全 文 ：鸡肝散药效成分木犀草素在大鼠体内的药代动力学
应景艳 , 麻佳蕾 , 夏宗玲 , 姚彤炜＊
(浙江大学 药学院 , 浙江 杭州 310058)
摘要:建立 RP-HPLC法测定大鼠灌胃鸡肝散提取物后血浆中木犀草素的含量 , 并研究木犀草素在大鼠体内的
药代动力学行为。大鼠灌胃鸡肝散提取物后 ,血浆样品经三氯乙酸沉淀蛋白 , 用 RP-HPLC法测定。血浆中木犀草素
的线性范围为 0.37 ～ 47.27 μg· mL-1;定量限为 0.37μg· mL-1;方法回收率 93% ～ 99%,提取回收率 75% ～ 85%,
日内及日间精密度均小于 5%。鸡肝散提取物在大鼠体内的药代动力学行为符合开放二室模型。经大鼠性别和测
定时间两因素方差分析 ,提示不同性别的大鼠的血药浓度具有显著性差异。 通过质谱法鉴定了血浆中代谢物为葡
糖醛酸结合物。建立的大鼠血浆中木犀草素的含量测定方法具有灵敏 、准确 , 专属性强等特点 , 可用于鸡肝散药效
成分木犀草素的体内药代动力学研究。
关键词:高效液相色谱;鸡肝散提取物;木犀草素;药代动力学
中图分类号:R969　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513-4870(2008)05-0523-05
收稿日期:2007-11-13.
基金项目:浙江省科技厅重大科技攻关项目(2005C13026);浙
江省科技厅基金资助项目(2004C33009).
＊通讯作者　Tel/ Fax:86-571-88208406,
E-mail:yaotw@zju.edu.cn
PharmacokineticsofluteolinfromElsholtziablandaextractsinrats
YINGJing-yan, MAJia-lei, XIAZong-ling, YAOTong-wei＊
(ColegeofPharmaceuticalSciences, ZhejiangUniversity, Hangzhou310058 , China)
Abstract:AnRP-HPLCmethodfordeterminationofluteolinfromElsholtziablandaBenth.extracts
inrats plasmawasestablishedandthepharmacokineticsofluteolininratswasstudied.Drugblood
samplesfromcaudalveinweregotenafteroraladministrationofluteolin.Plasmasamplesweredetermined
byRP-HPLCafterbeingdeproteinizedwithtrichloroaceticacidandextractedwithethylacetate.The
calibrationcurvewaslinearintherangeof0.37-47.27 μg· mL-1.Thelimitofquantificationwas0.37
μg·mL-1.Themethodrecoveryofluteolinwas93% -99%.Theextractrecoverywas75% ～ 85%.
RSDsofintra-andinter-dayprecisionswerelessthan5%.Theconcentration-timecurveofluteolinafter
oraladministrationofElsholtziablandaBenth.extractswasfitedtotwocompartmentopenmodel.Two
factorsanalysisofvariancewereadoptedintheevaluationofgenderandtimespotsforcolectionofblood.
Theresultsuggestedthatthegender-baseddiferenceinblood-drugconcentrationshadstatistical
significance.Themetaboliteinbloodwasidentifiedasgalcuronide.Themethodissensitive, specific,
accurate, andisappropriatefordeterminationofluteolininvivo.
Keywords:HPLC;Elsholtziablandaextracts;luteolin;pharmacokinetics
　　鸡肝散为双子叶植物药 , 唇形科香薷属植物四
方蒿 [ Elsholtziablanda(Benth.)Benth.]的全草 ,
又名四方蒿 、滇香薷 、四棱蒿等。其叶 、花或全草
均可入药 , 用于治疗急慢性肾盂肾炎等病症。
鸡肝散化学成分复杂多样 , 提取分离后 , 根据
理化性质和光谱分析 , 确定这些化合物为木犀草
素 、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷 、木犀草素-5-O-β-D-
葡糖苷 、 5-羟基 -7, 8-二甲氧基黄酮和 5-羟基 -6, 7-二
甲氧基黄酮等 [ 1 ～ 3] 。
研究[ 4] 表明大鼠灌胃木犀草素 (50 μmol·
kg-1)丙二醇溶液后 30 min,木犀草素总浓度达到峰
·523·药学学报 ActaPharmaceuticaSinica2008, 43(5):523-527
DOI :10.16438/j.0513-4870.2008.05.001
值 ,并于 6h达到另一峰值 。然而对于鸡肝散提取
物中药效成分的药代动力学研究则未见报道。本文
建立了大鼠血浆中鸡肝散活性成分———木犀草素的
含量测定方法 ,并对其在大鼠体内的药代动力学进
行了研究。
材料与方法
仪器与试剂　Agilent1100高效液相色谱仪(包
括 G1311A脱气器 、 G1311A四元泵 、 G1329A自动
进样器 、 G1330B自动进样温控器 、 G1316A柱温
箱 、G1314AVWD检测器 、 G1315B二极管阵列检测
器 、 HPChemStations数据处理软件 , 安捷伦科技有
限公司);木犀草素对照品(中国药品生物制品检定
所 , 111520-200201);葡糖醛酸酶(β-glucuronidase,
Sigma, G0501);硫酸酯酶(sulfatasesolution, Sigma,
S9751)。鸡肝散提取物(浙江大学药学院中药与天
然药物化学研究室提供)。
动物　健康 SD大鼠 , 雌雄不限 , 体重(200±
10)g(浙江大学动物中心提供)。
色谱条件　色谱柱:DiamonsilC18色谱柱 (200
mm×4.6mmID, 5μm,迪马公司);流动相:乙腈 -磷
酸二氢钾溶液(pH2.0, 0.01 mol· L-1), 0※10※
15※25※30 min, 乙腈分别为 20%※25%※30%※
40%※40%线性变化;流速:1.0 mL·min-1;检测
波长:350 nm;柱温:25 ℃;进样量 20 μL。
溶液配置　取木犀草素 10 mg, 精密称定 , 置
于 10mL量瓶中 , 加甲醇溶解 , 即得质量浓度为 1
mg·mL-1储备液 。
称取 CMC-Na0.5 g, 溶于沸水 100 mL中 , 配
成 0.5%的溶液 。精密称取鸡肝散提取物适量 , 加
入上述配制 0.5% CMC-Na溶液 , 涡旋混匀 , 制成
质量浓度为 20 mg· mL-1的鸡肝散提取物混悬液 ,
大鼠灌胃剂量 180 mg·kg-1。
给药方案与血样采集　大鼠禁食 8 h, 尾静脉
取血 0.2 mL作为零时间点 。再灌胃给予鸡肝散提
取物(180mg·kg-1)CMC-Na混悬液 , 并于给药后
10 min、 20min、 30 min、 40min、 50min、 1 h、 2h、
3 h、 4 h、 5 h、 6 h、 7 h和 8 h尾静脉取血 (0.2
mL)。将各时间点的血分别置于涂有肝素的 dof管
中 , 4 000 r· min-1离心 5 min, 取上清液 , -20℃
储存。
血浆样品的处理与测定　取 -20 ℃储存的血
浆样品 , 水冲淋使其快速解冻 , 精密吸取 100 μL,
加入 10mol· L-1盐酸 100 μL, 置于 80℃水浴加热
2h进行酸水解 , 取出冷却后 , 加入 10%三氯乙酸
50μL涡旋混合 。再精密加入乙酸乙酯 2 mL, 涡旋
5min, 10 000r· min-1离心 10 min, 精密吸取上清
液 1 mL, 真空下抽干溶剂 , 用甲醇 -0.01 mol·L-1
磷酸二氢钾溶液 (pH 2.0, 1 ∶1)100 μL复溶 ,
13 000 r· min-1离心 10 min, 取 20 μL, 按上述色
谱条件进行 HPLC测定 。
木犀草素代谢产物色谱峰确证
酶法鉴定　取灌胃后 1 h的血浆样品 100 μL
2份 , 分别加入 6 kU· mL-1葡糖醛酸酶溶液或 500
U·mL-1硫酸酯酶溶液各 10 μL, 于 37 ℃孵育 20
min, 其后按 “血浆样品的处理与测定 ”项下 , 自 “加
入 10%三氯乙酸 ”起 , 同法操作 , 进样测定 。
质谱法鉴定　色谱条件:DiamonsilC18色谱柱
(200mm×4.6mmID, 5μm, 迪马公司);流动相:
乙腈 -pH2.3醋酸水溶液(35∶65)等度洗脱;流速:
0.3mL·min-1;检测波长:350nm;进样量 10μL。
质谱条件　扫描方式为负离子扫描(ESI, m/z
200 ～ 700), 毛细管电压 3.69 kV, 锥孔电压 50 V,
离子桥电压 0.1 V, 离子源温度 60℃, 脱溶剂气温
度 350℃。一级质谱的低端分辨率 15.1, 高端分辨
率为 15.2, 离子能量为 0.9。
数据处理　应用 3P87药代动力学软件(由中
国药理学会数学药理委员会编制),对药时曲线进
行房室模型拟合 ,求出药代动力学参数 。根据大鼠
性别和测定时间这两因素重复测定资料的方差分
析 ,对血药浓度时间数据进行统计分析 。
结果
1　方法的专属性
在建立的色谱条件下 , 木犀草素与血浆中的内
源性杂质有较好的分离度 , 杂质及代谢产物不干扰
样品峰 , 基线噪音小 , 木犀草素的保留时间约为 22
min。血浆色谱图见图 1。
2　血浆中木犀草素的线性范围和检测灵敏度
取空白大鼠血浆 100μL, 加入木犀草素对照品
甲醇溶液 10 μL, 配成质量浓度分别为 0.37、 1.48、
2.95、 5.91、 11.82和 47.27 μg· mL-1的系列对照
品溶液 , 按 “血浆样品的处理”项下操作。测得血浆
中木犀草素在 0.37 ～ 47.27 μg· mL-1有良好的线
性关系。以血浆中木犀草素对照品浓度(C)对相应
的峰面积(A)进行线性回归 ,采用加权最小二乘法 ,
得回归方程:A=36.77C+0.17(r=1)。采用逐步
稀释法 , 测得定量限为 0.37 μg·mL-1(S/N=10,
·524· 药学学报 ActaPharmaceuticaSinica2008, 43(5):523-527
Figure1　HPLCchromatogramsoftheplasma.A:Blankplasma;B:5.91 μg· mL-1 controlsample;C:
Untreatedplasmasampleafteroraladministrationfor1 h;D:Acidtreatedplasmasampleafteroraladministration
for1h;E:ElsholtziablandaBenth.extractmethanol-water(1∶1)solution;1:Luteolin;2:Luteolinglycoside;
3:Metabolite
RSD=3.93%, n=5);检测限为 0.16 μg· mL-1
(S/N=3, n=3)。
3　血浆中木犀草素回收率及精密度试验
用空白血浆配制低 、 中 、 高 (0.74, 5.91和
23.64 μg· mL-1 )3个浓度的质量控制样品各 5
份 , 按 “血浆样品的处理与测定”项下操作。测定所
得木犀草素峰面积与同样量木犀草素对照品溶液直
接进样所得峰面积进行比较 , 计算提取回收率;平
行测定 5份 , 记录木犀草素的峰面积 , 所得信号值
代入标准曲线的回归方程 , 求得测定浓度 , 与理论
值比较 , 计算方法回收率;平行测定 5份 , 连续测
定 5 d, 计算日内 、日间精密度 RSD。结果见表 1。
Table1　Recoveryandprecisionofluteolininrats
plasma(n=5, x±s)
Concentration
/μg· mL-1
Method
recovery/%
Extract
recovery/%
Intra-day
RSD/%
Inter-day
RSD/%
0.74 93.57±2.10 77.34±2.34 2.56 3.97
5.91 98.89±5.00 80.39±4.09 4.63 4.33
23.64 98.39±4.72 84.33±3.77 3.17 4.51
4　稳定性试验
取低 、中 、高(0.74, 5.91和 23.64μg·mL-1)
3个浓度的质量控制样品分别进行室温 0、 2、 4、 8、
12和 24h, 反复冻融 2次和 4次 , -20℃冻贮 1周
和 2周的稳定性实验 。结果样品测定的标准偏差均
小于 5%, 稳定性良好。
5　大鼠体内药代动力学试验
健康雄性 、雌性 SD大鼠各 6只 , 给药后不同
时间点采血 , 绘制各时间点平均药时曲线(图 2),
药代动力学参数见表 2。结果显示 , 药时曲线符合
开放二室模型 , 权重系数为 1 /C2。
Figure2　Meanplasmaconcentration-timeprofileof
luteolininsixmaleandsixfemaleratsafteroral
administrationof180 mg· kg-1 Elsholtziablanda
Benth.extracts(n=6, x±s)
·525·应景艳等:鸡肝散药效成分木犀草素在大鼠体内的药代动力学
Table2　MeanPharmacokineticparametersofluteolin
insixmaleandsixfemaleratsafteroraladministration
of180 mg· kg-1 ElsholtziablandaBenth.extracts
(n=6)
Parameter Male Female
Ka/h-1 2.50±1.57 4.73±3.98
T1/2α/h 0.27±0.18 1.21±1.15
T1 /2 β /h 1.95±0.54 2.96±0.94
Tmax/h 0.64±0.13 0.57±0.55
Cmax/μg· mL-1 9.71±2.60＊＊ 3.98±2.81
MRT/h 2.61±0.50 4.02±1.10
AUC
0-∞ /μg· h· mL-1 25.88±6.51 12.16±6.16
AUC0-∞ /μg· h· mL-1 27.23±7.49 14.33±8.71
＊＊P<0.01vsfemalegroup
对雌雄大鼠血药浓度时间数据进行统计分析 ,
得出性别效应 、时间效应和性别-时间交互效应的 P
值均小于 0.01。结果显示 , 不同时间的血药浓度差
别具有统计学意义;不同性别的大鼠血药浓度差别
具有统计学意义;大鼠性别与时间之间有明显交互
效应。
6　木犀草素代谢产物色谱峰确证
6.1　酶法　葡糖醛酸酶水解后 ,发现峰 3(图 1)消
失 ,而木犀草素峰增高 ,得到色谱图与酸水解方法所
得色谱图一致。而硫酸酯酶水解后 ,峰 3并未消失 。
故判断峰 3可能为木犀草素 I相葡醛酸结合代谢
产物的色谱峰。
6.2　质谱法　用质谱法进一步确证了代谢产物 。
图 3A为灌胃 1 h后的血样未经酸处理的液相色谱
图 ,保留时间 13.76 min及 23.96 min的峰分别是代
谢物与木犀草素 。图 3B, C分别为代谢物及木犀草
素的质谱图 。
根据选择离子色谱 ,鸡肝散提取物大鼠体内的
二相代谢物主要为单葡糖醛酸结合物 ,其相应准分
子离子 m/z461。
讨论
文献[ 5]研究显示木犀草素能与牛血清白蛋白
(BSA)发生相互作用并形成复合物 , 结合力较强 ,
37 ℃时结合常数为 6.9 ×104 , 推测是木犀草素作
为疏水性小分子 , 可能插入 BSA分子内部的疏水区
域 , 以疏水作用力与之结合。本实验考察了多种有
机溶剂提取血浆样品中木犀草素的提取回收率 , 结
果显示用乙腈 、甲醇有机溶剂直接沉淀蛋白后 , 乙
腈和甲醇均不能从血浆中提取出任何代谢产物或木
Figure3　Chromatogramofuntreatedplasmasample
afteroraladministrationfor1 h(A), andMSof
metabolite(B), andMSoflutetolin(C)
犀草素及木犀草素苷 , 乙酸乙酯能提取出微量木犀
草素 。推测木犀草素提取回收率低的原因可能是其
与血浆蛋白的强作用引起的 。故改用三氯乙酸沉淀
血浆中的蛋白 , 选择乙酸乙酯为提取溶剂 , 从而改
善了木犀草素提取回收率。另比较了用酶及盐酸水
解血浆中的木犀草素结合物 , 发现 10 mol· L-1的
盐酸效果比较好 , 这可能与盐酸水解蛋白后 , 使木
犀草素最大程度释放出来有关。
给大鼠灌胃鸡肝散提取物后 ,在血浆中未检测
到木犀草素苷 。文献[ 6]也有报道在给大鼠灌胃木
犀草素-7-O-β-葡糖苷后 ,在血浆样品中检测不到木
犀草素苷 ,而只检测到其苷元木犀草素 。本实验基
本确证了葡糖醛酸 II相结合物 。这与文献 [ 6, 7]所报
·526· 药学学报 ActaPharmaceuticaSinica2008, 43(5):523-527
道的木犀草素能产生多种 I相代谢产物 ,主要发生
的是葡醛酸化代谢反应相一致 。经质谱鉴定进一步
确定为木犀草素的单葡醛酸结合物(m/z461)。基
于 Marele等 [ 8]研究报道 ,木犀草素分别用人和鼠的
肝肠微粒体体系 ,经 UDPGA启动 I相反应 ,孵育
后 ,均形成 3种代谢物 ,即木犀草素 -7-O-葡醛酸 、木
犀草素 -4′-O-葡醛酸及木犀草素 -3′-O-葡醛酸 ,可以
推测木犀草素分子式中的 3个羟基能发生葡醛酸化
反应 ,实验中所得代谢产物葡醛酸化位点需进一步
研究。
雄性大鼠的血药浓度时间曲线在 1 h与 4 h处
出现双峰 ,提示木犀草素是通过肝肠循环进行重吸
收 。Chen等 [ 9]报道也证实了这一现象。近年来研
究 [ 10]发现 ,相同剂量的同一药物在雌雄动物体内会
产生药代动力学和药效学的差异。有文献 [ 11]报道
静脉给予相同剂量的染料木黄酮 ,雌性大鼠体内的
血药浓度高于雄性 ,认为是雄性动物对染料木黄酮
的消除大于雌性所导致的 。本研究发现鸡肝散提取
物对于不同性别的大鼠药物的血药浓度间的差别具
有统计学意义 ,值得进一步探讨 。
References
[ 1] LuJS, ShenT, GuoZ, etal.Thechemicalconstituents
ofElsholtziablanda[ J] .ActaBotSin(植物学报),
2001, 43:545-550.
[ 2] ZhangWL, DuJ, ZhouYM, etal.Theseparationand
identificationofflavonoidglycosidefromElsholtziablanda
[ J] .ChinaJChinMaterMed(中国中药杂志), 1999,
24:96-98.
[ 3] ChengHY, ZhouCX, LouYJ, etal.Thestudyon
chemicalconstituentsofElsholtziablanda[ J] .ChinaJ
ChinMaterMed(中国中药杂志), 2005, 30:1589 -
1591.
[ 4] ShimoiK, OkadaH, FurugoriM, etal.Intestinal
absorptionofluteolinandluteolin7-O-beta-glucosidein
ratsandhumans[ J] .FEBSLet, 1998, 438:220-224.
[ 5] QuLB, WangL, YangR, etal.Interactionofbovine
serum albuminwithluteolinandapigenin[ J] .Acta
PharmSin(药学学报), 2006, 41:352-357.
[ 6] ShimoiK, SakaN, NozawaR, etal.Deglucuronidation
ofaflavonoid, luteolinmonoglucuronide, duringinflam-
mation[ J] .DrugMetabDispos, 2001, 29:1521-1524.
[ 7] ChunSL, YunSS, KeJZ, etal.Gaschromatographic/
massspectrometricprofilingofluteolinanditsmetabolites
inraturineandbile[ J] .JPharmBiomedAnal, 1995,
13:1409-1414.
[ 8] BoersmaMG, vanderWoudeH, BogaardsJ, etal.
Rietjens.regioselectivityofphaseIImetabolism of
luteolinandquercetinbyUDP-glucuronosyltransferases
[ J] .ChemResToxicol, 2002, 15:662-670.
[ 9] ChenT, LiLP, LuXY, etal.Absorptionandexcretion
ofluteolinandapigenininratsafteroraladministrationof
chrysanthemum morifolium extract[ J] .AgricFood
Chem, 2007, 55:273-277.
[ 10] Pleym H, SpigsetO, KharaschED, etal.Gender
diferencesindrugefects:implicationsforanesthesiolo-
gists[ J] .ActaAnaesthesiolScand, 2003, 47:241.
[ 11] SlikkerW, CscalletJrA, DogergeDR, etal.Gender-
baseddiferencesinratsafterchronicdietaryexposureto
genistein[ J] .JTaxicol, 2001, 20:175.
·527·应景艳等:鸡肝散药效成分木犀草素在大鼠体内的药代动力学