全 文 ：
菌物学报
jwxt@im.ac.cn 15 July 2015, 34(4): 653‐661
Http://journals.im.ac.cn Mycosystema ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q © 2015 IMCAS, all rights reserved.
研究论文 Research paper DOI: 10.13346/j.mycosystema.150048
基金项目：国家重点基础研究发展计划（2014CB138305）；国家自然基金项目（31471926）；省技厅项目（20140101149JC）
*Corresponding author. E‐mail: yuli966@126.com; fuyongping81@126.com; 1131444420@qq.com
收稿日期：2015‐02‐10，接受日期：2015‐06‐18
农杆菌介导的刺芹侧耳遗传转化体系的建立
盛立柱 1, 2 宋冰 2 戴月婷 2 李丹 2 付永平 2* 李玉 2*
1吉林农业大学农学院 吉林 长春 130118
2吉林农业大学食药用菌教育部工程中心 吉林 长春 130118
摘 要：以刺芹侧耳菌丝球为受体，潮霉素（Hyg）为筛选标记，应用农杆菌介导法对刺芹侧耳菌丝进行了遗传转化研究。
潮霉素敏感性测试结果表明，刺芹侧耳 Hyg 耐受浓度为 50mg/L。农杆菌介导的刺芹侧耳菌丝最佳遗传转化体系为：菌液
浓度 OD600=0.6–0.7，侵染时间 30–35min，共培养时间 2d，侵染液和共培养培养基中乙酰丁香酮（AS）浓度为 1mg/mL；
经潮霉素抗性筛选、PCR 鉴定和 GUS 活性的组织化学分析，表明外源基因 GUS 已转入到刺芹侧耳菌丝中，并获得表达。
本实验成功地建立了稳定的农杆菌介导的刺芹侧耳遗传转化体系。
关键词：刺芹侧耳，菌丝球，农杆菌，GUS 染色，转化体系
Construction of the genetic transformation system of Pleurotus eryngii by
Agrobacterium‐mediated method
SHENG Li‐Zhu1, 2 SONG Bing2 DAI Yue‐Ting2 LI Dan2 FU Yong‐Ping2* LI Yu2*
1College of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun, Jilin 130118, China
2Engineering Research Center of Chinese Ministry of Education for Edible and Medicinal Fungi, College of Agronomy, Jilin
Agricultural University, Changchun, Jilin 130118, China
Abstract: The mycelial pellets of Pleurotus eryngii were used as receptor for transformation by Agrobacterium‐mediated method,
and the genetic transformation system of P. eryngii was established. Sensitivity test showed that the tolerance concentration for
P. eryngii against hygromycin was 50mg/L. The optimum genetic transformation system for Agrobacterium‐mediated P. eryngii
mycelia was OD600=0.6–0.7 of the bacterial concentration, 30–35min of infection duration, 2 days of the co‐cultivation period
and 1mg/mL of acetosyringone (AS) concentration. The results of PCR identification and the histochemical analysis of
β‐glucuronidase (GUS) activities indicated that the exogenous gene gus was transferred into the mycelia of P. eryngii by
hygromycin resistance selection. A stable Agrobacterium‐mediated genetic transformation system of P. eryngii was constructed
successfully.
Key words: Pleurotus eryngii, mycelium pellet, Agrobacterium, GUS staining, transformation system
刺芹侧耳Pleurotus eryngii (DC.) Quél.（俗称杏 鲍菇）是一种重要的食用菌（戴玉成等 2010），
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在国内外深受广大消费者的喜爱。刺芹侧耳属担子
菌门，伞菌纲，伞菌目，侧耳科，侧耳属。主要分
布于欧洲南部、非洲南部，中亚地区高山、草原、
沙漠地带以及我国四川（九寨沟和长海草地）、青
海、新疆地区（郭美英 1998）。刺芹侧耳菌肉肥
厚，质地脆嫩，特别是菌柄组织致密、结实、乳白，
可全部食用，且菌柄比菌盖更脆滑爽口，被称为
“平菇王”、“干贝菇”，具有杏仁香味及鲍鱼的
口感；而且刺芹侧耳营养丰富，富含各种人体必须
氨基酸、蛋白质、真菌多糖等营养成分（Mori et al.
2008）。1993年，我国开展刺芹侧耳栽培研究，福
建省三明真菌研究所首次从台湾引进来自欧洲的
刺芹侧耳菌株进行栽培（黄年来等 2010）。目前
有关刺芹侧耳的栽培技术、品种选育及活性物质的
提取分析技术都比较成熟，但在遗传转化相关领域
研究还比较薄弱。传统的遗传转化的方法主要有电
击法、基因枪法、限制性内切酶介导整合法、PEG
转化法，这些方法操作复杂、受体材料受限而且转
化效率低（Kim et al. 1999；Sunagawa & Magae
2002；Honda et al. 2000；Irie et al. 2001）。而根癌
农杆菌介导的遗传转化系统是一种天然的转化载
体系统，其操作方便，不需要复杂的仪器设备，转
化成本低而且转化频率高，容易获得单拷贝的转化
菌株，而且重复性较高，其在食用菌转化的受体选
择上具有灵活性，可以以原生质体、菌褶、孢子、
菌丝等作为转化受体材料，因此已成为食用菌的遗
传转化的主要方法（高俊山等 2003；黄亚丽等
2007）。目前，利用农杆菌介导的遗传转化技术已
经应用于糙皮侧耳、草菇、香菇、双孢蘑菇、斑玉
蕈、金针菇、银耳等食用菌中（Ding et al. 2011；
熊盛 2002；喻晶晶 2012；Chen et al. 2000；Zhang
et al. 2014；李巍等 2011；郭丽琼 2008），而国内
关于刺芹侧耳农杆菌介导的遗传转化研究还未有
报道，而且农杆菌的转化效率受诸多因素的影响，
受体材料、农杆菌菌株、培养时间及培养条件、培
养基及培养温度、AS浓度等都会影响农杆菌介导
法的转化效率。本文将使用农杆菌介导法对刺芹侧
耳菌丝球进行遗传转化研究，通过试验将转化条件
进行优化，以期获得一个高效的刺芹侧耳遗传转化
系统，从而拓展和丰富刺芹侧耳的相关研究，旨在
为今后食用菌的分子育种研究奠定良好基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒：刺芹侧耳 Pleurotus eryngii 品种
“嘉田”由吉林农业大学食药用菌教育部工程研
究中心提供。农杆菌 EHA105、植物表达载体
pCAMBIA1301，由吉林农业大学食药用菌教育部工
程研究中心保存。
1.1.2 培养基：MYG 固体/液体培养基：葡萄糖 10g，
麦芽糖 5g，酵母浸粉 5g，琼脂粉 10g（固体），加
ddH2O 定容至 1 000mL，pH 值自然，121℃ 高压
灭菌。共培养基：葡萄糖 10g，麦芽糖 5g，酵母浸
粉 5g，琼脂粉 10g，加 ddH2O 定容至 1 000mL，
pH 值自然，121℃，高压灭菌后加入 1mL 乙酰丁
香酮（AS）。筛选培养基：葡萄糖 10g，麦芽糖 5g，
酵母浸粉 5g，琼脂粉 10g，加 ddH2O 定容至
1 000mL，pH 值自然，121℃高压灭菌，灭菌后根
据不同的浓度梯度加入不同浓度的 AS、潮霉素
（Hyg）、头孢霉素（Cef）。侵染液：麦芽糖 10g，
葡萄糖 5g，酵母浸粉 5g，加 ddH2O定容至 1 000mL，
pH 值自然，121℃高压灭菌，灭菌后加入 1 000mg
AS。YEP 培养基：NaCl 5g，酵母浸粉 10g，胰蛋白
胨 10g，琼脂粉 10g，pH7.0，121℃，高压灭菌。
1.1.3 化学试剂：本实验所用的 DNA 提取试剂盒、
质粒提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限
公司；PCR 引物合成及测序交由鼎国生物技术有限
责任公司完成；卡那霉素（Kan）、AS、Hyg 等购自
Sigma 公司；其他化学试剂均为国产分析纯。
1.1.4 PCR 引物：根据已知的 GUS 基因序列，通过
生物信息学分析软件 Primier5.0设计人工寡核苷酸
扩增引物，引物交由鼎国生物技术有限责任公司合
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成。上游引物：5‐TCGATC CCTATA CCTTCT TCGTC‐3，
下游引物：5‐TTAAGG AGACTT GTACCAC C‐3。
1.2 方法
1.2.1 潮霉素浓度筛选试验：选择实验菌株“嘉
田”接种于 MYG 固体培养基中，进行菌种活化培
养，待菌丝长满 2/3 平板，将菌丝切成 1cm×2cm
大小的菌块，接种于新的固体 MYG 培养基中，于
25℃恒温培养箱中培养待用。配制含有不同潮霉素
浓度（0mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、
50mg/L、60mg/L）的 MYG 固体培养基，每个浓度
梯度至少 5 个平行，在超净工作台中接种，放于
25℃培养箱中培养。
1.2.2 刺芹侧耳受体材料的准备：在无菌环境下，
挑取少量刺芹侧耳菌丝，接种于含有 50mL MYG 液
体培养基的 150mL 的三角瓶中，密封后，置于 25℃
摇床中，150r/min 振荡培养 5–10d，在培养基内出
现大量菌丝球则可停止摇菌。用无菌水冲洗并收集
刺芹侧耳菌丝球，用于农杆菌介导的刺芹侧耳的遗
传转化。
1.2.3 农杆菌工程菌液的制备：利用质粒提取试剂
盒提取植物表达载体 pCAMBIA1301 的质粒 DNA，
采用冻融法将其转入农杆菌 EHA105的感受态细胞
中，于 28℃在含有 kan 的 YEP 筛选培养基中培养，
获得单菌落的转化子，利用菌落 PCR 方法，检测
阳性转化子。PCR 反应体系为：10×PCR Buffer（Mg2+
plus）2.5μL；dNTP Mixture（2.5mmol/L）2.5μL；
上游引物（50pmol/L）0.5μL；下游引物（50pmol/L）
0.5μL；模版 1μL；MBI Taq（5U/L）0.25μL，加水
补足 25μL。以质粒 DNA 作为阳性对照。PCR 反应
条件为 94℃预变性 5min；94℃变性 40s，54℃退
火 40s，72℃延伸 50s，30 个循环；最后 72℃延伸
8min。反应结束后，进行 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
挑取 PCR 鉴定正确的农杆菌 EHA105（带有
pCAMBIA1301）的单菌落接种于含 100mg/L Kan 的
5mL YEP 液体培养基中，于 28℃ 210r/min 小摇振
荡培养过夜，然后将其转入 50mL 液体 YEP 培养基
中振荡培养，培养至 OD600 值为 0.7 左右，停止
摇菌。
1.2.4 刺芹侧耳菌丝球的转化与筛选：将摇好的菌
丝球浸到农杆菌工程菌液中，侵染 30min，每隔
5min 震荡一次，让侵染液与菌丝球充分接触。取
出菌丝球，放在无菌滤纸上吸干侵染液后，置于含
有乙酰丁香酮（AS）的 MYG 共体培养基上，25℃
培养箱中共培养 2d，同时将未转化的菌丝球做同
样处理，以作对照。
农杆菌菌液浓度对刺芹侧耳遗传转化的影响：
用浓度 OD600分别为 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、
0.8 的菌液分别侵染刺芹侧耳菌丝球。侵染后放置
于含有 1mg/mL AS 的共培养基上 25℃共培养 2d，
选择生长良好的菌丝球，接种于含有 50mg/L Hyg、
100mg/L 头孢霉素、100mg/L 羧苄的 MYG 筛选培
养基中，筛选抗性转化子，测定最佳刺芹侧耳菌丝
球农杆菌侵染浓度。
共培养时 AS 浓度对刺芹侧耳转化的影响：将
侵染好的刺芹侧耳菌丝球接种于含有 AS 浓度为
0mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL
的 MYG 固体共培养基上，以未侵染的刺芹侧耳菌
丝球作为对照，观察不同浓度的 AS 下刺芹侧耳菌
丝球的生长情况，确定刺芹侧耳农杆菌转化的最佳
AS 浓度。
1.2.5 筛选：共培养 2d 后，转化的菌丝球周围长
出肉眼可见的菌落，将菌丝球移至含有 Hyg的MYG
筛选培养基上，25℃培养箱中培养，同时将未转化
的菌丝球进行同样处理作为对照，15d 后更换一次
培养基，进行第二次筛选。第二次筛选后能成功存
活的菌株重新接种到含Hyg的MYG固体培养基上，
于 25℃培养箱中培养，长满平皿后转接入无 Hyg
的 MYG 培养基中继代培养。
1.2.6 刺芹侧耳基因组DNA的提取：经Hyg筛选后，
在无选择压力的 PDA 固体培养基上继代培养 4–5
次后，选择生长良好的转化子，利用基因组提取试
剂盒提取其基因组 DNA。
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1.2.7 阳性转化子的 PCR 检测：以提取的刺芹侧耳
基因组 DNA为模板，用 GUS基因特异引物进行 PCR
扩增，以质粒 DNA 作为阳性对照，未转化菌丝球
的基因组 DNA 为阴性对照。PCR 反应体系和反应
条件同上。反应结束后，进行 1%琼脂糖凝胶电泳
检测。
1.2.8 GUS 活性的组织染色分析：参照 Jefferson
（1987）的方法并作改动。菌丝材料在固定液 I
（0.1mol/L 磷酸钠缓冲液、pH7.0、0.1%甲醛、0.1%
TritonX‐100、0.1% β‐巯基乙醇）中固定 30min（抽
真空）。用洗液Ⅰ（0.1mol/L 磷酸钠缓冲液、0.1% β‐
巯基乙醇）和洗液Ⅱ（0.05mol/L 磷酸钠缓冲液、
0.1% β‐巯基乙醇）冲洗数次。材料冲洗干净后，
直接置于 GUS 染色液（0.1mol/L 磷酸钠缓冲液、
10mmol/L EDTA、0.5mmol/L 铁氰化钾、0.5mmol/L
亚铁氰化钾、1mmol/L X‐Gluc、0.1% TritonX‐100）
中，染色 16h。取出材料，放入 FFA 固定脱色液（5%
甲醛、5%乙酸、5%乙醇）中 20min。白色背景上
的蓝色斑点即为 GUS 表达位点，照相记录结果。
染色后的材料可浸入含 80%乙醇的 FAA 固定液中
保存。
2 结果与分析
2.1 刺芹侧耳菌丝 Hyg 筛选压力的确定
将刺芹侧耳菌丝接种于含有不同潮霉素浓度
梯度（5mg/L、10mg/L、20mg/L、30mg/L、40mg/L、
50mg/L）的 MYG 固体培养基后，25℃培养箱培养
5–10d，观察菌丝生长状态，直至 Hyg 浓度为
50mg/L 时菌丝几乎不生长，因此选择 50mg/L 为后
续农杆菌转化的筛选浓度（图 1）。
2.2 农杆菌工程菌的获得
将 pCAMBIA1301 的质粒 DNA 转入农杆菌
EHA105 中，获得单菌落的转化子。GUS 基因的
PCR 检测结果（图 2）显示获得与目的基因大小相
同的特异条带，表明 pCAMBIA1301 成功转入
EHA105 中，含有 GUS 标记基因的农杆菌工程菌
构建成功。
图 1 刺芹侧耳菌丝潮霉素筛选压力的确定
Fig. 1 Screening efficiency of Pleurotus eryngii mycelia under
different concentration of hygromycin. A: 5mg/L; B: 10mg/L;
C: 20mg/L; D: 30mg/L; E: 40mg/L; F: 50mg/L.
图 2 农杆菌工程菌的 PCR 鉴定 M：DL2000 DNA marker；
1：农杆菌菌落 PCR；2：质粒对照.
Fig. 2 PCR identification of Agrobacterium engineering
bacteria. M: DL2000 DNA marker; 1: PCR of monoclonal
colony; 2: Positive control of plasmid pCAMBIA 1301.
2.3 农杆菌菌液浓度对刺芹侧耳遗传转化的影响
农杆菌的菌液浓度是影响遗传转化的主要因
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素，适当地增加农杆菌的菌液浓度，可提高转化
率。当 OD600=0.6–0.7 时，获得的转化子比较多，
当 OD600=0.2–0.4 或者大于 0.8 时，转化子的数量
明 显 呈 下 降 趋 势 。 因 此 选 择 菌 液 浓 度
OD600=0.6–0.7 之间作为刺芹侧耳遗传转化的最佳
菌液浓度（图 3）。
2.4 共培养时 AS 浓度对刺芹侧耳遗传转化的影响
从图 4 中可以看出，当不添加 AS 时，几乎没
有转化子，随着 AS 浓度的增加，转化子的数目也
不断增加，当 AS 浓度达到 1mg/mL 时，转化子数
目最多，而当 AS 浓度超过 1mg/mL 时转化子的数
目随着 AS 的浓度的增加而呈减小趋势。
2.5 农杆菌介导的刺芹侧耳菌丝遗传转化
将摇好的菌球放在漏斗中，漏出培养液，将菌
球放在制备好的工程菌液中。本研究确定的遗传转
化 体 系 为 侵 染 时 间 30–35min ， 菌 液 浓 度
OD600=0.6–0.7 之间，共培养时间 2d，AS 浓度
1mg/mL，然后将材料转到潮霉素浓度为 50μg/mL
筛选培养基上，筛选培养 15d 左右，就可观察到
有抗性菌丝长出（图 5）。
2.6 转化子的 PCR 检测
经过 Hyg 筛选后，选取能够再生的转化子，
提取菌丝总 DNA，并以此为模板，利用 GUS 基因
特异性引物进行 PCR 检测（图 6）。共有 20 个转化
子扩增出一条 1 000bp 左右的特异条带，与阳性质
粒作为模板的 PCR 扩增条带大小相同，而非转化
的对照菌株则无此特异带，初步表明 GUS 基因已
转入刺芹侧耳菌丝中。
2.7 转基因刺芹侧耳 GUS基因表达的组织化学分析
用 X‐Gluc 作为底物，把待测材料浸泡在含有
底物的缓冲液中保温，结果表明转化菌株菌丝中具
有 GUS 活性部位呈现蓝色，非转化菌丝无色，可
用肉眼或在显微镜下观察到。在实验过程中，做了
严格的阴性对照，即用未转化刺芹侧耳的菌丝进行
相同方法的染色，消除本底影响。结果表明外源基
因 GUS 已转入到刺芹侧耳菌丝中，并获得了正确
表达（图 7）。
图 3 菌液浓度对遗传转化的影响
Fig. 3 Effects of bacterial concentration on genetic
transformation of Pleurotus eryngii.
图 4 共培养时 AS 浓度对遗传转化的影响
Fig. 4 Effects of the acetosyringone (AS) concentration on
genetic transformation of Pleurotus eryngii.
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图 5 刺芹侧耳的遗传转化
Fig. 5 Genetic transformation of Pleurotus eryngii.
图 6 转化子的 PCR 检测 M：DNA 分子量标记；1：阴性对照；2：阳性对照；3–24：再生抗性转化子.
Fig. 6 PCR identification of transformants. M: DL2000 DNA marker; 1: The non‐transformed transformants as negative control; 2:
The plasmid pCAMBIA 1301 as positive control; 3–24: Putative transformants.
图 7 β‐葡糖醛酸酶（GUS 染色） A，B：肉眼观察；C：
转化菌株；D：非转化菌株（阴性对照）.
Fig. 7 β‐glucuronidase (GUS)‐stained mycelia of Pleurotus
eryngii. A, B: Visual observation; C: Transgenic mycelia; D:
Non‐transgenic mycelia (negative control).
3 讨论
目前有关刺芹侧耳的研究多集中在栽培技术
（Moonmoon et al. 2010）、品种选育（刘宇等 2004）
及活性物质的提取分析（张化朋 2013）上，在遗
传转化相关领域研究还比较薄弱。Chung et al.
（2011）以 Hyg 为抗性筛选标记，利用农杆菌介
导法，以刺芹侧耳子实体为受体，表达了人类白介
素基因。2012 年，尹永刚以刺芹侧耳原生质体为
受体材料，利用 PEG 介导法建立了刺芹侧耳原生
质体的遗传转化体系，并确定了刺芹侧耳原生质体
的 Hyg 耐受浓度（Yin et al. 2012）。不同的受体材
料会影响转化效率，以草菇的破碎的菌丝、孢子、
菌褶以及菌丝球为受体，结果表明破碎的菌丝在再
生培养基上不生长，菌褶和孢子的再生能力也很
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低，但菌丝球在共培养基上的再生能力可达到
100%（孙运奇 2014）。本实验采用刺芹侧耳的菌
丝球为受体材料，相对于以原生质体和子实体为受
体来说，菌丝球更容易获得，而对于在无子实体的
情况下，以菌丝球为受体更方便。由于实验所用的
刺芹侧耳菌株不同，故不能简单地对转化效率进行
比较。
载体质粒不同，同样会影响转化效率，本实验
采用的是单载体转化，而 Chung et al.（2011）则
是采用的双载体转化使报告基因与筛选标记基因
在受体菌中同时表达，这样会造成转化效率的降
低，而本实验的单载体转化可避免此缺点。本实验
采用农杆菌介导法转化刺芹侧耳菌丝球，通过 Hyg
抗性筛选实验，获得了 20 个阳性转化子。以菌丝
球为受体相对于其他材料来说比较便捷。
AS 能够提高农杆菌对受体菌的敏感度，促进
根癌农杆菌对受体的转化率。而一般认为食用菌自
身不能产生 AS，从而需要外援添加 AS 来促进农杆
菌对食用菌的转化。但并非所有的食用菌都是如
此，据有关虫草的农杆菌转化的报道，不添加 AS
对转化效率的影响不大（Zheng et al. 2011），本实
验对转化的刺芹侧耳菌丝球同时接种于不含有 AS
的共培养基中和含有 AS 的共培养基中，结果发现
刺芹侧耳转化子的数目在不含有 AS 的共培养基中
明显低于含有 AS 的。因此，在农杆菌介导的刺芹
侧耳的遗传转化中，AS 的添加是有必要的，本实
验确定的 AS 最佳浓度为 1mg/mL，与之前的报道
其他丝状真菌的遗传转化需要 AS 诱导的结论一
致，然而农杆菌的转化过程中是否需要 AS 的诱导
目前还没有统一的结论。
农杆菌菌液浓度是影响农杆菌转化的一个重
要的因素。农杆菌浓度过低会影响转化效率，而农
杆菌浓度过高在抗性筛选的过程中就会造成农杆
菌过度生长的状况，因此无法抑制农杆菌的生长，
最终会影响转化子的生长，造成转化率的降低。因
此确定最佳的农杆菌转化浓度是十分必要的。根据
之前的报道，草菇所需的最佳农杆菌浓度 OD 值为
0.15（王杰等 2010），糙皮侧耳的最佳农杆菌浓度
OD 值为 0.2（段庆虎 2013），而本实验确定了刺
芹侧耳的农杆菌浓度 OD 值高达 0.6–0.7 时，转化
效率最高，可见不同食用菌的农杆菌转化浓度是不
同的，需要通过试验来获得最适合的浓度范围。
本实验确定了刺芹侧耳菌丝球农杆菌转化体
系为：Hyg 耐受浓度为 50μg/mL，农杆菌菌液浓度
为 OD600=0.6–0.7 之间，侵染时间为 30–35min，共
培养时间为 2d，共培养时 AS 的最佳诱导浓度为
1mg/mL。对转化子提取基因组 DNA 并进行 PCR 鉴
定，结果表明外源基因 GUS 已转入到刺芹侧耳中，
从而证明刺芹侧耳遗传转化系统构建成功。组织化
学 GUS 染色结果表明，转基因刺芹侧耳菌丝中具
有很强的 GUS活性，从而进一步证明外源基因 GUS
已转入到刺芹侧耳中。在真菌上，农杆菌介导法的
遗传转化率比传统的 PEG 法高出 600 倍（DeGroot
et al. 1998）。本实验成功将农杆菌介导的遗传转化
方法应用到重要的栽培食用菌刺芹侧耳中，从而拓
展和丰富刺芹侧耳的相关研究，为后续食用菌的分
子育种研究奠定良好基础。尽管抗性筛选标记在食
用菌的遗传转化中具有良好的筛选效果，但抗性选
择标记会存留在食用菌中，存在莫大的生物安全隐
患，因此寻找安全、高效的选择标记基因是我们今
后工作中应该努力的方向。
[REFERENCES]
Chen X, Stone M, Schlagnhaufer C, Romaine CP, 2000. A
fruiting body tissue method for efficient
Agrobacterium‐mediated transformation of Agaricus
bisporus. Applied and Environmental Microbiology,
66(10): 4510‐4513
Chung SJ, Kim S, Sapkota K, Choi BS, Shin C, Kim SJ, 2011.
Expression of recombinant human interleukin‐32 in
Pleurotus eryngii. Annals of Microbiology, 61(2): 331‐338
Dai YC, Zhou LW, Yang ZL, Wen HA, Bau T, Li TH, 2010. A
revised checklist of edible fungi in China. Mycosystema,
29: 1‐21 (in Chinese)
ISSN1672‐6472 CN11‐5180/Q Mycosystema July 15, 2015 Vol. 34 No. 4
http://journals‐myco.im.ac.cn
660
DeGroot MJA, Bundock P, Hooykaas PJJ, Beijersbergen AGM,
1998. Agrobacterium tumefaciens‐mediated
transformation of filamentous fungi. Nature
Biotechnology, 16(9): 839‐842
Ding Y, Liang S, Lei JH, Chen LG, Kothe E, Ma AM, 2011.
Agrobacterium tumefaciens mediated fused egfp‐hph gene
expression under the control of gpd promoter in Pleurotus
ostreatus. Microbiological Research, 166: 314‐322
Duan QH, 2013. Cloning and analysis of chitinase gene
(PoChil) from Pleurotus ostreatus. Master Thesis, Henan
Agriculture University, Zhengzhou. 1‐62 (in Chinese)
Gao JS, Lin Y, Ye XG, Ma CX, 2003. Summary of the techniques
and methods of plant gene transformation. Journal of
Anhui Agricultural Sciences, 31(5): 802‐805 (in Chinese)
Guo LQ, Liu EX, Wang J, Lin JF, 2008. Development of highly
efficient genetic transformation system of yeast‐like
conidia of Tremella fuciformis. Scientia Agricultura Sinica,
41(11): 3728‐3734 (in Chinese)
Guo MY, 1998. Biological characteristics of a valuable
mushroom, Pleurotus eryngii. Fujian Journal of
Agricultural Sciences, 13(3): 44‐49 (in Chinese)
Honda Y, Matsuyama T, Irie T, Watanabe T, Kuwahara M, 2000.
Carboxin resistance transformation of the
homobasidiomycete fungus Pleurotus ostreatus. Current
Genetics, 37(3): 209‐212
Huang NL, Lin ZB, Chen GL, 2010. Medicinal and edible fungi.
Shanghai Science and Technology Press, Shanghai. 10:
1208‐1228 (in Chinese)
Huang YL, Ye J, Jiang XL, Guo P, Tian YL, Li JP, Zhu CX, 2007.
Transformation in filamentous fungi mediated by
Agrobacterium tumefaciens. Biotechnology Bulletin,
2007(3): 111‐114 (in Chinese)
Irie T, Honda Y, Hirano T, Sato T, Enei H, Watanabe T,
Kuwahara M, 2001. Stable transformation of Pleurotus
ostreatus to hygromycin B resistance using Lentinus
edodes GPD expression signals. Applied Microbiology
and Biotechnology, 56(10): 707‐709
Jefferson RA, 1987. Assaying chimeric genes in plants: the
GUS gene fusion system. Molecular Biology Reporter,
5(4): 387‐405
Kim BG, Magae Y, Yoo YB, Kwan ST, 1999. Isolation and
transformation of uracil auxotrophs of the edible
basidiomycete Pleurotus ostreatus. FEMS Microbiology
Letters, 181(2): 225‐228
Li W, Liu XM, Li HZ, Jiang Y, Du ML, Zhu HL, Wang Y, Li TH, Li
HY, Li XK, 2011. Transformation of Flammulina velutipes
with a basic fibroblast growth factor (bFGF) by
Agrobacterium tumefaciens. Mycosystema, 30(1): 46‐53
(in Chinese)
Liu Y, Chen WL, Wang LZ, Meng LL, 2004. A preliminary study
on the crossbreeding of hybrid strain No. 13 of Pleurotus
eryngii. Acta Edulis Fungi, 11(3): 61‐64 (in Chinese)
Moonmoon M, Uddin MN, Ahmed S, Shelly NJ, Khan MA,
2010. Cultivation of different strains of king oyester
mushroom (Pleurotus eryngii) on saw dust and rice
straw in Bangladesh. Saudi Journal of Biological Science,
17(4): 341‐345
Mori K, Kobayashi C, Tomita T, Inatomi S, Ikeda M, 2008.
Antiatherosclerotic effect of the edible mushrooms
Plerotus eryngii (Eringi), Grifola frondosa (Maitake), and
Hypsizygus marmoreus (Bunashimeji) in apolipoprotein
E‐deficient mice. Nutrition Research, 28(5): 335‐342
Sun YQ, Zhang JJ, Feng ZY, Chen MJ, Wang H, Chen H, 2014.
Agrobacterium‐mediated transformation of edible fungi.
Acta Edulis Fungi, 21(1): 69‐75 (in Chinese)
Sunagawa M, Magae Y, 2002. Transformation of the edible
mushroom Pleurotus ostreatus by particle bombardment.
FEMS Microbiology Letters, 211(2): 143‐146
Wang J, Lin JF, Guo LQ, 2010. Assessment of factors affecting
the transformation efficiency of Volvariella volvacea
mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of
South China Agricultural University, 31(1): 39‐41 (in
Chinese)
Xiong S, 2002. Establishment of transformation system of
Volvariella volvacea. Master Thesis, South China
University of Tropical Agriculture, Danzhou. 29‐37 (in
Chinese)
Yin YG, Liu Y, Jin HJ, Wang SX, Zhao X, Geng XL, Li M, Xu F,
2012. Polyethylene glycol‐mediated transformation of
fused egfp‐hph gene under the control of gpd promoter
in Pleurotus eryngii. Biotechnology Letter, 34(10):
1895‐1990
盛立柱 等 /农杆菌介导的刺芹侧耳遗传转化体系的建立
菌物学报
661
Yu JJ, 2012. Construction of Agrobacterium‐mediated
transformation system in Lentinula edodes. Master Thesis,
Huazhong Agriculral University, Wuhan. 35‐42 (in Chinese)
Zhang HP, 2013. Analysis of nutritional components and
bioactive substances of Pleurotus eryngii. Acta
Nutrimenta Sinica, 35(3): 307‐309 (in Chinese)
Zhang JJ, Shi L, Chen H, Sun YQ, Zhao MW, Ren A, Chen MJ,
Wang H, Feng Z, 2014. An efficient
Agrobacterium‐mediated transformation method for the
edible mushroom Hypsizygus marmoreus.
Microbiological Research, 169: 741‐748
Zheng Z, Huang C, Cao L, Xie C, Han R, 2011. Agrobacterium
tumefaciens‐mediated transformation as a tool for
insertional mutagenesis in medicinal fungus Cordyceps
militaris. Fungal Biology, 115(3): 265‐274
[附中文参考文献]
戴玉成，周丽伟，杨祝良，文华安，图力古尔，李泰辉，
2010. 中国食用菌名录. 菌物学报，29: 1‐21
段庆虎，2013. 平菇几丁质酶基因PoChil的克隆与分析 .
河南农业大学硕士论文，郑州. 1‐62
高俊山，林毅，叶兴国，马传喜，2003. 植物转基因技术
和方法概述. 安徽农业科学，31(5): 802‐805
郭丽琼，刘二鲜，王杰，林俊芳，2008. 高效银耳芽孢遗
传转化体系的建. 中国农业科学，41(11): 3728‐3734
郭美英，1998. 珍稀食用菌杏鲍菇生物学特性的研究. 福
建农业学报，13(3): 44‐49
黄年来，林志彬，陈国良，2010. 中国食药用菌学. 上海：
上海科学技术文献出版社. 10: 1208‐1228
黄亚丽，叶婧，蒋细良，郭平，田云龙，李记鹏，朱昌雄，
2007. 根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展.
生物技术通报，2007(3): 111‐114
李巍，刘秀明，李洪志，江莺，杜美丽，朱海林，王一，
李天航，李海燕，李校堃，2011. 农杆菌介导的碱性
成纤维细胞生长因子（bFGF）转化金针菇的研究. 菌
物学报，30(1): 46‐53
刘宇，陈文良，王丽珍，孟莉莉，2004. 杏鲍菇13号菌株
杂交选育研究. 食用菌学报，11(3): 61‐64
孙运奇，张津京，冯志勇，陈明杰，汪虹，陈辉，2014. 根
癌农杆菌介导的食用菌转化研究. 食用菌学报，21(1):
69‐75
王杰，林俊芳，郭丽琼，2010. 影响农杆菌介导草菇遗传
转化的因素研究. 华南农业大学学报，31(1): 38‐41
熊盛，2002. 草菇遗传转化体系建立的研究. 华南热带农
业大学硕士学位论文，儋州. 29‐37
喻晶晶，2012. 农杆菌介导的香菇遗传转化体系构建. 华
中农业大学硕士学位论文，武汉. 35‐42
张化朋，2013. 杏鲍菇营养成分及生物活性物质分析. 营
养学报，35(3): 307‐309