全 文 ：研究 报 告
高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定
草石蚕根茎中的水苏糖
尹俊发1　杨更亮＊1, 2　李志伟1　刘海燕1　范子琳1　陈　义2
1(河北大学化学与环境科学学院 , 保定 071002)　　2(中国科学院化学研究所分子科学中心 ,北京 100080)
摘　要　应用高效液相色谱-蒸发光散射检测法建立了测定草石蚕植物根茎中水苏糖含量的新方法 , 并设计
和讨论了 2 种从草石蚕根茎干粉中提取水苏糖的工艺方法。采用 Bondapak NH2 色谱柱(300 mm×3.9 mm
i.d.),流动相为甲醇-水(80∶20 , V V),流速 1.0 mL min ,柱温为室温;蒸发光散射检测器漂移管温度 40℃, 载气
N2 流速 4.0 L min。在上述条件下测得水苏糖在 1.02～ 12.22 μg范围内线性关系良好(r=0.9995), 检出限达
到0.10 μg ,平均加样回收率为 91.6%。 2 种不同提取方法的测定结果:水苏糖含量分别为 29.8%和 25.2%,
纯度为 63.76%和 88.35%。该方法简便快捷 , 重现性和准确度良好 , 结果准确可靠 ,为实际样品的测定提供
了科学依据。
关键词　高效液相色谱 ,蒸发光散射检测器 , 水苏糖 ,草石蚕
　2003-01-13收稿;2003-07-04接受
本文系国家自然科学基金(No.200705005, 20375010)、河北省科技厅基金(No.02245501-D)和河北省自然科学基金(No.200077 , 202096)资
助项目
1　引　　言
草石蚕(Stachys sieboldii miq.),别名甘露子 ,唇形科水苏属能形成地下块茎的一年生草本植物 ,既可
作为佐餐佳肴 ,又可作为中药 ,有活血祛风 、散瘀止痛 、促进消化以及解毒等功效 。由于其匍匐块茎有条
状及螺旋塔状 2种形状 ,故此民间又称作银白条和宝塔菜等 。草石蚕的根茎中含有大量的水苏糖
(stachyose)。水苏糖是由半乳二糖 、葡萄糖 、果糖 4个单糖组成的功能性低聚糖 ,具有促进肠道内双歧杆
菌增殖 ,调节肠道微生态平衡 ,降低肝脏和血内毒素 ,抑制致癌物质的生成等功能[ 1 ,2] 。由于水苏糖紫外
吸收波长在190 nm 附近 ,在应用高效液相色谱结合 UV检测器分析时干扰较大 ,灵敏度差 ,难以获得理
想的检测条件。有人借助示差折光检测器对水苏糖进行了检测[ 2] ,但是这种方法受温度等外界因素影
响较大 ,而且分析灵敏度较低。蒸发光散射检测器(ELSD)是一种质量检测器[ 3] ,基于不挥发的样品颗
粒对光的散射程度与其质量成正比而进行检测 ,对没有紫外吸收 、荧光或者电活性的物质以及产生末端
紫外吸收的物质均能产生响应 。以高效液相色谱-蒸发光散射检测法建立了测定条状草石蚕(银白条)
根茎中水苏糖含量的新方法 ,并对两种提取工艺进行了比较 。
2　实验部分
2.1　仪器和试剂
PU1580型高效液相色谱仪(日本 JASCO 公司);SEDEX 75型 ELSD仪(法国 SEDERE公司);HW2000
系统色谱工作站(南京千谱软件公司);水苏糖对照品(3次纯化品 ,纯度>98.5%);草石蚕(银白条)根
茎干粉采自河北省清苑县 ,晾干粉碎;D900阴离子交换树脂和 D152阳离子交换树脂(沧州宝恩化工有
限公司);甲醇为色谱纯 ,水为 Millipore 制备的超纯水;所有溶剂和样品溶液均用 0.45 μm 微孔滤膜过
滤;其它试剂均为分析纯 。
2.2　色谱条件和 ELSD检测器参数
色谱条件:色谱柱 ,Bondapak NH2柱(300 mm×3.9 mm i.d., 5μm)(美国Waters公司);流动相为甲
第 31卷
2003 年 12 月　　　 　　　 　　　
分析化学(FENXI HUAXUE)　研究报告
Chinese Journal of Analytical Chemistry
　　 　　　　　　 　　 第 12 期
1409～ 1412
醇-水(80∶20 , V V);流速1.0 mL min;柱温 ,室温。死时间由 0.5 g L的NaCl溶液测定。
ELSD检测器参数:漂移管温度40℃;载气流速 4.0 L min。
2.3　水苏糖提取工艺
参考多糖提取工艺的有关报道[ 4 , 5] ,设计了从草石蚕根茎干粉中提取水苏糖的两种工艺路线:(1)称
取样品干粉5.0 g ,用50 mL甲醇搅拌下回流2 h ,过滤 ,残渣用50 mL 1%的Na2CO3 溶液60℃水浴提取两
次 ,每次 4 h ,合并碱水提取液 ,滴加适量三氟乙酸静置过夜 ,离心除去沉淀 ,得到提取液 1 ,备用 。;(2)称
取样品干粉5.0 g ,用 50 mL 2%的 Ca(OH)2 溶液 60℃水浴提取两次 ,每次 4 h ,合并碱水提取液 ,用适量
草酸中和 ,离心除去沉淀 ,先后过活性炭柱 、D900阴离子交换树脂柱和 D152阳离子交换树脂柱 ,收集洗
脱液 ,得到提取液 2 ,备用 。
2.4　溶液的配制
2.4.1　水苏糖对照品溶液的配制　精密称取水苏糖对照品 50 mg ,置于 25 mL容量瓶中 ,纯水稀释至刻
度 ,定容。取该溶液 0.5 、1.0 、2.0 、3.0 、4.0 、5.0和 6.0 mL分别置于 10 mL 容量瓶中 ,纯水稀释至刻度 ,
定容 ,作为对照品溶液。
2.4.2　供试样品溶液的制备　准确量取两种提取工艺得到的提取液 1和 2各 2.5 mL ,分别置入 50 mL
容量瓶中 ,纯水稀释至刻度 ,摇匀 ,定容 ,过滤 ,作为供试品溶液A和供试溶液 B。
3　结果与讨论
3.1　流动相的选择
考察不同比例的甲醇水溶液(100 、90 、80 、70和 60%)作为流动相的情况 ,发现在上述条件下 ,水苏
糖都能很好地与其他组分分离 。但是 ,随着水的含量增加 ,水苏糖的容量因子逐渐减小(见图 1),峰形
变得尖锐;与此同时 ,水的比例增加 ,流动相在漂移管内不易汽化完全 ,使得基线噪声增大 ,升高本底 ,从
而导致分析灵敏度的降低 。另外 ,在本实验中用乙腈代替甲醇配成流动相 ,具有相似的色谱行为和测定
结果 。综合考虑分离效果 、分离时间以及经济因素 ,选择甲醇-水(80∶20 , V/ V)的体系作为流动相。
3.2　ELSD参数的选定
漂移管温度和载气流速是 ELSD检测器的两个重要参数[ 6] 。本实验使用的是 SEDEX 75型 ELSD检
测器 ,对雾化器和漂移管进行了改良 ,使流动相可以在较低温度下蒸发 ,产生大小均匀的液滴 ,提高检测
灵敏度。为保证蒸发后的色谱流出物能够均匀的进入光池 ,避免大量微滴导致噪声升高 ,要求载气流速
　图 1　流动相中水的含量与水苏糖容量因子 k′关系曲
线
Fig.1　The effect of the content of water in the mobile phase
on the capacity factor(k′)
应大且稳定。故选用漂移管温度 40℃,载气 N2 流速
4.0 L min。
3.3　两种提取工艺的比较
由测定结果分析 ,提取工艺(1)测得样品中水苏
糖的含量高于提取工艺(2),更接近真实情况 ,而提
取工艺(2)得到的水苏糖提取液纯度高于提取工艺
(1)(见表 2)。这是因为在提取工艺(1)中 ,是通过甲
醇回流 、加三氟乙酸促沉来除去鞣质 、色素以及蛋白
和脂溶性杂质 ,水苏糖的损失较小;而提取工艺(2)
中 ,提取液经过活性炭柱 、D900 阴离子树脂柱和
D152阳离子树脂柱时造成较大损失 ,尤其在活性炭
脱色过程中 ,活性炭用量 、温度 、柱长及流速等对结
果都有较大影响 。但就产品纯化的效果而言 ,后者
明显优于前者。
综合考虑认为 ,提取工艺(2)对于制备纯度较高
的水苏糖产品有重要意义 ,提取工艺(1)因为更能反映样品的真实情况 ,适合本实验中草石蚕样品中水
苏糖含量的分析 ,故此采用提取工艺(1)制备的供试样品溶液进行分析 。
1410　　 分 析 化 学 第 31卷
3.4　线性关系和检出限考察
3.4.1　回归方程和线性范围　将系列浓度的各标准溶液10μL 进样分析 ,以测得的峰面积(A ,mV·s)的
对数值 lgA对浓度(C , g L)的对数值 lgC 进行线性回归实验 ,得到线性方程:lgA=0.9973 lgC+6.525 ,
r=0.9995。结果表明:水苏糖在进样量 1.01 ～ 12.10μg 范围内线性关系良好。
3.4.2　检出限　以系列浓度的标准溶液进样分析 ,测得水苏糖的检出限为 0.10 μg(S N=3)。
3.5　精密度和重现性实验
吸取 0.4 g L 的水苏糖对照品溶液 10 μL ,重复进样5次 ,以测得的峰面积(A ,mV·s)为指标 , RSD为
0.94%(n=5)。取供试样品 5份 ,每份 5.0 g ,按照提取工艺(1)和供试样品溶液制备项下处理 ,在本文
色谱条件下各进样 10μL ,以测得的峰面积(A ,mV.s)为指标 , RSD为 1.34%。
3.6　加样回收率实验
取已知含量的样品粉末 1.0 g ,定量加入水苏糖对照品 ,按照提取工艺(1)和供试样品溶液的配制方
法制得溶液 ,进样测定并计算 ,结果列于表 1。
表 1　水苏糖加样回收率实验结果(n =5)
Table 1　Recoveries of stachyose(n=5)
编号
No. 基准量Background(mg) 加入量Added(mg) 检出量Obtained(mg) 回收率Recovery (%) 平均值Average (%) 相对标准偏差RSD(%)
1 298.0 238.4 523.5 94.5 91.6 1.43
2 298.0 268.2 547.8 93.1
3 298.0 298.0 568.6 90.8
4 298.0 327.8 590.2 89.1
5 298.0 357.6 622.3 90.7
3.7　样品含量测定
吸取供试样品溶液 10 μL ,在上述色谱条件下
进样 ,平行 3次。将测得的峰面积(A)代入线性回
归方程 ,计算水苏糖含量 ,测定结果见表 2。
在本文色谱条件下 ,水苏糖与样品中其他组分
能够在10 min 以内有效分离 ,且峰形较好。水苏
糖对照品溶液 、不同提取方法制备的供试样品溶液
A和 B的色谱图参见图 2。
表 2　样品中水苏糖含量的测定结果(n=3)
Table 2　Content of stachyose in samples(n=3)
供试样品溶液
Samples
水苏糖含量
Content of stachyose(%)
纯度
Puri ty(%)
A 29.8 63.76
B 25.2 88.35
图 2　水苏糖对照品(a)、供试样品溶液 A(b)及 B(c)的色谱图
Fig.2　Chromatograms of stachyose(a), sample A(b)and sample B(c)
4　结　　论
绝大多数糖类化合物在紫外和可见区范围内没有吸收或只有末端吸收 ,用高效液相色谱仪检测时
噪声大 ,干扰严重 ,难以获得理想的检测条件。对于在 190 nm 附近有紫外吸收的水苏糖 ,采用 HPLC-
ELSD检测法测定可以弥补上述不足。与前人建立的方法相比较 ,本方法无需对待测组分进行衍生化 ,
1411第 12期 尹俊发等:高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定草石蚕根茎中的水苏糖 　　
克服了示差折光检测法(RI)灵敏度差 、受外界环境因素影响大的缺点 ,提高了分辨率和分离速度 ,重现
性和准确度良好 ,操作也相对简单易行 ,更适合于各种含有水苏糖的实际样品的检测 。
References
1　Li Yinghui(李迎慧), Liu Hengchuan(刘衡川), Yu Qian(余　倩), Lin Yiling(林怡伶).Chinese Journal of Microecology(中国
微生态学杂志), 2001 , 13(3):138 ～ 139
2　Gong Tao(龚　韬), Li Guanghui(李光慧), Luo Yanyan(罗燕燕), Suo Jianzheng(索建政), Li Hong(李　虹).China J.
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Determination of Stachyose in Stachys Sieboldii Miq.by
High Performance Liquid Chromatography with
Evaporative Light Scattering Detection
Yin Junfa1 , Yang Gengliang＊1 ,2 , Li Zhiwei1 , Liu Haiyan1 , Fan Zilin1 , Chen Yi2
1(College of Chemistry and Environmental Science , Baoding 071002)
2(Center for Molecular Science , Institute of Chemistry , Chinese Academy of Science , Beijing 100080)
Abstract　A method for the determination of stachyose in Stachys sieboldii miq.by high performance liquid
chromatography (HPLC)with evaporative light scattering detection (ELSD)was established.Two different
extraction crafts were designed and compared.Stachyose was successfully separated on a Bondapak NH2 column
(300 mm×3.9 mm i.d.)at ambient temperature , the mobile phase composition was a binary solvent mixture of
methanol-water (80∶20 , V V).The flow rate was 1.0 mL min.The parameters of ELSD were set as follows:drift
tube temperature was 40 ℃, nitrogen carrier gas flow was 4.0 L min.This method fulfilled all the standard
requirements of linearity , accuracy and precision.The linear range was 1.02 ～ 12.22 μg(r =0.9995).The
detection limit was 0.10 μg and the average recovery was 91.6%(RSD=1.43%).The contents of stachyose by
two different extraction crafts were 29.8%and 25.2%, the purity were 63.76% and 88.35% , respectively.This
method was accurate , rapid , simple and reproducible , and suitable for the integrated analysis of stachyose.
Keywords　High performance liquid chromatography , evaporative light scattering detection , stachyose , Stachys
sieboldii miq.
(Received 13 January 2003;accepted 14 July 2003)
1412　　 分 析 化 学 第 31卷