全 文 ：《食品工业》2014 年第35卷第 8 期 92
杨梅核仁抗氧化肽的制备
朱俊朋1，陈惠云2，王超1*，陆艇3，王道勇4
1. 浙江农林大学农业与食品科学学院（杭州 311300）；2. 宁波市农业科学研究院（宁波 315040）;
3. 余姚市杨梅研究开发中心（余姚 315410）；4. 余姚市河姆渡杨梅酒业有限公司（余姚 315410）
摘 要 利用碱性蛋白酶对杨梅核仁进行水解, 制备得到生物活性肽。以·OH清除率为指标, 研究了反应起始
pH、酶用量、温度和酶解时间对制备杨梅核仁多肽工艺的影响; 并以·OH清除率为指标, 通过正交试验最终确定
酶解杨梅核仁蛋白制备杨梅核仁多肽的工艺条件为: pH 10, 酶用量1.3%, 温度30 ℃, 时间2 h。该条件下制备的杨梅
核仁多肽·OH清除率为46.75%。
关键词 杨梅核仁蛋白质; 酶法水解; 活性肽
Research on Preparation of Myrica rubra Nucleolus Antioxidant Peptide
Zhu Jun-peng1, Chen Hui-yun2, Wang Chao1*, Lu Ting3, Wang Dao-yong4
1. School of Agriculture and Food Science, Zhejiang Agriculture and Forestry University (Hangzhou 311300);
2. Ningbo Academy of Agricultural Sciences (Ningbo 315040); 3. Research and Development Center of Yuyao City
(Yuyao 315410); 4. Yuyao Hemudu Myrica rubra Marc Wine Co., Ltd. (Yuyao 315410)
Abstract Obtain bioactive peptides was studied by alkaline proteinase hydrolysis from nucleolus of Myrica rubra. The
infl uence of substrate hydrolysis time, the initial reaction pH, enzyme dosage, temperature and enzymatic hydrolysis time on
the preparation of protein from nucleolus of Myrica rubra was researched. The process conditions of enzymatic hydrolysis of
protein from nucleolus of Myrica rubra were optimalized by orthogonal test. The optimum conditions were pH 10, enzyme
dosage1.3%, 30 ℃, hydrolysis time 2 h. The ·OH clearance rate of the hydrolysis of Myrica rubra Nucleolus seed polypeptide
under the condition is 46.75%.
Keywords protein from nucleolus of Myrica rubra; enzymatic extraction; active peptide
杨梅在浙江、福建等地的种植面积逐年增长，
目前已达2 000万 hm2。杨梅成熟在温暖湿润的多雨季
节，且浆果类水果尤其不耐贮藏，除部分供应人们鲜
食，其余大部分用于加工成杨梅果汁、杨梅果酒，因
此产生了大量的加工剩余物，以2012年为例，约有6
万 t。这些加工剩余物主要是杨梅果肉形成的果渣和杨
梅核仁，在自然界堆积易腐败变质，造成环境污染。
分析表明：杨梅核仁蛋白是一种优质的蛋白质资
源[1]，是杨梅核仁中重要活性部分[2-3]。杨梅核仁榨油
后的饼粕中含有13％~16％的蛋白质，其含有多种氨
基酸[4]，具有较高的开发利用价值[5]。
植物源生物活性肽因具有良好的生理功能、较高
安全性和来源丰富等优点[6]，可作为功能性食品基料
添加到各类食品中去。但目前市场上，生产植物源活
性肽的原料主要集中在大豆、玉米、小麦这些主流粮
食作物上[7]。杨梅核仁价格便宜，营养丰富，蛋白质
含量非常高，来源丰富，是生产天然活性物质理想的
原料[8]。试验以杨梅核仁为原料，用酶解法提取杨梅
核仁蛋白，以·OH清除率为指标，探索杨梅核仁多
肽的最佳酶解工艺条件，为拓宽植物源生物活性肽的
开发利用途径提供理论数据。
1 材料与方法
1.1 原料
杨梅核仁：新鲜杨梅汁渣分离，晒干后备用。
1.2 主要试剂
碱性蛋白酶；硫酸亚铁，硫代巴比妥酸，双氧
水，铁氰化钾，三氯乙酸，氯化铁，硫酸亚铁，水杨
酸，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，无水乙醚，无水乙
醇，甲醛等，均为分析纯。
1.3 试验仪器与设备
PHS-2C 型精密酸度计：上海精密科学仪器有限
公司；方型恒温数显水浴锅：国华电器有限公司；
TDL-5-A 台式离心机：上海安亭科学仪器厂；JDG 型
真空冷冻干燥机：兰州科技近真空冷冻干燥技术有限
公司；紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限
责任公司。
1.4 工艺流程
1.4.1 脱脂杨梅核仁粉工艺流程[9]
杨梅核仁→晒干→清理除杂→破碎过40目筛→加
入无水乙醚（料液比为1∶30（g/mL）），磁力搅拌
脱脂8 h→过滤→重复提取3次→合并滤液→真空旋转
*通讯作者；基金项目：宁波市科技计划项目（2012C10028）；宁波市
生态循环农业科技推广项目（2012-7）；浙江省重点科技创新团队项目
（2011R50030）；浙江省重大科技专项计划项目（2012C12005-1）
工艺技术
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蒸发滤液，回收乙醚→得到脱脂杨梅核仁粉末
1.4.2 杨梅核仁蛋白提取工艺流程[10]
称取脱脂杨梅核仁粉末2 g，按一定比例加入磷酸
氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，加碱性蛋白酶，在一定
温度、pH条件下浸提一定时间，浸提过程中维持pH
至恒定（±0.1），灭酶（使水解度小于7），4 000 r/
min离心15 min，收集上清液，然后等电点沉淀蛋白，
弃取上清液，用蒸馏水洗涤沉淀3~5次，冷冻浓缩干
燥，得到蛋白质提取物。
1.4.3 杨梅核仁多肽酶解工艺流程[11]
称料→加水高温蒸煮45 min→补水→调节pH→添
加酶制剂→升温到85 ℃灭酶10 min→4 000 r/min离心
15 min→得到上清液→测定·OH清除率
1.5 碱性蛋白酶水解杨梅核仁蛋白的工艺条件研究
1.5.1 碱性蛋白酶水解条件的试验
1) 时间对酶解效果的影响
起始pH 10、温度40 ℃、酶用量0.9%条件下连续
酶解，分别在时间为1 h，1.5 h，2 h，2.5 h，3 h时取
酶解液进行对·OH清除率测定[12]。
2) 反应起始pH对酶解效果的影响
温度40 ℃、酶用量0.9%，分别在起始pH 9，9.5，
10，10.5，11条件下酶解2 h，测定对·OH清除率。
3) 温度对酶解效果的影响
起始pH 10、酶用量0.9%，分别在温度20 ℃，
30 ℃，40 ℃，50 ℃，60 ℃条件下酶解2 h，测定
对·OH清除率。
4) 酶用量对酶解效果的影响
起始pH 10、温度40 ℃，分别在酶用量0.5%，
0.7%，0.9%，1.1%，1.3%条件下酶解2 h，测定
对·OH清除率。
1.5.2 正交试验
根据单因素试验的试验结果，用反应起始pH
（A）、酶用量（B）、水解温度℃（C）、水解时间
（D）作为试验因素，以对·OH清除率为指标对杨
梅核仁蛋白的碱性蛋白酶水解参数作了正交优化试验
L9(43)，试验设计见表1。
表1 正交试验因素表
水平 因素A 起始 pH B酶用量 /% C温度 /℃ D时间 /h
1 9 0.5 30 1
2 10 0.9 40 2
3 11 1.3 50 3
1.6 清除羟基自由基的测定[13-14]
利用H2O2与FeSO4混合产生·OH，在体系内加入
水杨酸，产生有色物质，在510 nm下有最大吸收。其
清除效率可根据式（1）进行计算。
清除率＝1-（Ax-Ax0）/A0×100％ （1）
式中：A0-空白对照液吸光度，即只加入硫酸亚
铁、水杨酸-乙醇和双氧水，不加酶解液的吸光度；
Ax-加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、双氧水和不同体积
的酶解液后的吸光度；Ax0-加入硫酸亚铁、水杨酸-
乙醇和不同体积的酶解液，不加双氧水引发反应的吸
光度，即本底吸光度，在计算中予以扣除。
1.7 水解度的测定
总氮的测定，微量凯式定氮法[15]；游离氨基氮的
测定，甲醛滴定法；水解度（DH）的测定，酶解液
中总游离氨基氮量和总氮量的百分比[16]。
2 结果与分析
2.1 单因素研究结果
2.1.1 起始pH对·OH清除率的影响
由图1可知，开始时·OH清除率随着pH的增大
而增大，pH为10时，清除率获得最大值46.08%，然
后·OH清除率随着pH的继续增大而下降。
图1 不同pH对·OH清除率的影响
2.1.2 酶解时间对·OH清除率的影响
由图2知，·OH清除率随着酶解时间的增加先
增大后减小，时间增加到2 h时，水解度获得最大值
46.08%。在一定的底物和酶用量情况下，蛋白酶从分
子外部逐渐水解蛋白质，水解为较小的肽段，以及更
小的氨基酸。而具有还原能力的蛋白质酶解物常具有
特定的氨基酸残基，水解进行时，具有强还原力的肽
段从蛋白质序列上水解下来，然后又接着被进一步水
解，从而丧失活性，因此，酶解液的还原力随着水解
时间呈现先升高后降低的趋势。
图2 不同时间对·OH清除率的影响
2.1.3 酶用量对·OH清除率的影响
由图3可知，在酶用量从0.5%增加到0.9%时，·OH
清除率逐步升高，在酶用量为0.9%时达到46.08%；
之后随着酶用量的增加，·OH清除率下降后趋于
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平稳。
图3 不同酶用量对·OH清除率的影响
2.1.4 温度对·OH清除率的影响
温度对碱性蛋白酶水解杨梅核仁蛋白的影响较
明显，由图4知，·OH清除率随着温度的增高迅速增
大，在温度为40 ℃时，·OH清除率最高46.08%，然
后随着温度的增高水解度迅速下降。
图4 不同温度对·OH清除率的影响
2.2 碱性蛋白酶水解杨梅核仁蛋白正交组合优化试验
结果
根据表2中计算的4因素极差的大小可以看出，
各因素对·OH清除率影响的主次顺序为：A＞D＞B
＞C，即起始pH＞时间＞酶用量＞温度。·OH清除
率最优组合为A2B3C1D2，即水解温度为30 ℃、酶用量
为1.3%、起始pH为10、时间2 h。在此条件下进行3
次验证试验，杨梅核仁蛋白酶解液的·OH清除率为
46.75%，高于正交试验中各试验值。测定在最优条件
下制备得到的杨梅核仁蛋白酶解液的水解度，其值为
42.36%。
表2 试验设计及结果表
试验号 A B C D ·OH清除率 /%
1 1 1 1 1 10.29
2 1 2 2 2 8.27
3 1 3 3 3 10.08
4 2 1 2 3 32.15
5 2 2 3 1 46.06
6 2 3 1 2 46.75
7 3 1 3 2 17.35
8 3 2 1 3 15.43
9 3 3 2 1 23.58
K1 9.547 19.930 24.157 26.643
K2 41.653 23.253 21.333 24.123
K3 18.787 26.803 24.497 19.220
R 32.106 6.873 3.164 7.423
3 结论
研究讨论了碱性蛋白酶水解杨梅核仁蛋白的重要
影响因子，并采用正交试验获得碱性蛋白酶水解杨梅
核仁蛋白的最优工艺条件为：40 ℃预热10 min，酶的
添加量为1.3%，酶解温度为30 ℃，起始pH为10，酶
解时间为2 h。在该酶解条件下杨梅核仁多肽的·OH
清除率达到46.75%。
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