1 mmol·L-1
EDTA, 1 mmol·L-1 EGTA, 2 mmol·L-1正钒酸
钠 , 1mmol·L-1 PMSF, 10mg·L-1 pepstatinA)于
冰浴裂解 1 h, 15 000 r·min-1离心 5 min,收集上
清液。经 Bio-Rad法进行蛋白定量后等量样品以
质量分数为 12%的十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺
凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质 。电泳后将蛋
白转印至硝酸纤维素膜上 ,质量分数为 5%的脱
脂奶粉封闭后 ,一抗封闭过夜 ,再以辣根过氧化酶
标记的二抗封闭液封闭 1h,以二氨基联苯胺溶液
显色 ,扫描记录 [ 10] 。
3　结果
3.1　各种提取物的细胞毒作用
考察了按 “2.1”条方法制备的各种提取物对
HepG2、A375-S2、MCF-7和 HeLa细胞生长抑制
作用。结果表明 ,各种提取物对肿瘤细胞均有不
同程度的生长抑制作用 (见图 1)。各种提取物
中 ,杨梅素的活性最好 ,强于总提取物和大孔树脂
的各洗脱部位 ,提示杨梅素为杨梅树皮中的主要
活性成分。并且杨梅素对 HeLa细胞的生长抑制
作用呈时间和剂量依赖性(见图 2)。根据该试验
结果 ,选取 50mg·L-1杨梅素进行了进一步试验
研究。
3.2　杨梅素诱导 HeLa细胞形态学变化
光学显微镜下观察 50 mg·L-1杨梅素作用于
HeLa细胞 48 h后细胞变圆 、膜皱缩 、发泡 、产生
凋亡小体(见图 3a、b)。通过 Hoechst33258荧光
染色法进一步观察杨梅素处理后细胞核的形态变
化 。未经药物处理细胞核表面光滑 ,发出的荧光
均匀 ,药物处理后细胞核皱缩 ,发出致密的荧光 ,
在核膜边缘可见明显的新月状小体(见图 3c、d)。
3.3　DNA电泳观察
细胞发生凋亡时 ,较显著的生化标志是 DNA
被核酸内切酶在核小体单位之间降解 ,断裂为
308 沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 26卷　
Fig.1　TheIC50 valuesofdifferentextractsofthebarkofMyricarubraSieb.etZucc.andmyricetinmyricetinonfour
cellines
Fig.2　GrowthinhibitoryefectsofmyricetinonHeLacells
180 ～ 200bp的片段 ,在琼脂糖电泳上呈现出梯状
DNA区带图谱(DNAladder)。 50 mg·L-1杨梅素
作用于 HeLa细胞 36 h后即发生明显的 DNA片
段化 ,并随时间延长强度增大(见图 4)。
3.4　Caspase抑制剂对杨梅素诱导 HeLa凋亡的抑
Caspase家族是一类半胱氨酸蛋白酶 ,能特异
性裂解天冬氨酸后的蛋白残基 ,在细胞凋亡的信
号传导中起重要作用 。以 z-DEVD-fmk(Caspase-3
抑制剂)和 z-LEHD-fmk(Caspase-9抑制剂)预处
理细胞 1 h后在不同程度上抑制了 50mg·L-1
a, b—Changesofcelularmorphologywereobservedat0h(a)and36 h(b)inthepresenceofmyricetin50 mg·L-1 with×200
magnification.Barindicates200 μm;c, d—Morphologicchangesofcelnuclei.HeLacellswereincubatedinthemediumalone
(c)or50 mg·L-1 myricetinfor36 h(d), andthenucleiwerestainedwithHoechst33258 toidentifyapoptoticcellswith×400magnification.Barindicates200 μmFig.3　MorphologicchangesofHeLacelstreatedwithmyricetin
309第 4期 张莉静等:杨梅树皮提取物及杨梅素抗肿瘤活性
a, b, c, d, e—Thecelswereincubatedinthemediumalone
(a), themediumwithDMSO(b)orin50 mg·L-1 myricetin
for48(c), 36(d)and24(e)h;m—DNAmolecularweight
marker
Fig.4　DNAfragmentationofHeLacels
杨梅素诱导的细胞凋亡(见图 5)。
Fig.5　Effectsofcaspaseinhibitorsonmyricetin-induced
HeLacelldeath
3.5　Procaspase-3及其底物 ICAD的表达
Caspase-3位于 Caspase级联反应的下游 ,是
细胞凋亡的执行者 。 Western印迹结果表明
50 mg·L-1杨梅素作用于 HeLa细胞 36 h后
Caspase-3前体被降解 ,即产生活化的 Caspase-3;
同时 Caspase-3底物 ICAD(inhibitorofcaspasede-
pendentDNase)被降解(见图 6),进一步表明杨梅
素诱导 HeLa细胞凋亡时激活了 Caspase-3。
4　讨论
从中草药中寻找安全有效的肿瘤化疗替代药
物成为抗肿瘤药物研究的热点之一。本实验中杨
梅树皮提取物及其大孔吸附树脂洗脱物 、杨梅素
单体化合物体外对人宫颈癌 HeLa细胞 、人黑色
素瘤A375-S2细胞 、人乳腺癌MCF-7细胞和人肝
癌 HepG2细胞均具有明显的细胞毒作用 。进一
Fig.6　Expressionofprocaspase-3 andICADinmyrice-
tin-treatedHeLacells
步的形态学及 DNA片段化电泳结果表明 ,杨梅树
皮的主要成分杨梅素是通过诱导肿瘤细胞凋亡发
挥其细胞毒作用的。
　　Caspase家族成员中位于信号转导途径上游
的 Caspase-8及 Caspase-10由死亡受体 Fas、TNFα
受体及 TRAIL激活 , Caspase-9由线粒体途径激
活 。在线粒体途径的调控中 , Bax活化后使线粒
体外膜通透性升高 ,引起细胞色素 c释放到胞浆
中 ,细胞色素 c与 Apaf-1结合激活 Caspase-9前体
然后激活下游的 Caspase-3等 , 然后一系列下游
Caspase的底物被降解 ,最终完成细胞调亡的过
程 [ 11] 。本实验结果表明 Caspase-9抑制剂可明显
抑制杨梅素诱导的细胞凋亡 , Caspase-3底物
ICAD被降解 , DNA发生片段化 ,提示死亡信号转
导过程中线粒体相关途径可能参与这一过程。
在我国 ,经过修剪丢弃的杨梅树枝可做为长
期大量的植物来源 ,资源极为丰富 。本文作者的
研究结果表明该植物具有较强的抗肿瘤活性。因
此 ,无论在来源还是活性方面都表现出很好的优
势 ,极有潜力将该植物开发成为具有抗肿瘤活性
的药物 。
参考文献:
[ 1] 陈文梅 ,金鸣 , 吴伟 , 等.红花黄酮成分抑制血小板
激活因子介导的血小板活化作用 [ J] .药学学报 ,
2001, 36(12):881-885.
[ 2] 臧宝霞 ,金鸣 , 吴伟 , 等.杨梅素对血小板活化因子
拮抗的作用 [ J] .药学学报 , 2003, 38(11):831 -
833.
[ 3] YOSHIKAWAM, SHIMADAH, NISHIDAN, etal.An-
tidiabeticprin2ciplesofnaturalmedicinessⅡ.Aldose
reductaseandglucosi2 daseinhibitorsfromBrazilian
naturalmedicine, theleavesofMyr2 ciamultifloraDC.
(Myrtaceae):StructuresofmyrciacitrinsⅠ andⅡ and
310 沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 26卷　
myrciaphenonesAandB[ J] .Chem PharmBull, 46
(1):113-119.
[ 4] 钟正贤 ,陈学芬 , 周桂芬 , 等.广西藤茶中杨梅树皮
素降血糖的实验研究 [ J] .中国现代药学应用杂志 ,
2003, 20(6):466-468.
[ 5] 邹耀洪.杨梅果核中油脂抗氧化成分的研究 [ J] .林
产化学与工业 , 1995, 15(2):13-17.
[ 6] ZHANGQ, ZHAOXH, WANGZJ.Flavonesandfla-
vonolsexertcytotoxicefectsonahumanoesophageal
adenocarcinomacellline(OE33)bycausingG2/Mar-
restandinducingapoptosis[ J] .FoodChemToxicol,
2008, 46(6):2 042-2 053.
[ 7] TAKANOF, TANAKAT, TSUKAMOTOW, etal.Isola-
tionof(+)-cateninand(-)-epicateninfromActinidia
argutaasbonemarrowcelproliferationpromotingcom-
pounds[ J] .PlantaMed, 2003, 69(4):321-326.
[ 8] ZHOUB, WULJ, TASHIROS, etal.Silibininprotects
ratcardiacmyocytefrom isoproterenol-inducedDNA
damageindependentonregulationofcellcycle[ J] .Bi-
olPharmBull, 2006, 29(9):1 900-1 905.
[ 9] KITAMURAY, MIYAMURAA, TAKATAK, etal.Pos-
sibleInvolvementofBothEndoplasmicreticulumand
mitochondria-dependentpathwaysin hapsigargin-in-
ducedapoptosisinhumanneuroblastomaSH-SY5Y
cels[ J] .JPharmacolSc, 2003, 92:228-236.
[ 10] SUZUKIK, HINOM, KUTSUNAH, etal.Selectiveac-
tivationofp38Mitogen-activatedproteinkinasecascade
inhumanneutrophilsstimulatedbyIL-1 β[ J] .JImmu-
nol, 2001, 167(11):5 940-5 947.
[ 11] CHANGHY, YANGXL.Proteasesforcellsuicide:
functionsandregulationofcaspases[ J] .MicroMolBiol
Rev, 2000, 64(12):821-846.
Antitumoractivitiesoftheextractsfromthebarkof
MyricarubraSieb.etZucc.andmyricetin
ZHANGLi-jing1 , LIUZhi-guo2 , MENGDa-li2 , XIAMing-yu3
(1.DepartmentofPharmacy, ZhejiangPharmaceuticalColege, Ningbo315100, China;2.SchoolofTradi-
tionalChineseMateriaMedica, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016, China;3.Schoolof
LifeScienceandBiopharmaceutics, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016, China)
Abstract:ObjectiveTostudytheantitumoractivitiesoftheextractsfromthebarkofMyricarubraSieb.et
Zucc.andmyricetin.MethodsSolventextractiontogetherwithcolumnchromatographywasusedtoisolate
chemicalconstituents.CelviabilitywasmeasuredbyMTTmethod.Morphologicalchangeswereobserved
byphasecontrastmicroscopyandHoechst33258staining.DNAfragmentationwasassayedbyagarosegele-
lectrophoresis.ProteinlevelwasdetectedbyWesternblotanalysis.ResultsMyricetininducedHeLacelap-
optosis.TheapoptosisofHeLacelswaspartialyreversedbycaspase-3 andcaspase-9 inhibitors.Treatment
ofHeLacelswithmyricetinfor36hinducedICADandPARPdegration.ConclusionsMyricetininduces
HeLaceldeathviaactivationofcaspases.
Keywords:MyricarubraSieb.etZucc.bark;myricetin;HeLacel;antitumor
311第 4期 张莉静等:杨梅树皮提取物及杨梅素抗肿瘤活性