全 文 ：第 34卷　第 4期 林　业　科　技 Vol.34　No.4
2 0 0 9年 7月 FORESTRYSCIENCE＆ TECHNOLOGY July　 2 0 0 9
文章编号:1001-9499 (2009)04-0075-03
兴安白芷茎水溶性成分 HPLC图谱分析
邓小华 1　王　萍2　张伟明1
(1.黑龙江省林业科学院 , 哈尔滨　150081; 2.东北林业大学 , 黑龙江　哈尔滨　 150040)
摘要:以兴安白芷茎水溶性化学成分为研究对象 , 运用 HPLC指纹图谱的分析方法 , 考察了洗脱时间 、 柱温 、
流速 、 检测波长 、 进样量对 HPLC图谱质量的影响。结果表明 , 以 HypersilGOLDC18柱为色谱柱 , 甲醇 -2%甲
酸为流动相梯度洗脱 , 紫外检测波长: 340nm, 柱温:25°C, 进样量:20μL, 流速:1mL/min, 洗脱时间:
82min为洗脱条件 , 各色谱峰响应较均匀 , 色谱信息较全 , 分离度好 , 保留时间适中。
关键词:兴安白芷;水溶性物质;HPLC图谱
中图分类号:S567.23 +9　　　　文献标识码:A
　　兴安白芷 (Angelicadahurica)为伞形科当归
属多年生草本植物 , 又名大活 、走马芹 、 走马芹
筒子等 , 主要分布在我国东北和内蒙古东部 [ 1] 。
兴安白芷的根作为 “香大活 ” 或 “独活 ” 入药 ,
能发表 、祛风除湿 , 用于治疗伤风头痛 、 风湿性
关节痛及腰腿酸痛等症。中药指纹图谱分析技术
是目前对中药材和制剂进行质量监控的重要手段 ,
它能全面 、 综合地反映中药质量 , 虽然它不能代
替含量测定 , 但比测定任何单一成分所提供的信
息却丰富和有用得多 [ 2, 3] 。本研究利用 HPLC技术
对兴安白芷茎的水溶性化学成分进行了研究 , 确
定了最优的分析方法 。
1　仪器与材料
美国 Waters高效液相色谱仪 (色谱柱为
HypersilGOLDC18柱 , 250 mm×4.6 mm, 5μm,
2996型二极管阵列检测器)、 RE-52C型旋转蒸
发仪 (巩义市英峪子华仪器厂)、 TDL-40B型离
心机 (上海立亭科学仪器厂 )、 柱色谱用硅胶
(青岛海洋化工厂 )、 甲醇和乙腈为色谱纯
(Burdick＆Jackson公司), 实验用水为超纯水 , 其
他试剂均为分析纯。
兴安白芷采集于黑龙江省塔河林业局十八站
林场 , 阴干备用 。由东北林业大学植物教研室鉴
定为兴安白芷的茎。
2　方法与分析
2.1　供试品溶液的制备
取兴安白芷茎粉碎过 40目筛 , 得粗粉 1kg。
将粗粉置于 8倍量的 70%的 EtOH中连续回流提
取 2次 , 每次回流时间为 1.5h。回流完成后经过
滤 , 减压蒸馏回收 EtOH至小体积 , 得 EtOH提取
液 。取 EtOH提取液分别用 Et2O、 EtOAc萃取 ,
至萃取液呈淡黄色。水层减压蒸馏浓缩至小体积 ,
把浓缩液 (相当于干膏 45g)用 60 ～ 80目硅胶
(约 1∶10)吸附 , 得到的粗孔硅胶分别用 CHCl3∶
MeOH(10∶1 , 1∶1 , 0∶1)进行梯度洗脱 , 得 3个
洗脱液 , 并分别记为 F1 、 F2、 F3, 本实验以 F2
(8.9 g)为供试液 。
2.2　洗脱条件的确定
2.2.1　流动相的选择
选取甲醇 -水 , 甲醇 -醋酸 /醋酸钠缓冲溶液
(pH4.5), 甲醇 -2%甲酸水溶液为流动相 , 其
中甲醇在 60min之内由 5%线性升高至 100%进行
梯度洗脱 (图 1)。洗脱条件为:流速:1mL/min;
进样量:20μL;柱温:室温;洗脱时间:60min;
检测波长 210 ～ 400nm。结果表明:流动相以甲醇
-2%甲酸水溶液梯度洗脱为最佳 , 各色谱峰分离
度好 , 保留时间适宜 。因此 , 选定甲醇 -2%甲酸
水溶液作为流动相。
林　业　科　技 第 34卷
图 1　不同流动相 HPLC谱图
横坐标为时间 /min, 纵坐标为峰面积响应值 /mAU(下同)
2.2.2　流动相梯度和洗脱时间的选择
以甲醇 -2%甲酸水溶液为流动相 , 在检测波
长 210 ～ 400nm、 洗脱流速 1 mL/min、 进样量为
20μL、 室温条件下 , 设定洗脱梯度和选择洗脱时
间 。为使各色谱峰分离度好 , 保留时间适宜 , 首
先考察洗脱时间为 2h, 甲醇从 5%线性至 100%
(图 2)。然后根据各色谱峰的分离度 , 通过改变
流动相的极性 , 使样品中所有组分可在最短时间
内实现最佳分离 (图 3)。最后确定洗脱梯度为 0
～ 3min, 甲醇 3% ～ 21%;3 ～ 80min, 甲醇 21%
～ 36%;80 ～ 82min, 甲醇 36% ～ 100%为最佳 。
由色谱图 (图 4)可见 , 82min后指纹图谱中没有
明显色谱峰出现 , 说明洗脱时间定为 82min比较
适合。
图 2　线性梯度洗脱 HPLC谱图
0～ 120min, 甲醇 5% ～ 100%
图 3　梯度洗脱 HPLC谱图
0 ～ 5min, 甲醇 3% ～ 21%;3～ 115min,
甲醇 21%～ 43%;115～ 120min, 甲醇 43%～ 100%
2.2.3　柱温的选择
上述条件不变的前提下 , 分别记录柱温为
20、 25、 30℃时的色谱图 , 发现图谱无明显变化 ,
图 4　梯度洗脱 HPLC谱图
0 ～ 3min, 甲醇 3% ～ 21%;3～ 80min,
甲醇 21%～ 36%;80～ 82min, 甲醇 36%～ 100%
只是出峰时间稍有提前 , 说明温度不是影响指纹
图谱质量的主要因素 , 因此柱温选定为 25℃。
2.2.4　流速的选择
以流速 0.8、 1.0、 1.2mL/min进行梯度洗脱
结果 (图 5)表明 , 柱温 25℃, 流速 1.0mL/min
时 , 各色谱峰分离度好 , 保留时间适中 。
图 5　3种流速 HPLC谱图
2.2.5　检测波长的选择
Waters二极管阵列检测器检测的结果 (图 6)
表明 (波长 210 ～ 400nm), 样品的三维 HPLC图
在波长为 340nm时 , 各主要峰均有较大吸收 , 各
色谱峰响应较均匀 , 色谱信息较全 , 故选择
340nm为检测波长 。
图 6　不同检测波长样品 HPLC谱图
2.2.6　进样量的选择
分别选择 5、 10、 20μL进样的结果 (图 7)
表明 , 进样量为 20μL时 , 最高色谱峰的吸收位在
500mAU左右 , 高度适中 , 故确定进样量为 20μL。
2.2.7　验证实验
综合上述实验可知 , 最优色谱条件为流动相:
甲醇 -2%甲酸梯度 (表 1);洗脱时间:82min;
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第 4期 邓小华等:兴安白芷茎水溶性成分 HPLC图谱分析
图 7　3种进样量 HPLC谱图
柱温:25℃;流速:1mL/min;检测波长:340nm;
进样量:20μL, 其色谱图各色谱峰响应较均匀 , 色
谱信息较全 , 分离度好 , 保留时间适中 (图 8)。
表 1　甲醇 -2%甲酸水溶液最佳洗脱条件
%
时间 /min 0 3 80 82
甲醇 (V/V) 5 21 36 100
2%甲酸 (V/V) 95 79 64 0
图 8　最优色谱条件下 HPLC谱图
3　方法学考证
重现性实验　取同一批药材供试品 5份 , 以
优选的洗脱条件进行洗脱 , 进样并记录色谱图 ,
以色谱峰 (Rt16min)为参照 , 考察色谱峰相对
保留时间的一致性。结果各色谱峰相对保留时间
的 RSD<3% , 符合指纹图谱技术要求。
精密度实验　取同一份供试液连续进样 5次 ,
以色谱峰 (Rt16min)为参照 , 考察色谱峰保留
时间的一致性 , 计算各共有峰相对保留时间的
RSD。结果 RSD<3%, 符合指纹图谱技术要求 。
　　稳定性实验 　取同一份供试液 , 分别在 0、
2、 4、 8、 24h进样测定 , 以色谱峰 (Rt16min)
为参照 , 各色谱峰的相对保留时间均在平均值的
±1 min之内 , 且峰面积的 RSD% <3%。结果表
明 , 兴安白芷供试品溶液在 24 h内稳定。
4　结论及讨论
4.1　兴安白芷茎水溶性成分 HPLC图谱的最佳洗
脱条件为流动相:甲醇 -2%甲酸梯度 , 洗脱时
间:82min, 柱温:25°C, 流速:1.0mL/min, 检
测波长:340nm, 进样量:20μL, 所得色谱图各
色谱峰分离度好 , 保留时间适中。
4.2　在流动相配比及梯度选择上 , 由于化合物成
分复杂 , 用单一流动相洗脱 , 得到的色谱图各峰
无法分离 , 梯度洗脱可以使不同极性的各成分有
效分离 。实验表明 , 2%的甲酸加入到流动相中可
以改善峰形 , 从而改善分离效果 。当然 , 梯度洗
脱的缺点是常引起基线漂移 , 本实验中也存在此
问题 , 且对峰面积的 RSD有一定的影响。增加进
样量可以减弱基线漂移程度 , 但过大会导致色谱
柱超载 , 色谱峰峰宽增加 、 峰尖钝化 , 影响色谱
柱使用寿命 , 故应选择适当的进样量。
参 考文 献
[ 1] 　曾建飞.中国高等植物图鉴第三册 [ M].北京:科学出
版社 , 2002.
[ 2] 　周玉新.中药指纹图谱研究技术 [ M] .北京:化学工业
出版社 , 2002.
[ 3] 　聂磊 , 曹进 , 罗国安 , 等.中药指纹图谱相似度评价方法
的比较 [ J] .中成药 , 2005, 27 (3): 249-252.
[ 4] 　王梦月 , 贾敏如.白芷的化学成分研究进展 [ J].中药
材 , 2002, 25 (6):446.
收稿日期:2009-03-18
AnalyseonHPLCofWater-solubleComponentsfrom
StemsofAngelicadahurica
DengXiaohua
(HeilongjiangAcademyofForestry, Harbin　150081)
Abstract　ThispaperdealswithsearchingofHPLCchromatographicconditionsfordeterminationand
separationofwater-solublecomponentfromstemsofAngelicadahurica.Mobilephases, column
temperatures, flowrates, UVwavelength, injectedquantitieswereinvestigatedduringthemethod
developmentprocess.HPLCanalysiswascariedoutonHypersilGOLDC18 analyticalcolumnwith
wavelengthof340nm.Mobilephasesundertheconditionsofgradientelutioncontainedmethanoland
2% HCOOHataflowrateof1mL/min.
Keywords　Angelicadahurica;Water-solublecomponent;HPLC
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