全 文 ：收稿日期:2013-11-24; 修订日期:2014-05-22
基金项目:国家科技部“十一五”科技支撑计划子课题
( No． 2006BAI06A03 － 03)
作者简介:李寅超( 1969-) ，男( 汉族) ，河南南阳人，郑州大学药学院副教
授，博士学位，硕士研究生导师，主要从事中药药理与毒理研究工作．
黄药子醇提物肝细胞毒性机制的初步研究
李寅超，石金金，富显祖，何永侠，孙 曼，陈慧芳，吴翠萍
(郑州大学药学院，河南 郑州 450001)
摘要:目的 研究黄药子醇提物对肝 HL － 7702 细胞生长的抑制作用及细胞乳酸脱氢酶释放率的影响。方法 采用 MTT
法，LDH法进行研究。结果 细胞经黄药子醇提物处理 24 h、48 h 后，测得黄药子醇提物的 IC50为 20． 284，19． 453μg /ml，
乳酸脱氢酶( LDH) 的释放率较小。结论 黄药子醇提物的肝毒性可能不是通过破坏其细胞膜造成的。
关键词:黄药子醇提物; MTT法; LDH法; HL － 7702 细胞; 细胞培养
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 10． 014
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2014) 10-2345-02
Preliminary study of the hepatotoxicity induced by Dioscorea bulbifera L． on hepatocytes
LI Yin-chao，SHI Jin-jin，FU Xian-zu，HE Yong-xia，SUN Man，CHEN Hui-fang，WU Cui-ping
( Zhengzhou Uniersity School of Pharmaceutical Sciences，Zhengzhou Henan 450001，China)
Abstract: Objective To study the alcoholic extract from Dioscorea bulbifera L． on the inhibitory effect of liver HL － 7702 cell
growth and the lactate dehydrogenase ( LDH ) releasing rate． Methods MTT assay and LDH assay are conducted to test．
Ｒesults The half maximal inhibitory concentration( IC50 ) of the alcoholic extract from Dioscorea bulbifera L． is 20． 284μg /mL，
19． 453μg /mL after the cells are processed for 24 hours，48 hours，the LDH releasing rate is lesser． Conclusion Hepatotoxicity of
the Alcoholic Extract from Dioscorea bulbifera L． may not primarily through damaging the cell membranes．
Key words: Alcoholic extract from Dioscorea bulbifera L; MTT assay; LDH assay; HL － 7702 cells; In vitro
黄药子为薯蓣科薯蓣属植物黄独 Dioscorea bulbifera L．的干
燥块茎，药性苦寒，归肺、肝经，具有消瘿解毒和凉血止血之功，临
床上用于治疗甲状腺肿、多种癌症等［1］。现代研究表明，黄药子
乙醇提取物(本文简称“黄药子醇提物”)具有较强的抗炎活
性［2］和一定的抑瘤作用［3］，但其有效成分、毒性成分尚不能完全
确定［4］。然而近年来关于黄药子醇提物的毒副作用尤其是肝毒
性屡有报道［5 ～ 7］，故加强对黄药子醇提物致肝损害机制研究，对
于指导黄药子的合理开发与临床应用具有实际意义。本研究通
过观察黄药子醇提物对体外正常肝细胞生长抑制作用和细胞乳
酸脱氢酶释放率的影响，初步探讨黄药子醇提物肝毒性机制。
1 材料与仪器
1． 1 材料 人肝细胞株 HL － 7702 细胞(中国医学科学院上海细
胞库提供)，培养于含 15 %胎牛血清的 ＲPMI 1640 培养基(内含
青霉素 100U /ml，链霉素 100U /ml)，在含 5 % CO2的 37 ℃培养
箱中培养，每 4 ～ 5d传一代［8］。
1． 2 药品与试剂 黄药子饮片购自河南省老百姓大药房，经郑州
大学药学院刘若庸教授鉴定认为来源于黄独 Dioscorea bulbifera
L．的块茎。黄药子醇提物由郑州大学新药研发中心制备，方法
为:黄药子饮片打碎成粗粉，加 10 倍量 75%乙醇浸泡 30 min后，
加热回流提取 2 h，倾出药液，残渣再加 10 倍量 75%乙醇重复回
流提取 3 次。合并 4 次提取液，减压浓缩至浸膏，80 ℃冷冻干燥
至黄色粉末。用前先用 DMSO 配制成储备液，然后用 ＲPMI －
1640 培养基进行倍量稀释。胎牛血清(杭州四季清生物工程有
限公司)，ＲPMI1640 (Hyclone 公司产品)，MTT(四氮唑 3 －〔4，
5dimethylthi － azol － 2 － yl〕－ 2，5 － diphenyltetrazolium bromid －
e)，DMSO(生化纯，Amresco)，含 0． 02% EDTA 的胰酶(Hyclone
公司产品)，乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物有限公
司);MTT临用前用 PBS 配成 5 mg /ml，其它试剂皆为国产分析
纯，实验用水为 Mili2Q 自制超纯水。
1． 3 仪器 酶标仪为 Power Wave XS2，美国生产。
2 方法
2． 1 MTT法测定黄药子醇提物的细胞毒作用 取对数生长期的
HL － 7702 细胞以 6 × 103 个 /孔的数量接种于 96 孔培养板中，在
含 5 %CO2 的 37 ℃培养箱中培养 24 h后，分别加入 ＲPMI － 1640
完全培养基、不同浓度的黄药子醇提物，每个浓度设 6 个平行孔。
药物终浓度为 2． 5，5，10，20，40，80μg /ml。继续温育培养 24，48 h
后，各孔分别加入 20μl MTT，温育 4h后，弃去培养基，加入 150μl
DMSO，震荡器均匀震荡混匀，于 570 nm 波长处读板。依据测得
的吸光度值计算细胞存活率，进而计算抑制率［9］。
细胞抑制率(%)=(1 －试验组吸光度值 /对照组吸光度值)
× 100 %
2． 2 LDH释放率试验 取对数生长期的细胞，用胰酶消化后，调
整细胞浓度，以细胞 5 × 104 个 /孔，每孔 1 ml 接种于 24 孔板，在
含 5 %CO2 的 37 ℃培养箱中培养 24 h后，分别加入 ＲPMI － 1640
完全培养基、不同浓度的黄药子醇提物，每个浓度 2 个复孔，继续
温育培养 24，48 h后，离心收集上清，同时贴壁细胞用 PBS 小心
冲洗 3 次后用培养基同体积的 2%曲拉通裂解细胞并收集裂解
液，分别检测培养基和细胞裂解液中的乳酸脱氢酶的活力，代入
公式:
LDH(%)=
LDHmedia
LDHmedia + LDHccel
× %
3 结果
3． 1 黄药子醇提物对人肝 HL － 7702 细胞生长抑制作用 将不
同浓度的黄药子醇提物与 HL － 7702 细胞分别作用 24h、48h 后，
用 MTT法测得细胞的存活率，进而计算抑制率(见表 1)。黄药
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 10 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 10 期
子醇提物具有细胞毒性量效依赖关系。用 SPSS 17． 0 分析其 IC50
分别为 20． 284，19． 453μg /ml，且黄药子醇提物对体外培养的 HL
－ 7702 细胞的细胞毒作用具有剂量依赖性和时间依赖性。
表 1 黄药子醇提物对 HL －7702 细胞的抑制作用
浓度 /μg·ml －1
抑制率(%)
24h 48h
0 0 0
2． 5 14． 5 19． 7
5 21． 8 26． 7
10 23． 9 32． 3
20 57． 8 36． 7
40 63． 0 70． 8
80 67． 7 80． 3
3． 2 黄药子醇提物对 HL － 7702 细胞 LDH 释放率的影响 将不
同浓度的黄药子醇提物与 HL － 7702 细胞分别作用后，用细胞膜
完整性的敏感指标 －乳酸脱氢酶释放率考察不同浓度黄药子醇
提物分别作用 24 h、48 h对 HL － 7702 细胞膜的损伤程度测得细
胞 LDH活力，进而计算 LDH 释放率(见表 2)。与空白组比较，
黄药子醇提物无明显的促进乳酸脱氢酶释放的作用，并不随浓度
增加而增强，细胞膜的损伤程度亦不增加。
表 2 黄药子醇提物对 HL －7702 细胞 LDH释放率影响
浓度 /μg·ml －1
释放率(%)
24h 48h
0 21． 6 20． 4
20 31． 8 21． 1
40 30． 8 22． 9
80 30． 7 22． 6
4 讨论
自 1975 年《全国中草药汇编》中提到黄药子有小毒至今，已
有很多学者进行了黄药子毒性的研究。黄药子久服常引起恶心、
呕吐、腹痛、厌油腻食物等症状并常引起中毒性肝炎，还会出现黄
疸、肝肿大，严重者甚至出现肝昏迷乃至死亡［10］。根据宋崇顺
等［11］对黄药子急性、亚急性和慢性毒性试验研究的结果，黄药子
的毒性主要表现为能引起肝肾损伤，且损害的程度和剂量与给药
时间有关，对肝脏的损伤在短时间内即表现出来。然而到目前为
止，黄药子的有效成分、毒性成分尚不能完全确定，而且不同极性
溶剂对黄药子提取后其药理和毒理学作用也不尽相同。醇提取
方式与水提取相比较，杂质少，提取率高，对于成分分离更为有
利［4］。因此本试验选取黄药子醇提物为受试品进行研究。
细胞活性和增殖状况的测定是评价药物毒性过程不可或缺
的步骤。当药物对细胞有毒性时，就会抑制细胞的生长。药物的
毒性越大，对细胞的抑制作用就越大。IC50值是用来衡量药物对
细胞抑制作用的大小的指标，一般认为，经体外药物筛选，中药提
取物的 IC50 ＜ 20μg /ml，且呈现剂量依赖性，该药具有杀伤(细胞
毒)作用［12，13］。本实验将不同浓度的黄药子醇提物与 HL － 7702
细胞分别作用 24h、48h 后，用 MTT 法测得细胞的 IC50分别为
20． 284，19． 453μg /ml，且细胞毒作用呈剂量和时间依赖性，推断
对于体外培养的 HL － 7702 细胞有一定的细胞毒作用。LDH 是
活细胞的内含酶之一，其释放率的变化可以体现细胞膜通透性的
改变。当细胞膜受损严重时，胞浆中的 LDH会释放到培养液中，
培养液中 LDH含量多少可反映细胞膜的损伤程度，因此细胞外
液中的 LDH活性增加是细胞损伤的重要标志之一［14］。本试验
结果显示，黄药子醇提物无明显的促进 LDH释放的作用，而且不
随浓度增加而增强，细胞膜的损伤程度亦不增加。
综上初步判断黄药子醇提物具有一定的肝毒性，而其肝毒性
可能非是通过破坏其细胞膜造成的。
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