全 文 ：酶法水解林蛙油蛋白质的工艺研究
李津明
k哈尔滨商业大学 药学院 o黑龙江 哈尔滨 txsswsl
≈摘要 目的 }林蛙油的蛋白质由体内消化转变为体外消化 o提高蛋白质利用率 ∀方法 }采取双酶水解技术对
林蛙油进行水解 ∀结果 }最佳工艺条件为 }底物含量 s1sux ª#ªp t o采用木瓜蛋白酶在 ³ z o温度 ys ε o酶含量
s1w h o酶解 v ∗ w «后 o再用胃蛋白酶水解 o³ u ∗ u1x o温度 ys ε o酶含量 s1v h o酶解时间 y ∗ { «∀结论 }水解液冻
干粉改善了林蛙油的溶解性和流动性 o为制作各种药物制剂提供了方便 ∀
≈关键词 林蛙油 ~酶法水解
≈中图分类号 u{v ≈文献标识码 ≈文章编号 tsst2xvsukussxlsy2swvs2sv
≈收稿日期 ussv2ts2uz
≈通讯作者 李津明 oר¯ }swxt2{w{v{usz o∞2°¤¬¯}¶∏±¬¬°¬
¼¨ ¤«1±¨ ·
林蛙油是中国雌性林蛙 Ραναε οραρια χηενδινερισ
⁄¤√¬§的干燥输卵管≈t o是我国东北特产的名贵中药
材 o具有补肾益精 !养阴润肺等功效 o有很高的药用 !
营养价值 ∀林蛙油的主要成分是蛋白质≈u ov o约占
ys h o而且氨基酸种类丰富 ∀蛋白质属于大分子物
质 o遇水膨胀后黏稠度很大 o不便于制备 !利用 ∀本
研究采用酶法水解蛋白质 o改善了林蛙油的溶解性
和流动性 ∀蛋白质被酶解后分解成低分子肽 o低分
子肽是由多个氨基酸分子聚合成的小分子物质 o比
蛋白质更易被人体快速和多途径吸收 ∀
酶法水解蛋白质较酸法水解作用温和且条件容
易控制 ∀用酶法水解林蛙油蛋白质尚无报道 ∀研究
证实 o酶解只作用于蛋白质 o温度较低 o其生物活性
成分雌二醇酶解前后的含量无明显变化 ∀
1 材料与设备
林蛙油干品k黑龙江省中药联营公司l o盐酸k齐
齐哈尔北大化学试剂厂l o胃蛋白酶k上海华舜生物
工程有限公司l o木瓜蛋白酶k上海华舜生物工程有
限公司l ∀vus p¶³计k梅特勒2托利多仪器有限公
司l o³× p tss分析天平k北京光学仪器厂l o电热套
k天津市斯特仪器有限公司l o≤ p ׳p u架盘物天
平k上海精科天平厂l o广泛试纸k哈市新春工厂l o电
热恒温水浴箱k上海医疗器械厂l o打浆机kuxs型l ∀
2 方法与结果
211 林蛙油干品的预处理
林蛙油吸水能力强 !膨胀系数大 o一般可膨胀
u ∗ ts倍 ∀将林蛙油干品去筋膜和杂质后 o放入蒸
馏水中浸泡 ty ∗ us «后取出 o加热至沸腾 o立即倒
入打浆机中打浆 ∀加热打浆的目的是使林蛙油蛋白
质空间结构受到快速破坏 o从而使肽链散开便于酶
解 ∀
212 酶解工艺条件的确定
21211 酶筛选
可供选择的酶较多 o从来源 !气味 !价格及水解
能力综合考虑 o选择 u种酶 }木瓜蛋白酶 !胃蛋白酶 ∀
21212 最适底物含量确定
底物含量k用原料和水的比例来表示l影响着酶
解反应速度和水解率 ∀根据习惯用量和林蛙油的有
效成分及水解液氨基氮的生成量 o最后确定底物含
量为 s1sux ª#ªpt o即林蛙油比水为 tΒws≈w ∀
21213 用单一酶进行水解
分别用木瓜蛋白酶 !胃蛋白酶在各自最佳条件
下对底物含量为 s1sux ª#ªpt的林蛙油进行水解 ∀
木瓜蛋白酶水解程度用水解液的流动性判断 o胃蛋
白酶水解程度以氨基氮的游出量为指标 o用甲醛定
氮法进行判断 ∀结果木瓜蛋白酶水解液流动性不
好 o仍呈乳白色 !棉絮样的稠厚体 ~胃蛋白酶水解液
测得游出氨基氮为 s1ut °ª#°pt ∀可见单一酶对
林蛙油水解不完全 !水解率低 o不宜采用 ∀因此采用
双酶水解林蛙油 o仍以氨基氮的游出量为指标 ∀
21214 双酶水解条件的确定
用正交试验法确定双酶水解工艺 o分 u步加酶 ∀
第 t步加木瓜蛋白酶的正交试验在此不列出 o结果
确定了木瓜蛋白酶的水解最佳条件是 ³ z o温度 ys
#svw#
第 vs卷第 y期
ussx年 v月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vs o¶¶∏¨ y
¤µ¦«oussx
ε o酶含量 s1w h o时间 w «∀
2121411 第 u步加混合酶的水解条件 在第 t步
制得的水解液中加混合酶k即木瓜蛋白酶 !胃蛋白酶
按一定量混和加入l在适宜条件下水解 ∀
首先在 ³ z的条件下进行酶解反应 o考察酶用
量 !反应时间及交互作用对氨基氮生成量的影响 o建
立 uzkvtvl正交表进行试验 ∀见表 t ou ov ∀
表 t uzkvtvl正交试验因素水平
水平
Α
木瓜蛋白酶量
r h
Β
胃蛋白酶量
r h
Χ
u次酶解时间
r«
t
u
v
s1u
s1v
s1w
s1u
s1v
s1w
v
w
x
表 u uzkvtvl正交试验结果
²q 氨基氮含量r°ª#°pt ²q 氨基氮含量r°ª#°pt
t s1u{s tx s1vsu
u s1u{z ty s1vsx
v s1u|s tz s1vts
w s1u{x t{ s1vtt
x s1u{z t| s1u|t
y s1u|z us s1u||
z s1u|v ut s1vsw
{ s1u|{ uu s1vsw
| s1vsv uv s1vsu
ts s1u|t uw s1vsw
tt s1u|z ux s1u||
tu s1vst uy s1vsz
tv s1u|z uz s1vtv
tw s1u|y
表 v uzkvtvl方差分析
方差来源 离差平方和 自由度 均方 Φ Π
Α z1s ≅ tsp w u v1xs ≅ tsp w zw s1st
Β x1yt ≅ tsp w u u1{t ≅ tsp w ys s1st
Α≅ Β w1xs ≅ tsp x w t1tv ≅ tsp x u1w
Χ v1xy ≅ tsp w u t1z{ ≅ tsp w v{ s1st
Α≅ Χ t1zs ≅ tsp x w w1uy ≅ tsp x s1|
Β ≅ Χ x1xx ≅ tsp x w t1v| ≅ tsp x v
误差 v1zx ≅ tsp x { w1y{ ≅ tsp y
注 }Φs1stku o{l {1yx ~Φs1sxku o{l w1wy ~Φs1stkw o{l z1st ~Φs1sx
kw o{l v1{w
由方差分析表可知≈x oΑ, Β , Χ的影响是显著
的 o最佳工艺条件为 Αv Βv Χv o即木瓜蛋白酶用量为
s1w h o胃蛋白酶用量为 s1w h o酶解时间为 x «∀
考虑胃蛋白酶最适酶解 ³ u ∗ u1x o将酶解时间
延长 o考察 Αku次酶解时间l !Βk胃蛋白酶用量l !Χ
k木瓜蛋白酶用量l !∆k³lw种因素对 u次酶解时
间的影响 o采用了 {kw ≅ uwl正交设计进行试验 ∀见
表 w ox oy ∀
表 w {kw ≅ uwl正交试验因素水平
水平
Α
u次酶解时间
r«
Β
胃蛋白酶用量
r h
Χ
木瓜蛋白酶用量
r h
∆
³
t w s1v s1v u
u x s1w s1w u1x
v y
w z
表 x {kw ≅ uwl正交试验结果
²q 氨基氮含量r°ª#°pt ²q 氨基氮含量r°ª#°pt
t s1vss x s1vsu
u s1u|x y s1u|s
v s1u{y z s1u{{
w s1vsu { s1vsy
表 y {kw ≅ uwl方差分析
方差来源 离差平方和 自由度 均方 Φ Π
Α t1ww ≅ tsp x v w1{ ≅ tsp y s1w{
Β v1yt ≅ tsp x t v1yt ≅ tsp x v1yt
Χ v1tv ≅ tsp y t v1tv ≅ tsp y s1vtv
∆ v1ux ≅ tsp w t v1ux ≅ tsp w vu1x
误差 t1s ≅ tsp x t t1s ≅ tsp x
注 }Φs1stkv otl x wss ~Φs1sxkv otl uty ~Φs1stkt otl w xss ~Φs1sx
kt otl tyt
由方差分析表 y可以看出 Α, Β , Χ的影响不显
著 o但从级差的大小顺序 ∆ Β Α Χ∀
为主要
影响因素 oΑ其次 o因此最佳方案 Αu Βu Χu ∆t 或
Αw Βu Χt ∆t o即 u次酶解时间 z «o木瓜蛋白酶用量
s1v h或 s1w h o胃蛋白酶用量为 s1w h o³ u ∀
由上述第 u步加混合酶的试验可知 ou种 ³对
氨基氮含量的影响不大 o只有木瓜蛋白酶和胃蛋白
酶用量对氨基氮生成量有显著影响 o见表 z ∀
表 z u种 ³下氨基氮含量比较
³ 木瓜蛋白酶量r h
胃蛋白酶量
r h
u次酶解
时间r«
含量
r°ª#°pt
z
u
s1v
s1v或 s1w
s1w
s1w
x
z
s1vtv
s1vsy
2121412 第 u步加单一酶水解条件确定 考虑到
生产成本和生产中易操作等原因 o并与混和酶做对
比 o因此第 u步选择只加胃蛋白酶 o设计了 tuky ≅
uul正交试验 o见表 { o| ots ∀
#tvw#
第 vs卷第 y期
ussx年 v月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯1vs o¶¶∏¨ y
¤µ¦«oussx
表 { tuky ≅ uul因素水平
水平
Α
二次酶水解时间
r«
Β
胃蛋白酶用量
r h
t v s1v
u w s1w
v x
w y
x z
y {
表 | tuky ≅ uul正交试验结果
²q 氨基氮含量r°ª#°pt ²q 氨基氮含量r°ª#°pt
t s1uz{ z s1uzw
u s1u{z { s1vsx
v s1u|y | s1u{z
w s1u{t ts s1vsu
x s1u|y tt s1vtu
y s1uzs tu s1u|y
表 ts tuky ≅ uul正交分析
方差来源 离差平方和 自由度 均方 Φ Π
Α t1yz ≅ tsp v x v1vw ≅ tsp w t stu s1sx
Β t1y ≅ tsp w t t1y ≅ tsp w w{x s1sx
误差 v1v ≅ tsp z t v1v ≅ tsp z
注 }Φs1sxkx otl uvs ~Φs1stkx otl x zys ~Φs1stkt otl w sxs
由方差分析表 ts可以看出 oΑ, Β的影响是显
著的 o因此最佳工艺条件是 Αy Βu ∀实际生产过程中
采用 Αy Βt即可 o即酶解时间为 { «o胃蛋白酶的用
量为 s1v h ∀
与第 u步加混合酶相比 o第 u步只加胃蛋白酶
时 o氨基氮的生成量相差不大 o只是加单一酶的水解
液的黏度稍大一些 o但加单一酶成本比加混合酶低
得多 o且在生产过程中容易控制 ∀综合多方面的因
素 o在实际生产时 o采用第 u步加单一酶即可 ∀
3 林蛙油活性成分雌二醇酶解前后含量比较
采用放射免疫法对林蛙油的主要活性成分雌二
醇酶解前后的含量进行了测定 o结果酶只作用于蛋
白质 o对林蛙油的主要活性成分雌二醇几乎没有影
响 ∀见表 tt ∀
表 tt 林蛙油酶解前后雌二醇含量比较 °ª#°pt
样品 水解前 水解后
t yvz1wuw u yvy1vus t
u xyz1zty s xyx1{sw |
v x|{1ysv { x{|1x|{ |
w yst1uw{ s ysv1uv| s
x x{|1wzs x x{|1wx| x
y ytv1vzx y ytt1u{u t
4 结论
在底物含量为 s1sux ª#ªpt时 o用木瓜蛋白酶和
胃蛋白酶双酶水解 o并分两步水解 o根据正交试验确
定双酶水解林蛙油的最佳工艺条件 }
第 t步 }加木瓜蛋白酶 o用量为 s1w h o温度 ys
ε o³ z o酶解时间 v ∗ w «∀
第 u步 }加胃蛋白酶 o用量为 s1v h o温度 ys ε o
³ u ∗ u1x o酶解时间 y ∗ { «∀
根据最佳酶解条件制得的酶解液异味明显减
少 o水解液色泽良好 o为淡黄色 o流动性较好 o较黏
稠 ~氨基氮生成量较高 !水解率较好 ∀利用双酶k木
瓜蛋白酶和胃蛋白酶l水解的林蛙油 o大部分蛋白质
转化为氨基酸能更好地被人体利用吸收 ∀
≈参考文献
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品科学 oussu ouvkvl }xt q
Τηε στυδψ ον τηετρεατµεντ οφ Οϖιδυχτσ Ραναε προτειν ωιτη ενζψµε ηψδρολψσισ
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( Ηαρβιν Βυσινεσσ Υνιϖερσιτψ, Ηαρβιν txssws , Χηινα)
[ Αβστραχτ] ׫¨ ³¤³¨µ¬±·µ²§∏¦¨§¤³µ²¦¨¶¶·² ±¨«¤±¦¨ ·«¨ ¼¬¨ §¯²© √¬§∏¦·¶¤±¤¨ ³µ²·¨¬± ∏¶¬±ª¬± √¬·µ² ±¨½¼°¨«¼§µ²¯¼¶¬¶q׫¨ ·µ¨¤·2
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³¤³¤¬±~¤±§kul ©²¯ ²¯º §¨ º¬·«¤y ∗ { ««¼§µ²¯¼¶¬¶o¤·³ u ∗ u qx ¤±§ys ε o∏¶¬±ªv h ²©³¨ ³¶¬±q׫¬¶·µ¨¤·° ±¨·³µ²¦¨¶¶¶¬ª±¬©¬¦¤±·¯¼¬°2
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