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藏红花花瓣体外抗氧化活性部位的筛选与研究



全 文 :收稿日期:2012-10-29 接受日期:2012-12-21
基金项目:国家自然科学基金项目(61172149)
* 通讯作者 Tel:86-21-54341011;E-mail:wzhang@ bio. ecnu. edu. cn
天然产物研究与开发 Nat Prod Res Dev 2013,25:1489-1493,1567
文章编号:1001-6880(2013)11-1489-06
藏红花花瓣体外抗氧化活性部位的筛选与研究
黄一泓,刘雅莉,武文斌,张 雯*
华东师范大学生命科学学院,上海 200062
摘 要:采用有机溶剂萃取法分离藏红花花瓣乙醇提取物,分别得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相
和水相 5 个不同极性部位,以总抗氧化能力(T-AOC)及对羟自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O-·2 )和 2,2-二
(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基自由基(DPPH·)的清除能力为评价指标初步筛选其活性部位,并对活性最强部位进
行了脂质抗氧化研究。结果显示,藏红花花瓣提取物不同极性部位均能明显清除上述自由基,其中乙酸乙酯相
的清除能力最强。在进一步的脂质抗氧化研究中,10 mg /mL 乙酸乙酯相对红细胞自氧化及 H2O2 诱导的过氧
化溶血的抑制率分别达到 40. 36%和 68. 82%;对小鼠肝脏自氧化及 H2O2 诱导的过氧化所产生的 MDA的抑制
率分别为 39. 81%和 47. 53%。实验结果表明:藏红花花瓣不同极性部位提取物均有不同程度的抗氧化活性,其
中以乙酸乙酯相的抗氧化能力最强。
关键词:藏红花花瓣;自由基;乙酸乙酯提取物;脂质过氧化
中图分类号:Q946. 889 文献标识码:A
Bioactivity-guided Fractionation of Petals of Crocus
Sativusand Their Antioxidant Activity Investigation
HUANG Yi-hong,LIU Ya-li,WU Wen-bin,ZHANG Wen*
School of life science,East China Normal University,Shanghai 200062,China
Abstract:In this study,various fractions isolated from the petals of Crocus sativus were assessed for their antioxidant ac-
tivities. Five extracts were obtained by using different polarity solvents,including petroleum ether,chloroform,ethyl ace-
tate and n-butanol. The antioxidant activities of the five fractions were evaluated by the scavenging power of three free
radicals,namely DPPH·,·OH,O-·2 and T-AOC. The results indicated that the five fractions had strong scavenging ca-
pacity on DPPH·,·OH and O-·2 ,especially the ethyl acetate fraction (EA). Hence,effect of EA on anti-lipid peroxi-
dation was investigated. In addition,the protective effects on hemolysis of erythrocytes and lipid peroxidation of mice ho-
mogenate were measured by in vitro system. The inhibition of EA on hemolysis and lipid peroxidation were 40. 36% and
39. 81%;the inhibition of EA on hemolysis and lipid peroxidation induced by H2O2 were 68. 82% and 47. 53% when
EA concentration was 10 mg /mL. According to data obtained from these antioxidant tests,the ethyl acetate fraction dem-
onstrated the strongest antioxidant capacity.
Key words:saffron petals;free radicals;ethyl acetate extract;lipid peroxidation
藏红花(Saffron,Crocus sativus L.) ,又名番红
花、西红花、洎夫蓝、撒法即,为鸢尾科番红花属多年
生草本植物,据《中华人名共和国药典》记载,其药
用部位为干燥的花柱,藏红花作为传统中药其功效
为:活血化瘀,凉血解毒,解郁安神。用于经闭癥瘕,
产后瘀阻,温毒发斑,忧郁痞闷,惊悸发狂等[1]。除
药用外,它可用作食品添加剂、食用色素和高级香
料。近年对藏红花的药理研究表明,其花柱中的主
要有效成分—藏红花苷对于癌症、冠心病、动脉粥样
硬化、高血脂症等多种疾病具有较好的防治作
用[2]。其花柱因产量极低同时具有神奇的药效而
被世人封以“植物黄金”的称号,同时,大量的非药
用部位—花瓣在藏红花的制药工业中成为副产品,
造成极大的资源浪费。已有学者从藏红花花瓣的甲
醇提取物中分离得到 35 个单体化合物,主要为萜类
和黄酮醇类[3]。有研究显示:藏红花花瓣提取物对
抑郁症有一定的疗效[4],并对 DPPH自由基、白血病
细胞、白色念珠菌有一定的抑制作用[5]。此外从花
瓣中分离到的黄酮醇类单体对酪氨酸酶有较好的抑
制作用[6]。上述研究表明藏红花花瓣具有活性成
分及功能,具备进一步利用的基础。
为此,本研究以废弃的藏红花花瓣为材料,利用
体外抗氧化活性体系筛选出其活性部位,并从清除
自由基和抗脂质过氧化两方面对其展开研究,旨在
填补研究空白,延长产业链,为藏红花的深度利用提
供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料与仪器
1. 1. 1 药品与动物
总抗氧化能力(T-AOC)测试盒,购自南京建成
生物工程研究所;2,2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基
自由基(DPPH·) ,购自 Sigma 公司;硫酸亚铁(Fe-
SO4·7H2O)、水杨酸、30% H2O2、盐酸、邻苯三酚、
石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、无水乙醇、硫
代巴比妥酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、三氯乙酸等
试剂均为国产分析纯。ICR 雄性小鼠,体重 18 ~ 20
g,购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
1. 1. 2 主要仪器
粉碎机(上海鼎广机械设备有限公司) ;RE-
2000 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂) ;DHG-
9246A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备
有限公司) ;7200 型可见分光光度计(上海市第三分
析仪器厂) ;HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业
有限公司医疗设备厂) ;梅特勒-托利多 B-L 系列电
子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司) ;TL-16R 台
式高速冷冻离心机(上海市离心机机械研究所)。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 原料预处理
藏红花花瓣,由浙江寿仙谷药业提供,由华东师
范大学生命科学学院李宏庆副教授鉴定。置烘箱
50 ℃烘干至恒重,粉碎过 60 目筛,密封袋避光保存
备用。
1. 2. 2 藏红花花瓣不同极性部位的制备
准确称取 100 g藏红花花瓣干粉末,于 10 倍体
积 70%的乙醇 60 ℃下回流提取 3 次,过滤,合并滤
液,45 ℃减压浓缩,真空冷冻干燥,得到藏红花花瓣
提取物 45. 97 g。称取 10 g 藏红花花瓣提取物,溶
入蒸馏水中,混匀,转入分液漏斗中,加入相同体积
的石油醚,振摇 10 min ,放气,静置 8 h后,放出下层
水溶液,收集石油醚部分;下层水溶液用同法继续萃
至上层液体无色为止,合并石油醚萃取液,减压浓
缩,浓缩液真空冷冻干燥即得到 0. 752 g 藏红花花
瓣提取物的石油醚相(PE)。石油醚萃取后的剩余
水溶液按上述方法依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃
取,分别得到 0. 985 g氯仿相(T)、1. 005 g乙酸乙酯
相(EA)、1. 254 g 正丁醇相(B)。正丁醇萃取后的
剩余水溶液直接在 60 ℃下减压浓缩,真空冷冻干燥
得到 4. 676 g藏红花花瓣提取物的水相(W)部分。
1. 2. 3 藏红花花瓣体外抗氧化活性部位的筛选
用含 1% DMSO 的无水乙醇将藏红花花瓣 5 个
不同极性部位的提取物分别配成 0. 1、0. 5、1、5 mg /
mL的溶液作为供试液备用。
1. 2. 3. 1 DPPH·清除能力测定
按照文献[7]方法略作改动,在 1. 9 mL,0. 065
mmol /L的 DPPH 自由基乙醇溶液中分别加入 0. 1
mL供试液。室温放置 30 min,于 517 nm 下测定吸
光度,每个反应做 3 个平行,取平均值。以 1% DM-
SO的无水乙醇代替样品作为空白对照,吸光度为
A0;以无水乙醇代替 DPPH 自由基溶液作为样底管
吸光度为 A2。DPPH自由基清除能力测定计算公式
如下:
清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0] × 100%
1. 2. 3. 2 羟基自由基清除能力测定
按照 Smirnoff 的方法[8]略作改动,在试管中依
次加入 6mmol /L 的硫酸亚铁 1 mL,6 mmol /L 的水
杨酸-乙醇溶液 1 mL,分别加入 1 mL 供试液,混匀
后后加入 0. 1%的 H2O2 溶液 1 mL,以蒸馏水补足
至总体积 5 mL。其中对照管以 1 mL 含 1% DMSO
的无水乙醇代替样液,样底管以乙醇代替水杨酸溶
液,摇匀后 37 ℃水浴 0. 5 h,离心,510 nm处测定吸
光值。清除率计算公式如下:
清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0] × 100%
式中,A1 为供试液的吸光度平均值;A2 为样底
管吸光度平均值;A0 为对照管吸光度平均值。
1. 2. 3. 3 超氧阴离子清除能力测定[9]
取 0. 05 mol /L 的 PBS 缓冲溶液(pH = 8. 0)
2. 25 mL,分别加入 0. 5 mL 供试液和 25 mmol /L 的
邻苯三酚溶液 0. 2 mL,混匀后于 25 ℃水浴中反应 5
min,加入 0. 5 mL 80 mmol /L 的 HCI 终止反应,于
420 nm 处测定吸光度 A1,空白对照以同体积的 1%
DMSO的无水乙醇代替样品;为排除供试液颜色干
扰,样底管用同体积的无水乙醇代替邻苯三酚溶液。
清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]× 100%
0941 天然产物研究与开发 Vol. 25
式中:A1 为供试液的吸光度平均值;A2 为样底
管的吸光度平均值;A0 为空白对照管的吸光度平均
值。
1. 2. 3. 4 总抗氧化能力(T-AOC)测定
不同极性部位总抗氧化能力的测定使用总抗氧
化能力(T-AOC)测试盒进行,方法按照说明书操作。
1. 2. 4 藏红花花瓣活性部位对脂质过氧化的抑制
作用
取上述试验中对自由基清除效果最强的部位为
研究对象,配置成 0. 1、0. 25、0. 5、1、5、10 mg /mL 的
溶液作为供试液备用。
1. 2. 4. 1 藏红花花瓣提取物活性部位对红细胞自
发性氧化溶血的抑制作用[10]
小鼠眼眶取血,制成抗凝血,4 ℃,4000 rpm 离
心 5 min ,去除上层溶液,红细胞用预冷的生理盐水
洗涤 3 次制成 0. 5%的红细胞悬液备用。
取 0. 5%红细胞悬液 1. 5 mL,分别加入 0. 1 mL
试样,空白对照为等体积蒸馏水,混匀,于 37 ℃温育
24 h后用生理盐水稀释 4 倍,4000 rpm离心 10 min,
取上清液于 540 nm处测定 OD值。
对红细胞自氧化溶血的抑制率(%)= (1-A /
A0)× 100%
式中:A为试样的平均吸光度值,A0 为空白对
照的平均吸光度值。
1. 2. 4. 2 藏红花花瓣提取物活性部位对 H2O2 诱
导的红细胞氧化溶血的抑制作用
取 1. 2. 4. 1 制备的 0. 5%红细胞悬液 1 mL,分
别加入 0. 1 mL 试样(空白对照为等体积蒸馏水代
替) ,加入 0. 5 mL 的 50 mmol /L H2O2 启动反应,混
匀,37 ℃温育 1 h后生理盐水稀释 4 倍,4000 r /min
离心 10 min,取上清液于 415 nm处测定 OD值。
对 H2O2 诱导的红细胞氧化溶血的抑制率(%)
=(1-A /A0)× 100%
式中:A为试样的平均吸光度值,A0 为空白对
照的平均吸光度值。
1. 2. 4. 3 藏红花花瓣提取物活性部位对肝脏自发
性脂质过氧化的抑制作用[11]
小鼠颈椎脱臼致死,迅速取出肝脏,用冰冷的生
理盐水洗净,加入 10 倍体积冰冷的生理盐水,冰浴
匀浆,得到 10%的肝脏匀浆液备用。取 1 mL 肝匀
浆液于玻璃试管中,分别加入 0. 5 mL不同浓度的供
试样,空白对照加入等体积蒸馏水,混匀 37 ℃温浴
1 h,加入 1 mL的 20%三氯乙酸(TCA)溶液,混匀后
再加入 0. 7%的硫代巴比妥酸溶液 1. 5 mL,沸水浴
保持 15 min ,4000 rpm 离心 10 min,取上清液于波
长 532 nm处测定 OD值。
对肝脏自发性脂质过氧化的抑制率(%)=(1-
A /A0)× 100%
式中:A为试样的平均吸光度值,A0 为空白对
照的平均吸光度值。
1. 2. 4. 4 藏红花花瓣提取物活性部位对 H2O2 诱
导的肝脏脂质过氧化的保护作用
取 1. 2. 4. 3 制备的肝脏匀液 1 mL,分别加入
0. 5 mL不同浓度的供试样,空白对照加入等体积蒸
馏水,混匀 37 ℃温浴 15 min,各试管中加入 0. 1 mL
100 mmol /L H2O2,混匀 37 ℃温浴 0. 5 h,再分别加
入 1 mL 20%的三氯乙酸终止反应,然后加入 1 mL
0. 7%的硫代巴比妥酸溶液,混匀后于沸水中显色
15 min,4000 rpm离心 10 min,去除蛋白质沉淀取上
清液于波长 532 nm处测定 OD值。
对 H2O2 诱导的肝脏脂质过氧化的抑制率(%)
=(1-A /A0)× 100%
式中:A为试样的平均吸光度值,A0 为空白对
照的平均吸光度值。
2 实验结果
2. 1 藏红花花瓣提取物体外抗氧化活性部位的筛

2. 1. 1 藏红花花瓣不同极性部位对 DPPH·的清
除作用
图 1 藏红花花瓣提取物 5 个不同极性部位对 DPPH·的清
除作用
Fig. 1 Scavenging effects of five fractions with different polari-
ties on DPPH·
由图可知藏红花花瓣提取物的 5 个极性部位对
DPPH·均有一定的清除作用,除乙酸乙酯相外,其
他部位的清除作用没有表现出明显的浓度效应。5
mg /mL时各极性部位对 DPPH·的清除率分别为:
石油醚相 24. 54%,氯仿相 22. 97%,乙酸乙酯相
34. 95%,正丁醇相 25. 54%,水相 12. 29%。
1941Vol. 25 黄一泓等:藏红花花瓣体外抗氧化活性部位的筛选与研究
图 2 藏红花花瓣提取物 5 个不同极性部位对 O-·2 的清除
作用
Fig. 2 Scavenging effects of five fractions with different polari-
ties on O-·2
2. 1. 2 藏红花花瓣不同极性部位对超氧阴离子的
清除作用
各部位在 1 mg /mL 时对 O-·2 的清除作用有不
同程度的增强,5 mg /mL 时各部位对 O-·2 的清除率
分别达到:石油醚相 19. 88%,氯仿相 20. 49%,乙酸
乙酯相 75. 57%,正丁醇相 41. 81%,水相 41. 90%。
2. 1. 3 藏红花花瓣不同极性部位对羟自由基的抑
制作用
图 3 藏红花花瓣提取物 5 个不同极性部位对·OH的清除
作用
Fig. 3 Scavenging effects of five fractions with different polari-
ties on ·OH
在所测定的浓度范围内,氯仿相和乙酸乙酯相
对·OH的清除作用较其他 3 个部位强,各部位在 5
mg /mL时·OH 的清除分别为:石油醚相 28. 50%,
氯仿相 47. 44%,乙酸乙酯相 52. 48%,正丁醇相
15. 83%,水相 34. 70%。
2. 1. 4 藏红花花瓣不同极性部位总抗氧化能力(T-
AOC)的测定
在低浓度时各部位的总抗氧化能力均较弱,当
浓度升高到 5 mg /mL时,各极性部位总抗氧化能力
均明显增强,总抗氧化能力值(单位 /毫升提取物)
分别为 5. 51、3. 15、21. 49、8. 87、18. 92 个单位。
上述四个实验结果表明,藏红花花瓣提取物的
5 个不同极性部位对自由基都有一定的清除作用,
均表现出抗氧化活性,且在一定浓度范围内与浓度
图 4 藏红花花瓣提取物 5 个不同极性部位总抗氧化能
力(T-AOC)的测定
Fig. 4 Total antioxidant capacity of five fractions with differ-
ent polarities
呈现正相关效应;其抗氧化效果因反应体系的不同
而不同,且不同极性部位抗氧化活性稍有差异。综
合 4 中抗氧化体系评价藏红花提取物的 5 种不同极
性溶剂提取物,其中以乙酸乙酯相的抗氧化作用最
强,因此选择乙酸乙酯相作为进一步的研究对象。
2. 2 藏红花花瓣提取物乙酸乙酯相对脂质过氧化
的抑制作用
2. 2. 1 乙酸乙酯相对红细胞自氧化溶血的抑制作

图 5 藏红花花瓣提取物乙酸乙酯相对红细胞自氧化溶血
的抑制作用
Fig. 5 Inhibition effects of EA on hemolysis of mice erythro-
cytes
由图 5 可知,EA对红细胞自氧化溶血的抑制作
用在 5 mg /ml 时达到 40. 36%,抑制作用随着浓度
的增大而加强,IC50为 8. 82 mg /mL,说明乙酸乙酯相
能有效的减少红细胞温育过程中形成的脂质过氧化
物含量,对红细胞有一定的保护作用。
图 6 藏红花花瓣提取物乙酸乙酯相对 H2O2 诱导的红细胞
氧化溶血的抑制作用
Fig. 6 Inhibition effects of EA on hemolysis of mice erythrocytes
induced by H2O2
2941 天然产物研究与开发 Vol. 25
2. 2. 2 乙酸乙酯相对 H2O2 诱导的红细胞氧化溶
血的抑制作用
H2O2 与红细胞产生氧化反应,破坏细胞膜,引
起细胞损伤。图 6 中实验结果表明,EA 对 H2O2 诱
导的红细胞氧化溶血的抑制作用呈现浓度依赖效
应,且在 5 mg /mL 时抑制率达到 58. 91%,IC50为
4. 29 mg /mL,由此可见 EA 在细胞水平上也能够有
效抑制氧化损伤。
2. 2. 3 乙酸乙酯相对小鼠肝脏自发性脂质过氧化
的保护作用
图 7 藏红花花瓣提取物乙酸乙酯相对肝脏自发行性脂质
过氧化的保护作用
Fig. 7 Protective effects of EA on lipid peroxidation of mice liv-
er homogeate
EA对肝脏自氧化溶血的保护作用见图 7,在所
测定的浓度范围内,随着浓度升高对肝脏自发行性
脂质过氧化的保护作用加强,并呈现出良好的浓度
正相关趋势,在 10 mg /mL时对 MDA生成的抑制率
达到 39. 81%。
2. 2. 4 乙酸乙酯相对 H2O2 诱导的肝脏脂质过氧
化的保护作用
图 8 藏红花花瓣提取物乙酸乙酯相对 H2O2 诱导的肝
脏脂质过氧化的保护作用
Fig. 8 Protective effects of EA on lipid peroxidation of mice
liver homogenate induced by H2O2
H2O2 刺激肝脏产生过氧化物 MDA,其产量的
多少可以代表组织损害的程度。由图 8 实验结果可
知,在低浓度(0. 1 mg /mL ~ 1 mg /mL)范围内 EA
对 MDA生成的抑制作用缓慢的增强,但在高浓度
(1 mg /mL ~ 10 mg /mL)范围内,EA 对 MDA 生成
的抑制作用随着浓度的升高而迅速加强,在 10 mg /
mL时对 MDA生成的抑制率达到 47. 53%,说明 EA
能够有效地保护 H2O2 诱导的肝脏脂质过氧化。
3 讨论
本文着重于藏红花花被的药效研究,以体外抗
氧化系统来锁定其活性部位评价其活性。自由基清
除法是传统的抗氧化能力测定方法之一,因实验方
法简单快速,实验结果直观准确而广泛应用于评价
与测定抗氧化物质的活性。又因没有一种抗氧化体
系可以全面评价比较供试品的抗氧化活性,故选取
DPPH·、羟基自由基、超氧阴离子、总抗氧化能力等
四个指标来综合评价藏红花花瓣不同极性部位的抗
氧化活性。由实验结果可知,藏红花花瓣提取物的 5
个不同极性部位均有较好的清除自由基的能力,均表
现出抗氧化活性,其中以乙酸乙酯部位作用最明显。
目前已有研究证明,自由基增加所引起的肝脏
脂质过氧化是许多肝脏疾病的病因,如酒精性肝炎、
血色病、内毒素性肝损害、急、慢性肝炎和肝硬化、肝
脏肿瘤等[12],因此研究出天然的抗脂质过氧化剂具
有重要意义。本实验结果显示,藏红花提取物乙酸
乙酯相对红细胞氧化溶血及肝脏脂质过氧化均有较
好的保护作用,联系其对自由基的清除作用,可推断
其保护机理可能是与 H2O2 作用,阻止氧化反应的
进行,从而减少过氧化产物的生成。希腊学者 Aika-
teriniTermentzi[13]对藏红花花瓣的醇提取物进行 LC-
MS分析发现,其活性成分主要为黄酮醇类以及少量
生物碱。目前本实验中乙酸乙酯相的成分与作用机
理尚不明确,有待进一步研究。
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