全 文 ：浙 江 农 业 大 学 学 报 2 1( l ): 4 7一 0 5, 1 9 9 5
J o u r n a l o f Z h e ji a n g A g
r
i e
u
l t u r a l U n i
v e r s i t y
芜著油菜叶肉原生质体再生植株①
李世君 钱 秀红 李德葆
(浙江农业大学生物技术研究所 , 杭州 31 00 2 9)
摘 要 以芜著油菜为材料 ,从无菌苗 5一 8 天叶龄的叶片分离叶肉原生质体 , 然 后以 6 火 10 ` /
m L 的密度用 M P I 一 3 液体培养基进行浅层培养 . 培养 10 天后 ,用 M P 4 培养基对 M PI 一 z 中的培养
物进行稀释 ( 1 : 1) . 用 M P S 培养基对 M P 3 中的培养物进行稀释 ( 1 : 1 ) , 每次间隔 10 天 . 在培养期
间时常用手轻轻摇动培养物 . 用这种方法 ,再生细胞分裂并形成愈伤组织 . 愈伤组织经 M SI 培养基
增殖 3 周 ,转到分化培养基上诱导植株分化 、分化出的苗经诱导生根发育成完整的小植株 (共 54
株 ) . 在研究中发现 : ①激素的种类 、 浓度 及组合对刺激细胞分裂的作用差异明显 ; ②提高培养基的
pH 值可明显地控制细胞褐化 ;③ A g N O : (5 m g /m L )有益于愈伤组织分化植株 ; ④谷氨酞胺 ( 80
m g / m L )和腺膘吟 (4 。 m g / m L )能提高愈伤组织的植株分化频率 ;⑤原生质体培养基对原生质体植
株的分化亦有影响 .
关 键 词
中图分类
芜著油菜 ; 原生质体 ; 植株再生
Q 9 4 4
.
6 ; 5 3 3 6
L i S h万u , : ; Q ia ,: X i u h o n g ; L i D e laj o ( B i o z e c h n o le g ic a l l ,: s t i t u z。 of Z h匀 r a n g A g r ic u l z u er 乙J ,` iv e r s i t y ,
H
a ,: g 二h o u 3 1 0 0 2 9 , C h i ,: a )
P la n t r e g e n e r a t i o n f r o m m e s o Ph y l l p r o t o p l a s t s o f tu r n i p r a p e ( B ar
s s ic a c a 矛n p e s r ir s v a r . ar P a )
.
Jo u r n a l o f Z h e ji
a n g A g
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n iv e r s it y
,
1 9 9 5
,
2 1 ( l )
:
4 7一 5 0
A b s t r a e t U s i n g t u r n i p r a p e a s m a t e r ia l
,
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.
P r o t o p l
a s t s w e r e e u l t
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( M P I
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.
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a t iv e e e l ls d iv id e d
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.
P r o t o P l
a s t一 d e r i v e d m ie r o e a ll i w e r e e u lt u r e o n t h e M S I m
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f o r 3 w e e k s n d t h e n t r a n s f e r e d o n t o t h e d i f fe r e n t ia t iv e m e d ia ( M S 3
一
5 ) r o in d u e e s h o o t r e g e n e r a
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.
A f t e r 4 w e e k s o n t h e d if f e r e n t i a t iv e m e d ia
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o o t s w e r e fo r m e d f r o m f h e e a lli
.
T h e s e s h o o t s
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e d iu m a n d fo r m e d p l a n t l e t s
.
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.
K e y w o r d s B
.
c a m P e s t r i s v a r
.
ar P a ; p r o t o P l a s t s ; p l a n t r e g e n e r a t i o n
芸苔属 ( B ar s i ca ) 包括许多重要 的蔬菜
和油料作物 , 如甘蓝 、 大白菜 、 油菜等 ,具有较
收稿日期 : 1 9 9 3一 10一 l
①浙江省科委 “ 八五 ” 重点课题
高的经济价植 . 70 年代以来芸苔属作物的原
生质体培养研究进展较快 , 已从许多作物的
原 生 质 体 获 得 了再 生植 株 l[] . 但 大 白菜阁
( B
,二 s s ic a p e k i l , e , , 5 1: )和 白菜型油菜 [3〕 ( B ar s -
浙 江 农 业 大 学 学 报 2 1卷
z s’ ` 。 : 。
P m es
tr i: )原生质体再生植株仅各有一
例报道 . 因此进一步深入研究 A A基因作物
的原生质体培养技术显得非常必要 .
芜著油菜 (刀r a s s i c a c a呻 e str i sv r ar aP a )
属白菜型油菜 , 基因组为 A A (2 n ~ 2。 ) , 是重
要的油料作物 , 其原生质体再生植株 尚未见
报道 . 该材料无花粤是选择细胞杂种植株有
用的形态标记 . 本实验 旨在 建立芜著油菜叶
肉原生质体植株再生体系 . 为体细胞交及外
源基因的直接转移奠定基础 .
1 材料与方法
1
.
1 原生质体的游离及培养
种子由浙江省农业科学院陈曼玲老师提
供 . 无菌苗的建立方法及原生质体的游离方
法 见李世君 z[] 等 ( 1 9 9 2) . 游离下的原生质体
以 6 x 1 0 4 /m L 的密度用 M IP 一 3 培养基 (表
1 )进行浅层培养 ( 25 ℃ , 暗 ) . 培养 10 天后统
计 细胞分裂频率 (分裂细胞数占统计细胞总
数的百分比 . 每次统计 1 50 个细胞左右 , 重复
三次 ) . 这时再用 M P 4 ( 2 , 4一 D 0 . 25 m g / L ,
N A A 0
.
25 m g / L
,
6
一
B A 0
.
5 m g / L
, 葡萄糖
5 2 9 / L p H 6
.
5 )按 1 , l 的比例对 M P I一 2 中
的培养 物 进行稀 释 , 用 M P S ( 2 , 4一 D .0 25
m g / L
,
K T 3 m g / L
, 葡萄糖 52 9 / L , p H 6 . 5)
按 1 : 1 的比例 对 M P 3 中的培养物进行稀
释 , 并分成两皿进行弱光培养 (2 5 ℃ ) . 此后
每 10 天加液一次直至 愈伤组 织长到直径 1
m m 大小 .
原生质体培养基 M P I 一 5 的基本成份为 :
K M SP [’1 培养基的大量元素 、 有机酸 、 糖及糖
醇 , B S阁培养基微量元素 、 维生素 .
1
.
2 愈伤组织增殖与植株再生
当愈伤组织长到直径 1一 Zm m 时 , 将其
转 到 M S I ( 2 , 4一 D 0 . 2 m g / L , K T 3 m g / L ,
A g N O
: 5 m g / L
,蔗 糖 2% ) 和 M S Z (M S I 去
掉 A g N O 3 )培养基上增殖 . 待愈伤组织长到
直径 4 m m 时转到 M S 3一 5( 表 2) 培养基上诱
导器官分化 . 分化出的苗 2 Cm 高时 , 从愈伤
组 织上切下 , 在 M S 6 (I B A 0 . 5 m g / L , 蔗糖
2 % )上诱导生根 (培养条件与无菌苗相同 .
2 结果与讨论
2
.
1 原生质体分离与培养
从 5一 8 天叶龄的叶片可分离到大量的
原生质体 (图版之 1 ) ( 6 x l0 6 /m L · g 叶片 ) .
纯化的叶肉原生质体分别用 M P I一 3 制成 6
x lo
`
/m L 的 密 度 并 进行 浅 层 液体 培 养
(2 5℃ 、黑暗 ) . 培养 3 天后出现第一次细胞分
裂 ( 图版之 2 ) , 5 天后开始第二次细胞分裂
(图版之 3) . 第 10 天时统计细胞分裂频率
(表 1) . 结果表 明 , 提高 6一 B A 浓度 ( 0 . 25 ~
0
.
5 m g / L
.
) 可使细胞分裂频率提高 14 % . 同
时 K T ( l m g / L ) 与 2 , 4一 D ( 0 . s m g / L ) ( M P 3 )
配合 使用较 M P I 、 M P Z 培养基中激素配 比
对刺激细胞分裂更为有效 .
表 1 激 素对原生质休分裂频率的影响①
T a b le 1 T h e e ff e e t o f h o r m o n e s o n t h e f r e q u e n e y o f
p r o t o p la s t d i v i s i o n
培养基 M P I M P Z M P 3
激素配 比 ( m g l/ J )
分裂频率 ( % )
2
.
4
一
D 0
.
5
N A A 0
.
5
6
一
B A 0
.
2与
2 6
2
.
4一 D 0
.
5 2
.
4
一
D 0
.
5
N A A 0
.
5 K T I
6一 B A 0
.
5
3 0 4 6
。
3
①培养基 p H S . 8 ,含葡萄搪 82 9 / L
原生质体培养 1 0 天后 , M P I一 2 、 M P 3 中
的培养物分别用 M P 4 和 M P S 以 1 : 1 的比
例进行稀释 ,并分成两皿进行弱光培养 , 这可
以降低培养物 密度 ,补充营养 , 增加透气性 ,
加速细胞 团生长 . M P 4 、 M P S 培养基中降低
生长素 (2 , 4 一D . N A A )浓度是为了防止生长
素对植株分化产生不利的影响 . 原生质体培
养 15 天后形成小细胞团 (图版之 4) ; 30 天左
右形成小愈伤组织 (图版之 5) .
在培养过程中 , 为减轻细胞褐化 ,采用了
低熔点琼脂糖固体包埋法 l1[ 培养 . 此处 , 将稀
释培养基 M P 4 、 M P S 的 p H 值调至 6 . 5 ,亦能
1期 李世君等 芜菩油菜叶肉原生质体再 生植株
减轻稀释后的培养物褐化程度 , 并加速细胞
团的生长 .
2
.
3
2
.
3
.
1
愈伤组织增殖及植株再生
A g 十 对愈伤组织的影响 将直径
1一 2 m m 的愈伤组织分别转到添加 A g N O 3
的 M S I 及对照 M S Z 培养基上 , 愈伤组 织在
M SI 上的生长较 M S Z 上的快 . 约 3 周后 ,选
取黄绿色的愈伤组织转到 M 3S 培养基上诱
导 植 株分化 . 经 M SI 增 殖 的愈伤组 织 在
M S 3 上培养约 4 周后有芽的分化 ( 图版之 6
右下角箭头所示 ) , 其分化频率为 16 % ; 而经
M S Z 增殖的愈伤组织一直未能 获得再 生植
株 . 本试验与 C ih 等 v[] 观察到的 A g N 0 3 能刺
激白菜型油菜和芥菜子叶 、 下胚轴等外植体
再生植株以及 W i l l i a m s 等 [` ]证明的 A g N O 3
能刺激甘蓝愈伤组织生长 ,并保持分化能力
的结果一致 .
2
.
3
.
2 分化培 养 基对 植株 的影响 经
M SI 增殖的愈伤组织分别转到 M S 3 、 M 4S 、
M S S 培养基上 培养 , 约 4 周 后开始分 化 出
芽 , 但植株分化频率在三种培养基之间明显
不同 (表 2) . 结果表明 , 谷氨酞胺 (8 0 m g / L )
和腺嚓吟 (4 0 m g / L ) 能明显地提高植株分化
频率 . 这可能是它们的存在有利于植株分化 .
另外 , 诱导愈伤组织植株分化的程序对植物
分化能力亦有影响 . 经 M SI 增殖的愈伤组织
直接转到 M S 3 上能诱导 植株分化 , 若先经
M S S 培养后再转到 M S 3 上继续培养 , 则愈
伤组织分化成植株的能力丧失 .
表 2 分化培养基对植株再生的影响①
T a b le 2 T h e e f fe e t o f d i ff e r e n t ia t ive m e d i u m o n
p la n t r e g e n e r a t io n
2
.
3
.
3 原生质体培养基的影响 原生质
体经 M P I 、 M P Z 、 M P 3 培养基培养后所形成
的愈伤组织经 M SI 增 殖 ,再转到 M 3S 培养
基上诱导植株分化 . 其植株再生频率不同 (表
3)
. 原生质体在 M P 3 培养基中的分裂频率
( 4 6
.
2 % )高于在 M P I ( 2 6% ) 和 M P Z ( 3 0% )
中的分裂频率 , 但所得到的愈伤组织的植株
分化频率却低于后两者 . 表 明原生质体分裂
频率的高低与植株的分化频率并非呈正相
关 . 所以 ,在建立原生质体高频分裂与高频率
植株再生体 系时 , 原生质体培养基是不可忽
视的重要因素 .
表 3 原生质体培养基对植株分化的影响①
T a b l e 3 T h e e f f e e t o f p r o t o p la s t e u l t u r e m e d菠u m o n
p la n t r e g e n e r a t i o n
原生质体培养基
P r o t o p la s t M P I M P Z M P 3
e u l t u r e m e d i u m
激素配 比 ( m g / L ) 2 . 4一 D 0 . 5 2 . 4一 D 0 . 5 2 . 4一 D 0 . 5
N A A 0
.
5 N A A 0
.
5 K T I
6
一
B A 8
.
0 6
一
B A 0
.
5
分化频率 (% ) 1 2 1 6 8
①分化培养基 为 M 3S
再生植株从愈伤组织上切下 ,经 M 6S 培
养基诱导生根后发育成完整的小植株 . 另外 ,
再生的植株中有的形 态上发生了变异如 : 植
株上不长叶片 .
分化培养基 M P Z M P 3
附加成份 ( m g / I J ) 6一B A 3
G A 3 0
.
K T Z
I A A 0
.
分裂频率 ( % )
M P I
6
一
B A 3
G A 3 0
.
5
G l n 8 0
A d e n in e 4 0
l 6
① 培养基 p H 值 5 . 8 , 含蔗糖 2% .
参考文献
1 贾 士荣 . 芸苔属的原生质体培养和细胞融合 . 植物 生
理学通迅 , 1 9 8 8 ( 5 ) : 7一 1 2
2 李世君 . 大白菜无菌苗叶肉原生质体再生植株 , 生物
工程学报 , 1 9 92 , 8 ( 3 ) : 2 4 9一 2 5 -
3 G lim e liu s K
.
H ig h g r o w t h r a t e a n d r e g e ne r a t i o n e a
-
p a e i t y o f h y p oc o t y l p r o t o p la s t s in s o m e B ar
s s i c a
.
P h y s i o l
.
P la n t
,
1 9 8 4
.
6 1
:
3 8一 4 4 4
4 K a o H N
,
M i
e h a y l u k M R
.
N u t r i t i o n a l r e q u泛r e m e n t s
fo r g r o w t h o f V ic ia h口夕口 ast ” a e e ll s a n d p r o t o p la s t s a t
v e r y l o w p o p u la t i o n d e n s i t y i n liq u id m e d i a
.
P l a n t a
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1 9 7 5
,
1 2 6
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1 0 5一 1 10
5 G e n b o r g O L
,
M i l l
e r R A
,
O jim a K
.
N u t r i e n t r e q u ire
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m e n t s o f s u s p e n s i o n e u l t u r e s o f s o y b e a n r o t
e e ll s
.
E x p
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C e l l R e s
. ,
1 9 6 8
,
5 0
:
1 5 1一 15 8
1 期 李世君等 芜菩油菜叶肉原生质体再 生植株
减轻稀释后的培养物褐化程度 , 并加速细胞
团的生长 .
2
.
3
2
.
3
.
1
愈伤组织增殖及植株再生
A g 十 对愈伤组织的影响 将直径
1一 2 m m 的愈伤组织分别转到添加 A g N O 3
的 M S I 及对照 M S Z 培养基上 , 愈伤组 织在
M SI 上的生长较 M S Z 上的快 . 约 3 周后 ,选
取黄绿色的愈伤组织转到 M 3S 培养基上诱
导 植 株分化 . 经 M SI 增 殖 的愈伤组 织 在
M S 3 上培养约 4 周后有芽的分化 ( 图版之 6
右下角箭头所示 ) , 其分化频率为 16 % ; 而经
M S Z 增殖的愈伤组织一直未能 获得再 生植
株 . 本试验与 C ih 等 v[] 观察到的 A g N 0 3 能刺
激白菜型油菜和芥菜子叶 、 下胚轴等外植体
再生植株以及 W i l l i a m s 等 [` ]证明的 A g N O 3
能刺激甘蓝愈伤组织生长 ,并保持分化能力
的结果一致 .
2
.
3
.
2 分化培 养 基对 植株 的影响 经
M SI 增殖的愈伤组织分别转到 M S 3 、 M 4S 、
M S S 培养基上 培养 , 约 4 周 后开始分 化 出
芽 , 但植株分化频率在三种培养基之间明显
不同 (表 2) . 结果表明 , 谷氨酞胺 (8 0 m g / L )
和腺嚓吟 (4 0 m g / L ) 能明显地提高植株分化
频率 . 这可能是它们的存在有利于植株分化 .
另外 , 诱导愈伤组织植株分化的程序对植物
分化能力亦有影响 . 经 M SI 增殖的愈伤组织
直接转到 M S 3 上能诱导 植株分化 , 若先经
M S S 培养后再转到 M S 3 上继续培养 , 则愈
伤组织分化成植株的能力丧失 .
表 2 分化培养基对植株再生的影响①
T a b le 2 T h e e f fe e t o f d i ff e r e n t ia t ive m e d i u m o n
p la n t r e g e n e r a t io n
2
.
3
.
3 原生质体培养基的影响 原生质
体经 M P I 、 M P Z 、 M P 3 培养基培养后所形成
的愈伤组织经 M SI 增 殖 ,再转到 M 3S 培养
基上诱导植株分化 . 其植株再生频率不同 (表
3)
. 原生质体在 M P 3 培养基中的分裂频率
( 4 6
.
2 % )高于在 M P I ( 2 6% ) 和 M P Z ( 3 0% )
中的分裂频率 , 但所得到的愈伤组织的植株
分化频率却低于后两者 . 表 明原生质体分裂
频率的高低与植株的分化频率并非呈正相
关 . 所以 ,在建立原生质体高频分裂与高频率
植株再生体 系时 , 原生质体培养基是不可忽
视的重要因素 .
表 3 原生质体培养基对植株分化的影响①
T a b l e 3 T h e e f f e e t o f p r o t o p la s t e u l t u r e m e d菠u m o n
p la n t r e g e n e r a t i o n
原生质体培养基
P r o t o p la s t M P I M P Z M P 3
e u l t u r e m e d i u m
激素配 比 ( m g / L ) 2 . 4一 D 0 . 5 2 . 4一 D 0 . 5 2 . 4一 D 0 . 5
N A A 0
.
5 N A A 0
.
5 K T I
6
一
B A 8
.
0 6
一
B A 0
.
5
分化频率 (% ) 1 2 1 6 8
①分化培养基 为 M 3S
再生植株从愈伤组织上切下 ,经 M 6S 培
养基诱导生根后发育成完整的小植株 . 另外 ,
再生的植株中有的形 态上发生了变异如 : 植
株上不长叶片 .
分化培养基 M P Z M P 3
附加成份 ( m g / I J ) 6一B A 3
G A 3 0
.
K T Z
I A A 0
.
分裂频率 ( % )
M P I
6
一
B A 3
G A 3 0
.
5
G l n 8 0
A d e n in e 4 0
l 6
① 培养基 p H 值 5 . 8 , 含蔗糖 2% .
参考文献
1 贾 士荣 . 芸苔属的原生质体培养和细胞融合 . 植物 生
理学通迅 , 1 9 8 8 ( 5 ) : 7一 1 2
2 李世君 . 大白菜无菌苗叶肉原生质体再生植株 , 生物
工程学报 , 1 9 92 , 8 ( 3 ) : 2 4 9一 2 5 -
3 G lim e liu s K
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H ig h g r o w t h r a t e a n d r e g e ne r a t i o n e a
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1 9 8 4
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3 8一 4 4 4
4 K a o H N
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5 G e n b o r g O L
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M i l l
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