全 文 ：书食用菌学报２０１３．２０（１）：１～４
收稿日期：２０１２－１２－１２原稿；２０１３－０１－０８修改稿
作者简介：陈世通（１９８６－），男，在读硕士，主要从事食用菌栽培和育种方面的研究。
＊本文通讯作者　Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｏｎｇｃｈｕｎｌｉ＠１２６．ｃｏｍ
文章编号：１００５－９８７３（２０１３）０１－０００１－０４
香菇单孢杂交及杂交菌株分子鉴定
陈世通，白建波，蒲　敏，李梦杰，张玉金，李荣春＊
（云南农业大学农学与生物技术学院食用菌研究所，云南昆明６５０２０１）
摘　要：采用单孢杂交育种技术，以香菇（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ　ｅｄｏｄｅｓ）栽培品种“大山１８”和云南野生香菇“１１－１”为亲本，
选育香菇优良新品种。通过单孢分离和配对杂交，共获得８４个杂交菌株。用ＩＳＳＲ分子标记对杂交菌株与亲
本条带进行鉴定，有４５个菌株包含了两亲本的所有遗传条带，最终证明了这４５个菌株是真正的杂合子。本研
究表明了利用ＩＳＳＲ标记可以有效地对早期菌丝体阶段的香菇杂交菌株的真实性进行鉴定。
关键词：香菇；单孢杂交；ＩＳＳＲ鉴定
　　杂交是遗传物质在细胞水平上的重组过程，
可以把不同类型菌株的优良性状组合在一起，通
过菌丝体的无性繁殖把这些优良性状稳固下来。
食用菌杂交育种技术较多，尤以单孢杂交更为精
确，应用最多［１］。
香菇（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ　ｅｄｏｄｅｓ）是典型的四极性异
宗结合的担子菌，单孢杂交是香菇新品种选育上
最常见的育种方式［２］。目前我国生产上广泛使
用的香菇品种大多来自于国外，缺乏具有自主知
识产权的品种，且由于栽培年限普遍较长，相继
出现种性退化，同时随着香菇栽培范围和规模的
不断扩大，市场对新品种的需求也越来越大［３］，
因此香菇品种选育成为人们十分关注的课题。
笔者以香菇“大山１８”和野生香菇“１１－１”作为亲
本，进行单孢杂交育种，以期选育出高产优质的
香菇杂交新品种。
简 单 序 列 重 复 区 间 多 态 性 （ｉｎｔｅｒ－
ｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）是基于基因组简单
重复序列的 ＤＮＡ 标记技术［４］。本研究采用
ＩＳＳＲ标记鉴定香菇单孢杂交后代，探讨杂合子
鉴定中应用ＩＳＳＲ标记的可行性，以便为香菇杂
种育种提供参考。
１　材料与方法
１．１材料
１．１．１菌株
　　亲本选用“大山１８”、“１１－１”，均由云南大山
合农业科技发展有限公司提供。
“大山１８”是云南大山合农业科技发展有限
公司广泛栽培的品种，引种于浙江省，经过多年
推广栽培已适应云南当地气候，子实体朵形圆
整、盖大肉厚，较耐高温，接种期可跨越春夏秋冬
四季，越夏烂筒少，栽培产量高；不足之处菌柄过
长、菌肉组织较为疏松、菌丝抗污染能力不强。
“１１－１”是采自云南保山龙陵县的野生香菇菌
株，驯化栽培结果表明，该菌株具有短柄的优良
性状，并且菌丝抗污染能力较强，菌肉组织具备
野生香菇特有的致密坚实的优点。
１．１．２培养基
　　ＰＤＡ 培养基（单孢分离和杂交配对用）：
２００ｇ马铃薯，２０ｇ葡萄糖，２０ｇ琼脂，加蒸馏水
定容至ｌ　Ｌ。
ＰＤＢ培养基（菌丝液体培养用）：２００ｇ马铃
薯，２０ｇ葡萄糖，加蒸馏水定容至１Ｌ。
１．２方法
１．２．１单孢分离
　　采集亲本“大山１８”和“１１－１”的子实体，分别
收集其孢子印，制作孢子悬浮液，梯度稀释，选择
合适浓度的孢子悬浮液在ＰＤＡ平板培养基上涂
布，待孢子萌发形成微小的白色星芒状菌落时，
挑取单个菌落转接至ＰＤＡ试管斜面上培养，按
参考文献［５］的方法操作。当菌落直径长至２～
３ｃｍ时镜检，将无锁状联合的单核菌株放入冰箱
内备用。亲本“大山１８”所得单核菌株依次编号
DOI:10.16488/j.cnki.1005-9873.2013.01.011
食　用　菌　学　报 第２０卷
为１８～１、１８～２、１８～３…１８～Ｘ；亲本野生“１１－１”
所得单核菌株依次编号为１１～１、１１～２、１１～３…
１１～Ｙ。
１．２．２杂交菌株初步判定
　　将“大山１８”和“野生１１－１”的单核菌株随机
配对杂交，在一个ＰＤＡ平板底部画正“十”字，沿
正“十”字的对角线分别接入“大山１８”的两块单
核菌株，沿另一条对角线分别接入“野生１１－１”的
两块单核菌株，按照参考文献［６］的方法，接种块
相距２．５ｃｍ，２５℃对峙培养至两亲本菌落菌丝
刚刚交接时用接种针小心地在两单核菌落融合
处挑取菌丝块至ＰＤＡ培养基上培养，当菌落直
径大约为２ｃｍ时，镜检有锁状联合者为初步判
断的杂交子，转接于ＰＤＡ平板扩大培养。
１．２．３拮抗试验
　　在ＰＤＡ平板内采用三点接种法［７］分别接种
香菇亲本“大山１８”、“１１－１”和杂交子，每两点的
间距为２ｃｍ，接种后在２５℃培养箱内培养，观察
记录各菌株间的拮抗反应。
１．２．４杂交菌株ＩＳＳＲ分子鉴定
１．２．４．１　基因组ＤＮＡ提取
分别将杂交子和亲本单核菌株接种于ＰＤＢ
培养基内，２５℃静置培养１５ｄ，过滤收集菌丝，提
取 ＤＮＡ。香菇基因组 ＤＮＡ 的提取方法采用
ＣＴＡＢ法［８］。用 １％ 的琼脂糖凝胶电泳检测
ＤＮＡ的质量和浓度。最后将样品浓度稀释至
５０ｎｇ／μＬ，置于－２０℃冰箱保存。
１．２．４．２ＩＳＳＲ引物筛选
本试验选用了参考文献［９］中扩增香菇特异
性条带较好的引物ＩＳＳＲ１、ＩＳＳＲ３、ＩＳＳＲ４、ＩＳＳＲ９、
ＩＳＳＲ１０、ＩＳＳＲ１１、ＩＳＳＲ１２和参考文献［１０］中的
ＩＳＳＲ２、ＩＳＳＲ５、ＩＳＳＲ６、ＩＳＳＲ７、ＩＳＳＲ８，这１２个引
物都由上海生工生物工程公司合成，用它们分别
对两个亲本菌株基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增。
用１２个引物对两亲本的ＤＮＡ模板进行ＰＣＲ
扩增，ＤＮＡ模板设置了５个浓度梯度：２０、４０、５０、
６０、７０ｎｇ／μＬ，ＰＣＲ反应体积为２０μＬ，其中１０×
ＰＣＲ 缓 冲 液 ２ μＬ，ＭｇＣｌ２ １．６ μＬ，ｄＮＴＰ
（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　ｅａｃｈ）０．３μＬ，引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，
模板 ＤＮＡ　１μＬ，Ｔａｑ　ＤＮＡ 聚 合 酶 （５Ｕ／μＬ）
０．２μＬ，用ｄｄＨ２Ｏ补齐至２０μＬ。ＰＣＲ扩增反应
热循环参数为：９４℃预变性５ｍｉｎ之后，进行连续
３５个循环，即９４℃变性３０ｓ，５２．７℃复性４５ｓ，
７２℃延伸９０ｓ，最后７２℃补平７ｍｉｎ；４℃保存。
扩增反应结束后，取５μＬ　ＰＣＲ扩增产物与溴酚蓝
混合后在１％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳结束
后，将凝胶取出在紫外凝胶成像系统上观察。结果
表明在２０μＬ的反应体系中，５０ｎｇ／μＬ的ＤＮＡ浓
度扩增出的条带最清晰，所以选定浓度为５０ｎｇ／μＬ
的ＤＮＡ模板进行ＰＣＲ扩增，并从扩增出的条带中
筛选出条带清晰、重复性好且含有两个亲本特异性
条带的引物。
１．２．４．３ 杂交菌株的鉴定
利用筛选出的引物对杂交菌株和其亲本单核
菌株进行ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增反应。ＰＣＲ的反应体系／
循环参数和观察扩增图谱的方法与１．２．４．２的步
骤相同。
２　结果与分析
２．１亲本单核菌株
　　共获得“大山１８”单核菌株３６个，野生“１１－
１”４２个。亲本“大山１８”所得单核菌株编号为：
１８～１、１８～２、１８～３…１８～３６，亲本菌株野生“１１－
１”所得单核菌株编号为：１１～１、１１～２、１１～３…
１１～４２。
２．２杂交菌株
　　镜检具有锁状联合的菌株初步判定为杂交
菌株。共获得８４个能够较好生长的杂交菌株，
分别编号为ＤＯ－ｉ（ｉ＝ｌ、２、３…８４）。
２．３拮抗反应
　　８４个杂交菌株中有４５个杂交菌株在与两个亲
本菌落相互接触处出现了很明显的拮抗线（图１箭
头１和２）。而其它３９个菌株与亲本“大山１８”的菌
丝可以相互交叉，没有产生拮抗线（图１箭头３）。
图１　杂交菌株与双亲拮抗反应
Ｆｉｇ．１　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｐａｒｔｉａｌ　ｈｙｂｒｉｄ　ｓｔｒａｉｎｓ
ａｎｄ　ｔｗｏ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ
２
第１期 陈世通，等：香菇单孢杂交及杂交菌株分子鉴定
　　双核体间的拮抗反应由体细胞不亲和因子控
制，仅能从形态学上区别杂交菌株与亲本的不同，
故拮抗反应不能作为杂交成功的标准。要想得到
更加可靠的鉴定结果还需要从遗传物质的水平上
进行鉴定，这就要借助于ＤＮＡ分子标记技术。
２．４ＩＳＳＲ分子鉴定
　　引物筛选试验结果表明，ＩＳＳＲ６能够很好的
与亲本基因组ＤＮＡ结合，电泳后的条带清晰重
复性好，并能获得２条稳定的特异标记条带（图２
箭头１所指条带为“大山１８”所特有，约３００ｂｐ，
箭头 ２ 所 指 条 带 为 野 生 “１１－１”所 特 有，约
６００ｂｐ），所以选择此引物对杂交菌株进行鉴定。
其它引物或扩增出的条带过于密集，或扩增不出
亲本的特异性条带而被淘汰。
ＩＳＳＲ分析表明，有３９个杂交菌株仅具有亲
本“大山１８”的特异性条带，没有出现亲本野生
“１１－１”的特异性条带（图３ＤＯ５），结合拮抗试验
结果判定，这３９个菌株可能不是真正的杂交子。
共４５个杂交菌株具有两个亲本的特异ＤＮＡ条
带，从分子标记层面证明这４５个杂交菌株是真
正的杂合子（图３）。
Ｍ：为分子标记；泳道１和３分别为亲本“大山１８”和野生“１１－１”
的扩增产物；泳道２为杂交菌株ＤＯ１的扩增产物；
箭头１是亲本“大山１８”特有条带；箭头２是亲本野生“１１－１”特有
条带
Ｍ：Ｍａｒｋｅｒｓ；Ｌａｎｅｓ　１ａｎｄ　３：ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｆｒｏｍ　ｐａｒｅｎｔａｌ
ｓｔｒａｉｎｓ“Ｄａｓｈａｎ１８”ａｎｄ“１１－１”，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｌａｎｅ　２：ａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｆｒｏｍ　ｈｙｂｒｉｄ　ｓｔｒａｉｎ　ＤＯ１；１：ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂａｎｄ　ｏｆ“Ｄａｓｈａｎ１８”；
２：ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂａｎｄ　ｏｆ“１１－１”
图２　引物ＩＳＳＲ６的扩增图谱
Ｆｉｇ．２　Ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ｂａｎｄｓ
ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｐｒｉｍｅｒ　ＩＳＳＲ６
Ｍ：为分子标记；Ａ１～Ａ６分别是亲本“大山１８”单核菌株１８～２、１８～５、１８～７、１８～８、１８～１０和１８～１１的扩增产物；Ｂ１～Ｂ６分别是亲本
野生“１１－１”单核菌株１１～２、１１～６、１１～１０、１１～２０、１１～３４和１１～３９的扩增产物；ＤＯ１～ＤＯ６是杂交菌株的扩增产物
Ｍ：Ｍａｒｋｅｒｓ；Ａ１－Ａ６：ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｆｒｏｍ“Ｄａｓｈａｎ１８”ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｓｔｒａｉｎｓ　１８～２、１８～５、１８～７、１８～８、１８～１０和１８～１１；Ｂ１－Ｂ６：
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｆｒｏｍ“１１－１”ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｓｔｒａｉｎｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；ＤＯ１－ＤＯ６：ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｆｒｏｍ　ｈｙｂｒｉｄ　ｓｔｒａｉｎｓ
图３　引物ＩＳＳＲ６对杂交菌株ＤＯ１～ＤＯ６及其亲本的扩增图谱
Ｆｉｇ．３　Ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ｂａｎｄｓ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｈｙｂｒｉｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ＤＯ１－ＤＯ６
ａｎｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅｉｒ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｂｙ　ｐｒｉｍｅｒ　ＩＳＳＲ６
３　讨论
　　应用现代分子生物学技术鉴别杂合子是未
来的发展趋势［１１］。笔者成功应用了ＩＳＳＲ标记
从１２个ＩＳＳＲ引物中筛选出了ＩＳＳＲ６引物，在
大量的杂交后代中鉴别出真正杂交种。两亲本
之间由于存在或缺乏２条独立的标记条带从而
可以被ＩＳＳＲ６引物明显的区别，而由它们组成
３
食　用　菌　学　报 第２０卷
的杂交后代则含有这２条独立标记条带，因此
ＩＳＳＲ６引物可以作为“大山１８”和野生“１１－１”及
杂交后代的标记引物，这将对于保护知识产权
有着重要的意义。细胞水平上的拮抗反应容易
受环境因素的影响，并且受试验者辨别经验的
限制，在实践中具有一定的局限性。而分子标
记只代表遗传变异，与环境影响无关，在育种上
具有广泛的适用性。它是在分子水平上对杂合
子进行鉴定，这就为鉴定的准确性提供了科学
依据。所以将ＩＳＳＲ标记开发成稳定的、可靠的
分子遗传标记，对香菇遗传育种研究具有重要
意义。
在后继的研究中，将对鉴定出的杂交菌株进
行栽培出菇试验，以便摸清杂交菌株的温型、菌
龄和营养需求，有利于进一步改善香菇杂交菌株
的综合性状。
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［本文编辑］　马丹丹
４
ＡＣＴＡ　ＥＤＵＬＩＳ　ＦＵＮＧＩ２０１３．２０（１）：５～８
Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：Ｄｅｃ．１２，２０１２；　Ａｃｃｅｐｔｅｄ：Ｊａｎ．８，２０１３
　＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ．　Ｅ－ｍａｉｌ：ｒｏｎｇｃｈｕｎｌｉ＠１２６．ｃｏｍ
Ｓｉｎｇｌｅ－ｓｐｏｒｅ　Ｃｒｏｓｓｉｎｇ　ｏｆ　Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ　ｅｄｏｄｅｓ　ａｎｄ
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｓｔｒａｉｎｓ　Ｕｓｉｎｇ　Ｉｎｔｅｒ－Ｓｉｍｐｌｅ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅｐｅａｔ（ＩＳＳＲ）Ｍａｒｋｅｒｓ
ＣＨＥＮ　Ｓｈｉｔｏｎｇ，ＢＡＩ　Ｊｉａｎｂｏ，ＰＵ　Ｍｉｎ，ＬＩ　Ｍｅｎｇｊｉｅ，ＺＨＡＮＧ　Ｙｕｊｉｎ，ＬＩ　Ｒｏｎｇｃｈｕｎ＊
（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｅｄｉｂｌｅ　Ｆｕｎｇｉ，Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏｎｏｍｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｙｕｎｎａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｋｕｎｍｉｎｇ，Ｙｕｎｎａｎ　６５０２０１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ　ｅｄｏｄｅｓ　ｃｕｌｔｉｖａｒ，“Ｄａｓｈａｎ　１８”，ａｎｄ　ｓｔｒａｉｎ“１１－１”，ｃｏｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｉｎ　Ｙｕｎｎａｎ
Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｓ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｉｎ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ－ｓｐｏｒｅ　ｃｒｏｓｓ－ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｔｈａｔ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　８４
ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｈｙｂｒｉｄｓ．ＩＳＳＲ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂａｎｄｓ　ｆｒｏｍ　ｂｏｔｈ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｉｎ　４５ｈｙｂｒｉｄ
ｓｔｒａｉｎｓ，ｃｏｎｆｉｒｍｉｎｇ　ｔｈｅ　ｌａｔｔｅｒ　ｗｅｒｅ　ｔｒｕｅ　ｈｙｂｒｉｄｓ，ａｎｄ　ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈａｔ　ＩＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｔｏ
ｉｄｅｎｔｉｆｙ　Ｌ．ｅｄｏｄｅｓ　ｈｙｂｒｉｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｇｒｏｗｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ　ｐｈａｓｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ　ｅｄｏｄｅｓ；ｓｉｎｇｌｅ－ｓｐｏｒｅ　ｃｒｏｓｓ；ＩＳＳＲ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　　Ｃｒｏｓｓ－ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｉｎｖｏｌｖｅｓ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａ－
ｔｉｏｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｃｅｌｕｌａｒ　ｌｅｖｅｌ，ａｎｄ　ａｌｏｗｓ　ｔｈｅ
ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｔａｂｌｅ　ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｄｅｓｉｒａｂｌｅ
ｔｒａｉｔｓ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｄｕｒｉｎｇ
ａｓｅｘｕａｌ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｌｔｈｏｕｇｈ　ｔｈｅｒｅ　ａｒｅ　ｍａｎｙ
ｃｒｏｓｓ－ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｖａｉｌａｂｌｅ，ｃｒｏｓｓｅｓ
ｂｅｔｗｅｅｎ　ｍｏｎｏｋａｒｙｏｎｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｓｉｎｇｌｅ
ｓｐｏｒｅｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｕｓｅｄ　ｍｏｓｔ　ｗｉｄｅｌｙ　ｉｎ　ｍｕｓｈｒｏｏｍ
ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｐｒｏｇｒａｍｓ　ｄｕｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｉｓ
ｍｅｔｈｏｄ［１］．
Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ　ｅｄｏｄｅｓ　ｉｓ　ａ　ｔｙｐｉｃａｌ　ｔｅｔｒａｐｏｌａｒ
ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｉｃ　ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ，ａｎｄ　ｓｉｎｇｌｅ－ｓｐｏｒｅ
ｃｒｏｓｓｉｎｇ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｃｏｍｍｏｎ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ
ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｇｅｎｅｒａｔｅ　ｎｅｗ　Ｌ．ｅｄｏｄｅｓ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ［２］．
Ｃｕｒｒｅｎｔｌｙ，ｍｏｓｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌ．ｅｄｏｄｅｓ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ
ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ　ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｙ　ｉｎ　Ｃｈｉｎａ　ｏｒｉｇｉｎａｔｅｄ
ｆｒｏｍ　ａｂｒｏａｄ　ａｎｄ　ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ　ｎｏｔ　ｓｕｂｊｅｃｔ　ｔｏ
Ｃｈｉｎｅｓｅ　 ｉｎｔｅｌｅｃｔｕａｌ　 ｐｒｏｐｅｒｔｙ　 ｒｉｇｈｔｓ．
Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｓｔｒａｉｎ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｖｅｒ　ｌｏｎｇ
ｐｅｒｉｏｄｓ　ｏｆ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　ｈａｓ　ｒｅｓｕｌｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｌｏｓｓ　ｏｆ
ｍａｎｙ　ｄｅｓｉｒａｂｌｅ　ｔｒａｉｔｓ　ｗｈｉｃｈ，ｔｏｇｅｔｈｅｒ　ｗｉｔｈ
ｒｅｃｅｎｔ　ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕｓｈｒｏｏｍ
ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ｈａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｔｈｅ　ｍａｒｋｅｔ　ｄｅｍａｎｄ
ｆｏｒ　ｎｅｗ　ｖａｒｉｅｔｉｅｓ［３］．Ｓｉｎｃｅ　Ｌ．ｅｄｏｄｅｓ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ
ｈａｓ　ｎｏｗ　ｂｅｃｏｍｅ　ａｎ　ｉｓｓｕｅ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｒｎ，ｗｅ　ｈａｖｅ
ｕｎｄｅｒｔａｋｅｎ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｓｐｏｒｅ　ｃｒｏｓｓ－ｂｒｅｅｄｉｎｇ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ　ａ Ｌ．ｅｄｏｄｅｓ　ｃｕｌｔｉｖａｒ，
“Ｄａｓｈａｎ　１８”，ａｎｄ　ｓｔｒａｉｎ“１１－１”，ｃｏｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ
ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｉｎ　Ｙｕｎｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，ａｓ　ｐａｒｅｎｔａｌ
ｓｔｒａｉｎｓ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｇｅｎｅｒａｔｅ　ｎｅｗ　ｈｙｂｒｉｄ
ｖａｒｉｅｔｉｅｓ．
Ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ （ＩＳＳＲ）
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ，ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｆｌａｎｋｅｄ
ｂｙ　ｒｅｐｅａｔｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
［４］，ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｕｓｅｄ　ｔｏ
ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｈｙｂｒｉｄ　ｓｔｒａｉｎｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｏｆ
ｔｈｅｓｅ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｆｏｒ　ｕｓｅ　ｉｎ　ａ　ｇｅｎｅｒａｌ　Ｌ．ｅｄｏｄｅｓ
ｈｙｂｒｉｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｓ　ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．
１　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ
１．１Ｍａｔｅｒｉａｌｓ
１．１．１Ｓｔｒａｉｎｓ
　　Ｐａｒｅｎｔａｌ　Ｌ．ｅｄｏｄｅｓ　ｓｔｒａｉｎｓ“Ｄａｓｈａｎ　１８”
ａｎｄ“１１－１”ｗｅｒｅ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｂｙ　Ｙｕｎｎａｎ　Ｄａｓｈａｎｈｅ
Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　 Ｓｃｉｅｎｃｅ　 ａｎｄ　 Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｏ．Ｌｔｄ． “Ｄａｓｈａｎ　１８”ｉｓ　ａ
ｐｏｐｕｌａｒ　ｃｕｌｔｉｖａｒ，ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ
Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，ｔｈａｔ　ｉｓ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ａｄａｐｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｌｏｃａｌ
ｃｌｉｍａｔｅ　ｉｎ　Ｙｕｎｎａｎ　ａｆｔｅｒ　ｙｅａｒｓ　ｏｆ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｉｔ
ｃａｎ　ｂｅ　ｇｒｏｗｎ　ａｌ　ｙｅａｒ　ｒｏｕｎｄ　ａｎｄ　ｐｒｏｄｕｃｅｓ　ａ
ｌａｒｇｅ，ｒｏｕｎｄ，ｔｈｉｃｋ　ｐｉｌｅｕｓ　ｉｎ　ｈｉｇｈ　ｙｉｅｌｄ．
ＡＣＴＡ　ＥＤＵＬＩＳ　ＦＵＮＧＩ　 Ｖｏｌ．２０
Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ　ｓｈｏｒｔｃｏｍｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｓｔｒａｉｎ
ｉｎｃｌｕｄｅ　ａ　ｌｏｎｇ　ｓｔｉｐｅ，ｌｏｏｓｅ　ｆｌｅｓｈ　ａｎｄ　ｌｏｗ
ｍｙｃｅｌｉａｌ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ
ａｎｄ　ｍｉｌｄｅｗ．Ｓｔｒａｉｎ“１１－１”ｗａｓ　ｃｏｌｅｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ
ｔｈｅ　ｗｉｌｄ　ｉｎ　Ｌｏｎｇｌｉｎｇ　Ｃｏｕｎｔｙ，Ｂａｏｓｈａｎ　Ｃｉｔｙ，
Ｙｕｎｎａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．Ｏｎ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ，ｉｔ
ｐｒｏｄｕｃｅｓ　ａ　ｓｈｏｒｔ　ｓｔｉｐｅ，ｄｅｎｓｅ　ａｎｄ　ｓｏｌｉｄ　ｆｌｅｓｈ，
ａｎｄ　ｈａｓ　ａ　ｈｉｇｈ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ．
１．１．２Ｍｅｄｉａ
　 　 ＰＤＡ　ｍｅｄｉｕｍ （ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｓｉｎｇｌｅ　ｓｐｏｒｅ
ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐａｉｒｉｎｇ）：ｐｏｔａｔｏ　２００ｇ，
ｇｌｕｃｏｓｅ　２０ｇ，ａｇａｒ　２０ｇ，ｗａｔｅｒ　１Ｌ．
ＰＤＢ　ｍｅｄｉｕｍ （ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ
ｏｆ　ｍｙｃｅｌｉａ）：ｐｏｔａｔｏ　２００ｇ，ｇｌｕｃｏｓｅ　２０ｇ，ｗａｔｅｒ
１Ｌ．
１．２Ｍｅｔｈｏｄｓ
１．２．１Ｓｉｎｇｌｅ　ｓｐｏｒｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
　 　 Ｓｐｏｒｅ　ｐｒｉｎｔｓｗｅｒｅ　ｔａｋｅｎ　ｆｒｏｍ　ｆｒｅｓｈ
ｈａｒｖｅｓｔｅｄ，ｍａｔｕｒｅ　ｆｒｕｉｔ　ｂｏｄｉｅｓ　ｏｆ“Ｄａｓｈａｎ　１８”
ａｎｄ“１１－１”，ａｎｄ　ａｌｉｑｕｏｔｓ　ｏｆ　ｓｐｏｒｅ　ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ　ｉｎ
ｄｄＨ２Ｏ　ｗｅｒｅ　ｓｐｒｅａｄ　ｏｖｅｒ　ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　ＰＤＡ
ｐｌａｔｅｓ． Ｗｈｅｎ　ｖｉｓｉｂｌｅ，ｓｍａｌ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ　ｗｅｒｅ
ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｔｏ　ｆｒｅｓｈ　ＰＤＡ　ｓｌａｎｔｓ　ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ［５］．Ｈｙｐｈａｅ　ｆｒｏｍ　２～３ｃｍ　ｄｉａｍｅｔｅｒ
ｃｏｌｏｎｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｙ　ａｎｄ
ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　 ｍｏｎｏｋａｒｙｏｎｓ　 ｗｉｔｈｏｕｔ　 ｃｌａｍｐ
ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｒｅｔａｉｎｅｄ　ａｎｄ　ｓｔｏｒｅｄ　ａｔ　４ ℃
ｆｏｒ　ｃｒｏｓｓｉｎｇ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．
１．２．２Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄｓ
　　Ｍｏｎｏｋａｒｙｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｆｒｏｍ
ｅａｃｈ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ｓｔｒａｉｎ　ａｎｄ　ｍａｔｉｎｇ　ｗａｓ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ
ｂｅｔｗｅｅｎ　ａｌ　ｔｈｅ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｐａｉｒｉｎｇｓ　ｂｙ　ｐｌａｃｉｎｇ
ｍｏｎｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｍｙｃｅｌｉａ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐａｒｅｎｔａｌ
ｓｔｒａｉｎｓ～２．５ｃｍ　ａｐａｒｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　ＰＤＡ
ｐｌａｔｅｓ　ａｎｄ　ｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ　ａｔ　２５ ℃． Ｗｈｅｎ　ｔｈｅ
ｄｉａｍｅｔｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ　ｗａｓ～２ｃｍ，ｍｙｃｅｌｉｕｍ
ｆｒｏｍ　 ｔｈｅ　 ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ　 ｗａｓ　 ｅｘａｍｉｎｅｄ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｙ　ａｎｄ，ｗｈｅｒｅ　ｃｌａｍｐ　ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ
ｗｅｒｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ，ｔｅｎｔａｔｉｖｅｌｙ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｓ　ｈｙｂｒｉｄ
ａｎｄ　ｓｕｂ－ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｏｎ　ｔｏ　ｆｒｅｓｈ　ＰＤＡ　ｐｌａｔｅｓ．
１．２．３Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ　ｔｅｓｔｓ
　 　 Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ　ｔｅｓｔｓ　ａｄｏｐｔｉｎｇ　ｔｈｒｅｅ－ｐｏｉｎｔ
ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｓ［７］ ｗｅｒｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ａｎｄ
ｈｙｂｒｉｄ　ｓｔｒａｉｎｓ．Ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｓｔｒａｉｎ　ｗａｓ
ｐｌａｃｅｄ　２ｃｍ　ａｐａｒｔ　ｏｎ　ＰＤＡ　ｐｌａｔｅｓ，ｉｎｃｕｂａｔｅｄ　ａｔ
２５℃ ａｎｄ　 ｅｘａｍｉｎｅｄ　 ｐｅｒｉｏｄｉｃａｌｙ　 ｆｏｒ
ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．
１．２．４Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄｓ　ｂｙ　ＩＳＳＲ
１．２．４．１　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ
Ｇｅｎｏｍｉｃ　 ＤＮＡ　 ｗａｓ　 ｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍ
ｍｙｃｅｌｉｕｍ　ｏｆ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ａｎｄ　ｈｙｂｒｉｄ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｇｒｏｗｎ
ｉｎ　ＰＤＢ　ａｔ　２５ ℃ ｆｏｒ　１５ｄｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＣＴＡＢ
ｍｅｔｈｏｄ［８］．ＤＮＡ　ｑｕａｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ
ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｂｙ　１％ ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ａｎｄ，ａｆｔｅｒ　ｄｉｌｕｔｉｏｎ　ｔｏ　５０ ｎｇ／μＬ，ｓｔｏｒｅｄ　ａｔ
－２０℃ｕｎｔｉｌ　ｕｓｅ．
１．２．４．２　Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＳＳＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ
Ｔｗｅｌｖｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ，ＩＳＳＲ１，ＩＳＳＲ３，ＩＳＳＲ　４，
ＩＳＳＲ９，ＩＳＳＲ１０，ＩＳＳＲ１１　ａｎｄ　ＩＳＳＲ１２ （ｓｅｅ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　９），ａｎｄ　ＩＳＳＲ２，ＩＳＳＲ５，ＩＳＳＲ６，ＩＳＳＲ７
ａｎｄ　ＩＳＳＲ８ （ｓｅｅ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　１０），ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ
ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅｉｒ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ａｍｐｌｉｆｙ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂａｎｄｓ　ｉｎ
Ｌ．ｅｄｏｄｅｓ　ｓｔｒａｉｎｓ　ａｎｄ　ｗｅｒｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｂｙ
Ｓｈａｎｇｈａｉ　 Ｓａｎｇｏｎ　 Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　 Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　 ＆ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ　 Ｃｏ． Ｌｔｄ． ＰＣＲ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　ｅａｃｈ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ｓｔｒａｉｎ
ｗａｓ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｉｎ　２０ μＬ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｉｘｔｕｒｅｓ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　２μＬ　１０×ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ，１．６μＬ
ＭｇＣｌ２，０．３μＬ　ｄＮＴＰ （１０　ｍｍｏｌ／Ｌ），１μＬ
ｐｒｉｍｅｒ （１０ μｍｏｌ／Ｌ），１μＬ　ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅ，
０．２μＬ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５　Ｕ／μＬ），ａｎｄ
ｄｄＨ２Ｏ　ｔｏ　ｖｏｌｕｍｅ．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ：
９４℃ｆｏｒ　５　ｍｉｎ，３５　ｃｙｃｌｅｓ　ｏｆ　９４℃ｆｏｒ　３０　ｓ，５２．
７℃ ｆｏｒ　４５　ｓ　ａｎｄ　７２ ℃ ｆｏｒ　９０　ｓ，ａｎｄ　ａ　ｆｉｎａｌ
ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ａｔ　７２℃ｆｏｒ　７　ｍｉｎ．ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ（５μＬ）ｗｅｒｅ　ｍｉｘｅｄ　ｗｉｔｈ　ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ
ｂｌｕｅ，ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ　ｂｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　１．５％
ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌｓ，ａｎｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｎ　ａｕｔｏｍａｔｉｃ　ｇｅｌ　ｉｍａｇｉｎｇ
ａｎａｌｙｚｅｒ．
１．２．４．３　Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄｓ
Ｐｒｉｍｅｒｓ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｃｌｅａｒ， ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｄ
ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ　ｂａｎｄｓ　ｆｒｏｍ　ｅａｃｈ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ｓｔｒａｉｎ
ｗｅｒｅ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｆｏｒ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＳＳＲ　ｍａｒｋｅｒｓ
ｆｒｏｍ　ｈｙｂｒｉｄ　ａｎｄ　ｍｏｎｏｋａｒｙｏｎ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ
ｓａｍｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ａｓ　ｉｎ　１．２．４．２．
６
Ｎｏ．１ ＣＨＥＮ　Ｓｈｉｔｏｎｇ，ＢＡＩ　Ｊｉａｎｂｏ，ＰＵ　Ｍｉｎ，ｅｔ　ａｌ
２　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ
２．１Ｍｏｎｏｋａｒｙｏｎｓ　ｆｒｏｍ　ｐａｒｅｎｔａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ
　　Ｔｈｉｒｔｙ－ｓｉｘ　ｍｏｎｏｋａｒｙｏｎｓ（１８～１，１８～２，
１８～３，…，１８～３６）ａｎｄ　４２ｍｏｎｏｋａｒｙｏｎｓ（１１～
１，１１～２，１１～３，…，１１～４２）ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ
ｆｒｏｍ“Ｄａｓｈａｎ　１８”ａｎｄ“１１－１”，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
２．２Ｈｙｂｒｉｄｓ
　　Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ
ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｃｌａｍｐ　ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　８４
ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｈｙｂｒｉｄ　ｓｔｒａｉｎｓ（ＤＯ－１，ＤＯ－２，ＤＯ－３…，
ＤＯ－８４）．
２．３Ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ　ｔｅｓｔｓ
　　Ｆｏｒｔｙ－ｆｉｖｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　８４ｈｙｂｒｉｄｓ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｃｌｅａｒ
ｌｉｎｅｓ　ｏｆ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ　ｗｉｔｈ　Ｄａｓｈａｎ　１８ａｎｄ　１１－１
（Ｆｉｇ．１ ａｒｒｏｗｓ　１ ａｎｄ　２，ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ
ｖｅｒｓｉｏｎ）， ｗｈｉｌｅ　ｎｏ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ　ｌｉｎｅｓ　ｗｅｒｅ
ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｒｅｍａｉｎｉｎｇ　３９ｈｙｂｒｉｄｓ　ａｎｄ
“Ｄａｓｈａｎ　１８”（Ｆｉｇ．１ａｒｒｏｗ　３，ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ
ｖｅｒｓｉｏｎ）． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ
ｂｅｔｗｅｅｎ　ｄｉｋａｒｙｏｎｓ　ａｒｅ　ｃｏｎｔｒｏｌｅｄ　ｂｙ　ｓｏｍａｔｉｃ
ｃｅｌ　ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ，ｓｉｎｃｅ　ｔｈｅ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｈｙｂｒｉｄ　ａｎｄ　ｐａｒｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ
ａｒｅ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ，ＤＮＡ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ　ａｒｅ　ｎｅｃｅｓｓａｒｙ　ｆｏｒ　ｍｏｒｅ
ｒｅｌｉａｂｌｅ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒｕｅ
ｈｙｂｒｉｄｓ．
２．４ＩＳＳＲ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄｓ
　 　 ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎｉｔｉａｌｙ　ｕｓｉｎｇ　１２
ｐｒｉｍｅｒｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｎｏ．６ｐｒｏｄｕｃｅｄ
ｃｌｅａｒ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ　ｂａｎｄｓ　ｆｒｏｍ　ｅａｃｈ　ｐａｒｅｎｔａｌ
ｓｔｒａｉｎ．Ｏｎｅ　ｓｔａｂｌｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂａｎｄ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ
ｆｒｏｍ　ｅａｃｈ　ｐａｒｅｎｔ，～３００ｂｐ　ｆｒｏｍ “Ｄａｓｈａｎ　１８”
（ａｒｒｏｗ　１ｉｎ　Ｆｉｇ．２，ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｖｅｒｓｉｏｎ）ａｎｄ
～６００ｂｐ　ｆｒｏｍ“１１－１”（ａｒｒｏｗ　２ｉｎ　Ｆｉｇ．２，ｉｎ　ｔｈｅ
Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｖｅｒｓｉｏｎ）．ＩＳＳＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｕｓｉｎｇ　ｐｒｉｍｅｒ
Ｎｏ．６ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂａｎｄｓ　ｏｆ　ｂｏｔｈ
ｐａｒｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ｉｎ　４５ｈｙｂｒｉｄｓ，ｔｈｅｒｅｂｙ
ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ　ｔｈｅｍ　ａｓ　ｔｒｕｅ　ｈｙｂｒｉｄｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｆｉｒｍｉｎｇ
ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ　ｔｅｓｔｓ（Ｆｉｇ．３，ｉｎ
ｔｈｅ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｖｅｒｓｉｏｎ）． Ｔｈｅ　ｒｅｍａｉｎｉｎｇ　３９
ｈｙｂｒｉｄｓ　ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　ｏｎｌｙ　ｔｈｅ　ｍａｒｋｅｒ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｆｏｒ
“Ｄａｓｈａｎ　１８”（Ｆｉｇ．３，ＤＯ５），ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ　ｔｈｅｓｅ
ｗｅｒｅ　ｎｏｔ　ｔｒｕｅ　ｈｙｂｒｉｄｓ　ａｎｄ　ａｇａｉｎ　ｃｏｎｆｉｒｍｉｎｇ　ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ　ｔｅｓｔｓ．
３　Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ
　　Ｓｉｎｃｅ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ　ｔｅｓｔｓ　ａｒｅ　ｒｅａｄｉｌｙ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ
ｂｙ　ｔｈｅ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｓｕｂｊｅｃｔ　ｔｏ　ｏｐｅｒａｔｏｒ
ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ， ｍｏｄｅｒｎ　 ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　 ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ　ｔｈｅ　ｆｕｔｕｒｅ　ｍａｉｎｓｔａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｃｃｕｒａｔｅ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄ　ｓｔｒａｉｎｓ［１１］．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，
ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｓｔａｂｌｅ　ａｎｄ　ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ　ＩＳＳＲ
ｍａｒｋｅｒｓ　 ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ　 ｈｅｒｅ　 ｈａｓ　 ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｎｅｗ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｌ．
ｅｄｏｄｅｓ．Ｗｅ　ａｒｅ　ｎｏｗ　ｃｕｌｔｉｖａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ｔｒｕｅ　ｈｙｂｒｉｄｓ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｒｅｐｏｒｔ　ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ
ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｔｒａｉｔｓ　ｉｎ　ｔｅｒｍｓ　ｏｆ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ
ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ　ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ　ｆｏｒ　ｇｒｏｗｔｈ， ａｎｄ
ｍｕｓｈｒｏｏｍ　ｆｒｕｉｔｉｎｇ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
［１］ＬＩＵ　Ｙ，ＷＡＮＧ　ＳＸ，ＧＥＮＧ　ＸＬ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ
ｔｈｅ　ｃｒｏｓｓｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉｄ　ｓｔｒａｉｎ　ｎｏ．１４ ｏｆ
Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｅｒｙｎｇｉ［Ｊ］．Ｅｄｉｂｌｅ　Ｆｕｎｇｉ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，２０１１，
３０（６）：１５－１７．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）
［２］ＷＡＮＧ　ＺＲ，ＬＩＵ　ＱＹ，ＸＩＡＯ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｒｅｙ
ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　ＩＳＳＲ　ａｎａｌｙｓｅｓ　ｏｆ　Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ　ｅｄｏｄｅｓ
ｈｙｂｒｉｄｓ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｓｙｓｔｅｍａ，２０１０，２９（２）：２６７－２７２．
（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）
［３］ＳＯＮＧ　ＣＹ，ＬＩＵ　ＤＹ，ＳＨＡＮＧ　ＸＤ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｎｅｗ
ｈｙｂｒｉｄ　ｃｕｌｔｉｖａｒ’Ｓｈｅｎｘｉａｎｇ　１６’ｉｎ　Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ　ｅｄｏｄｅｓ
［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ　Ｓｉｎｉｃａ，２０１０，３７（１１）：１８８７－
１８８８．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）
［４］ＺＩＥＴＫＩＥＷＩＣＺ　Ｅ，ＲＡＦＡＬＳＫＩ　Ａ，ＬＡＢＵＤＡ　Ｄ．
Ｇｅｎｏｍｅ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ　ｂｙ　ｓｉｍｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｅａｔ
（ＳＳＲ） － ａｎｃｈｏｒｅｄ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９４，２０（２）：１７６－１８３．
［５］ＺＨＡＮＧ　ＳＱ，ＷＥＩ　ＣＨ，ＨＵ　ＪＷ．Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｓｉｎｇｌｅ－
ｓｐｏｒｅ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ　ｏｆ　Ｃｏｐｒｉｎｕｓ　ｃｏｍａｔｕｓ
［Ｊ］．Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，４９（１）：
１９０－１９４．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）
［６］ＬＩ　ＧＸ，ＨＵＡ　ＧＤ，ＷＡＮＧ　ＤＭ，ｅｔ　ａｌ．Ａｇａｒｉｃｕｓ
ｂｉｓｐｏｒｕｓ　ｃｒｏｓｓ－ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ｕｓｉｎｇ　ｍｏｎｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｓｉｎｇｌｅ－
ｓｐｏｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｅｄｕｌｉｓ　Ｆｕｎｇｉ，２０１１，１８（３）：
１７－２１．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）
［７］ＸＵ　Ｚ，ＳＨＡＮＧ　ＸＤ，ＧＵＯ　Ｑ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｒｏｓｓ－ｂｒｅｅｄｉｎｇ
ａｎｄ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ　ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ　Ｇ１，ａｎ　ｅａｒｌｙ
ｍａｔｕｒｉｎｇ　ｈｙｂｒｉｄ［Ｊ］．Ａｃｔａ　Ｅｄｕｌｉｓ　Ｆｕｎｇｉ，２００９，１６（４）：
２０－２２．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）
７
ＡＣＴＡ　ＥＤＵＬＩＳ　ＦＵＮＧＩ　 Ｖｏｌ．２０
［８］ＹＡＮ　Ｙ，ＸＵ　ＷＴ，ＳＵ　ＣＹ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ
ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｏｓｔｒｅａｔｕｓ　ｇｅｎｏｍｉｃ
ＤＮＡ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ，２０１１（９）：
１９０－１９３．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　ａｂｓｔｒａｃｔ）
［９］ ＬＩＵ　Ｙ． Ａｓｓｅｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ａｎｄ
ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｙ　ｏｆ　Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ　ｅｄｏｄｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ
ｗｉｌｄ　ｃｏｌｅｃｔｅｄ　ｉｎ　Ｐａｎｘｉ　Ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ
［Ｄ］．Ｙａ’ａｎ：Ｓｉｃｈｕａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
２００８．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［１０］ＬＵ　Ｂ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｔｈｅ
ｉｄｉｏｐｌａｓｍ　ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ　ｅｄｏｄｅｓ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ，
Ｃｈｉｎａ ［Ｄ］． Ｙａ’ａｎ： Ｓｉｃｈｕａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２００９．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［１１］ＲＥＮ　Ｘ，ＪＩＡ　Ｌ，ＹＡＮＧ　ＦＬ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ　ｆｕｓｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉｎ　ｅｄｉｂｌｅ
ｍｕｓｈｒｏｏｍ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｂｕｌｅｔｉｎ，
２００８（２）：４２－４４，５３．（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ
ａｂｓｔｒａｃｔ）
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