全 文 ：收稿日期:2001-03-06初稿;2001-06-13修改稿
　食用菌学报　2001.8(2):10～ 14
　Acta Edulis Fungi
用 RAPD技术对香菇非对称
杂交后代遗传性状的分析
谭　琦1　杨建明2　陈明杰3　贺冬梅3　潘迎捷3　黄为一1
(1 南京农业大学资源与环境科学学院 ,南京　210095)
(2安徽技术师范学院 ,凤阳　233100)
(3上海市农业科学院食用菌研究所 , 农业部食用菌遗传育种重点开放实验室 ,
上海市农业遗传育种重点实验室 ,上海　201106)
摘　要　利用 RAPD技术 ,对香菇非对称杂交的亲本与后代之间的遗传相关性进行了分析。
20 个随机引物共扩增出 47 条 DNA片段 , 在此基础上分析构建了遗传相关聚类图。结果表明 , 非
对称杂交的后代 ,其遗传距离与单核受体较近 , 遗传相似性在 85%左右 , 而与双核供体遗传距离较
远 ,遗传相似性在 61%左右。
关键词　香菇;非对称杂交;RAPD;遗传分析
香菇产业在农业中的重要地位越来越突出 。1994 年 ,我国食用菌产量为 264.1万吨 ,占
世界食用菌总产量的 53.8%,其中香菇产量为 63.2万吨 ,占世界香菇总产量的 76.5%;1997
年 ,我国食用菌产量发展到 400万吨 ,其中香菇为 80万吨;1998年 ,我国食用菌产量为 437万
吨 ,香菇为 133.8万吨;1999年 ,我国食用菌产量达到 450万吨 ,香菇产量亦上升到 154.3万
吨。由于香菇生产迅猛发展 ,对香菇优良菌种的需求量越来越大 ,加快选育优良香菇菌种已迫
在眉睫。
为适应生产的要求 ,科技人员潜心研究 ,育种手段不断创新 ,已从引种 、单孢对称杂交 ,发
展到利用原生质体单核体进行原生质体单核体的对称杂交和非对称杂交。本研究以非对称杂
交的亲本 、后代及用对称杂交获得的与非对称杂交后代交配型一致的后代为材料 ,利用 RAPD
技术 ,从 DNA 水平上揭示香菇非对称杂交后代的遗传变异情况 。
1　材料与方法
1.1　供试菌株
供试菌种见表 1。
1.2　DNA提取
将活化的菌丝接种于含 PDA 液体培养基的 150mL 三角瓶中 , 25℃100r/min 振荡培养
14d。将所得的菌丝用不锈钢网过滤 ,重蒸水洗涤 2 ～ 3次 ,滤纸吸干后 ,取 0.1g 置于 1.5mL
DOI :10.16488/j.cnki.1005-9873.2001.02.002
的离心管内 , -20℃冷冻 2h 。
每管加 LETS〔1〕缓冲液后 ,用研棒研碎菌丝。加入苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液 ,
充分混匀 ,14000r/min离心 10min。
表 1　供试菌种
Table 1　The strains tested in this study
供试菌株　S trains tested 备注　Rem arks
23号　No.231) 对称杂交后代　Filial generation of symmet rical crossing
9525 非对称杂交后代　Filial generation of nonsymmetrical crossing
苏香　Suxiang 供体亲本　Donor parent
26 受体亲本　Acceptor parent
1)　23号菌株与 9525的交配型一致　M ating type of No.23 was the same as that of 9525
取上清液置于一新的离心管中 ,加入 2倍预冷的无水乙醇 ,混匀 ,14000r/min离心 10min;
弃去上清液 ,再加入预冷的 70%乙醇 ,轻轻上下颠倒 , 14000r/min 4℃离心 10min;弃去乙醇 ,
用真空干燥器抽 15min ,除净乙醇 。
DNA中加入 20μL TE 缓冲液 ,轻轻敲打 ,使沉淀溶解 ,加入 1μL 10mg/mL RNase (Boul-
der公司产品),37℃水浴保温 1h ,去除 RNA ,DNA提取物存于-20℃冰箱中备用 。
取 2μL DNA提取物 ,点样于 0.8%琼脂糖(上海生工生物工程技术服务有限公司产品)凝
胶上 ,5V/cm 电泳 2h后 ,用 0.5μg/mL EB染色 15min ,然后用自来水冲洗几次 ,置凝胶于紫外
检测仪下检测。
1.3　DNA扩增
1.3.1　随机引物　本文所用引物为Operon公司产品 ,其序列如表 2 。
表 2　随机引物的核苷酸序列
Table 2　Nucleotide sequence of the random primers
引物　Primer 核苷酸序列　Nucleotide sequence 引物　Primer 核苷酸序列　Nucleot ide sequence
OPA-01 5 -CAGGCCCTTC OPA-11 5 -CAATCGCCGT
OPA-02 5 -TGCCGAGCTC OPA-12 5 -TCGGCGATAG
OPA-03 5 -AGTCAGCCAG OPA-13 5 -AGTCAGCCAC
OPA-04 5 -AATCGGGCTG OPA-14 5 -TCTGTGCTGG
OPA-05 5 -AGGGGTCTTG OPA-15 5 -AGGGGTCTTG
OPA-06 5 -GGTCCCTGAC OPA-16 5 -AGCCAGCGAA
OPA-07 5 -GAAACGGGTG OPA-17 5 -TACCGCTTGT
OPA-08 5 -GTGACGTAGG OPA-18 5 -AGGTGACCGT
OPA-09 5 -GGGTAACGCC OPA-19 5 -CAAACGTGGG
OPA-10 5 -GTGATCGCAG OPA-20 5 -GTTGCGATCC
1.3.2　反应体系　反应的总体积为 25μL ,组分见表 3。另取一离心管作为对照管 ,其模板用
ddH2O代替 ,其它反应试剂及加入量同表 3 。
1.3.3　反应条件　扩增反应在 PCR扩增仪上进行 ,92℃变性 1min , 35℃复性 1min ,72℃延伸
2min ,共 45个循环 ,最后 72℃补平 10min ,终止温度为 4℃。
1.3.4　电泳　反应结束后 ,取反应产物 20μL 与 5μL 溴酚兰指示剂混匀 ,点样于 1.4%琼脂
糖凝胶上 ,同时点 8μL 100bp DNA ladder(上海生工生物工程技术服务有限公司产品)作分子
112 期　　　　　　　　谭　琦等:用 RAPD技术对香菇非对称杂交后代遗传性状的分析
量标记 ,在 0.5×TBE缓冲液中电泳约 1.5h(电压 120V),溴酚兰离凝胶前缘 1 ～ 2cm 时 ,停止
电泳 。0.5μg/mL EB染色 10min ,自来水冲洗 5min后用法玛西亚图像分析系统拍照。
表 3　扩增反应体系中各成分的含量
Table 3　Concentration of ampli fication reaction compositions
成　分　Com positions 体　积　Volume(μL) 　终浓度　Final concent ration
ddH2O 9.95
10×PCR缓冲液　10×PCR buf fer 2.5 1×
25mM M gCl2 2.0 2.0mM
10mM dNT Ps 0.25 0.1mM
10μM 引物　10μM primer 1.0 0.2μM
Taq(5U/μL) 0.3 1.5U
DNA 模板　DNA template 9.0 10.0ng
总计　Total 25.0　
1.3.5　数据处理　将在琼脂糖凝胶上出现 DNA片段的计为 1 ,不出现此 DNA 片段的记为
0 ,统计后输入电脑 ,用 NTSYS聚类分析软件进行聚类分析 ,构建遗传相关聚类图谱。
2　结果与分析
2.1　本研究所用的 20个随机引物共扩增出 47条 DNA片段 ,其中 12 个随机引物没有 DNA
条带产生 。图 1显示的是引物OPA-19对四个菌株扩增出的 DNA片段 。
图 1　引物 OPA-19扩增的 DNA 片段
Fig.1　DNA fragments ampl ified by primer OPA-19
2.2　从图 2的聚类图得知 ,由非对称杂交所获得的后代 9525 ,在遗传距离上明显偏向于单核
受体亲本 26 ,其遗传相似性接近 85%;而与双核供体苏香遗传距离较远 ,其遗传相似性略大于
60%。23号菌株是用苏香的原生质体单核体(其交配型与 9525供体核一致)与 26 交配获得
的杂交后代 ,其与 9525的双核交配型一样 ,即 23号菌株 、9525有相同的核 ,仅 23号菌株为原
生质体单核体的对称杂交所获得的后代 ,9525为原生质体单核体非对称杂交所获得的后代 。
但 23号菌株与其双亲的遗传相似性分别为 65%和 60%,没有明显的遗传倾向性。
12 　　　　　　　　　　食　用　菌　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　8 卷
图 2　RAPD结果聚类图
Fig.2　Dendrogram constructed fromRAPD
3　讨论
加拿大著名的真菌学家布勒(Buller AHR ,1930)发现〔2〕 ,担子菌中一些菌种的单核菌丝体
如遇同种双核菌丝体时 ,会被双核菌丝体双核化 ,这一现象被 Quintanilha(1937)〔3〕以发现者
布勒的名字命名为“布勒现象” 。1950年 , Papazian〔4〕建议改“布勒现象”为双-单交配(Di-
mono mating),即非对称杂交(Nonsymmetrical crossing)。1976 年 , Mori , Ki〔5〕等以香菇为材
料 ,在 GMY琼脂培养基上首先接种单核菌丝体 ,一周后在单核菌丝体的外围接种双核菌丝
体 ,三周后在单核菌丝体的放射状边缘找到了新的杂合异核菌丝体 ,从而证明了香菇中存在
“布勒现象” 。1996年 ,Bak WonChull〔6〕进行香菇段木菌种筛选时 ,35个菌种使用了 12个通过
双单交配而获得的杂交后代 ,经一季栽培 ,初选出 12个菌种 ,其中有 2个是双单杂交后代 ,说
明双单交配可以用于香菇的杂交育种。谭琦(2000)〔7〕利用非对称杂交育种技术路线成功地
选育出香菇新菌种申香 10号 ,并将其作为香菇杂交育种的一种方法 。这一方法以原生质体单
核体为受体 ,供已具备多种优良性状的菌种进一步遗传改良。该方法的主要原理是以需改良
菌种的原生质体单核体为受体 ,以能提供改良菌种所需性状的双核菌株为供体进行非对称杂
交。在非对称杂交过程中 ,携带供体某些优良性状的一个核(先导核)优先进入受体单核细胞 ,
而受体单核细胞又是一个双核亲本性状较为集中的无性体 ,因此 ,在供体和受体遗传物质的分
配和组合上形成了一个同质异核的杂交后代 ,它具有一套完整的受体细胞质和分别来自供体
和受体二个异核的遗传重组体 。这一方法有几个较为明显的优势 ,一是后代的遗传性状和表
型更接近受体 ,因此以具有较多优良性状菌种为单核受体 ,以具有某些特殊优良性状的菌株为
双核供体的这种重组方式更有利于现有优良栽培菌种的改造。二是以原生质体单核体这一无
性后代做为单核受体 ,避免了孢子单核体亲本性状较为分散的局限性 ,使受体菌种的优良性状
更为集中 。在操作方法上 ,把要改良菌种进行原生质体单核化 ,以该原生质体单核体为受体 ,
同时选择具有相应性状的菌种做为双核供体 ,进行配对杂交。三是这一技术也为一些优良香
菇菌种在有限的遗传范围内进行提纯复壮提供了一条新的途径 。由于非对称杂交方法只需一
个亲本进行原生质体单核化 ,另一亲本即为正常保存菌种 ,工作量有所减轻 。申香 10号从农
艺性状上证明了非对称杂交所产生的后代更接近于单核受体 。本研究从 DNA水平上提供了
香菇非对称杂交后代在遗传性状上与单核受体更相似的依据 ,与农艺性状的结论相符。
132 期　　　　　　　　谭　琦等:用 RAPD技术对香菇非对称杂交后代遗传性状的分析
参　考　文　献
1　谭琦.C.P.Romaine.利用 RAPO 技术对不同地区的有害疣孢霉菌株进行遗传分析.食用菌学报 , 1996 , 3
(4):52 ～ 56.
2　Buller AHR.Research on Fungi , Vol.4.London:Longmans , Green and Co., 1931.4.
3　Quintanilha A.Contribution al etude genetique duphenomene de Buller.Compt.Rend.Acad.Sci., 1937 ,
205.
4　Papazian HP.Secto ring variants in Schizophy llum .Am.J.Bot , 1955 , (42):394 ～ 400.
5　Mori K.Hybridization of shiitake between cultiva ted strains o f Japan and wild strains g rown in Taiw an and New
Guinea.Mushroom Science , 1976.391 ～ 403.
6　Bak WC , Lee TS , Lee WK etc.Selective breeding and hybridization of Lentinus edodes strains fo r bed-log cul-
tivation.Journal of Korean Forestry Society , 1996 , 85(2):309 ～ 315.
7　谭琦 , 潘迎捷 ,陈明杰等.香菇申香 10 号菌种的选育与推广.食用菌学报 , 2000 , 7(3):6 ～ 10.
Analysis of Genetic Characters in Nonsymmetrical Crossing
Filial Generations of Lentinula edodes with RAPD Technique
Tan Qi1　Yang Jianming2　Chen Mingjie3　He Dongmei3　Pan Ying jie3　Huang Weiyi1
(1 I nstitute of Resource and Environment , Nanjing Ag riculture University , Nanjing　210095)
(2 Anhui Technical Normal College , Fenyang　233100)
(3 Edible Fungi Institute , Shanghai Academy of Agricultural Sciences;
Key Lab.of Edible Fungi Genetics and Breeding , Ministry of Agriculture , P.R.China;
Shanghai Key Lab.of Agriculture Genetics and Breeding , Shanghai　201106.)
Abstract　The genetic similarity among the acceptor parent , donor parent and filial g enerations of nonsym-
metrical crossing Lentinula edodes w as analy zed with RAPD technigue.47 DNA fragments were amplified by 20
random primers.And the dendrogram of genetic cor rela tion w as constructed on this basis.The result show ed that
the genetic characters of nonsymmetrical crossing filial generations w ere similar to that of the mononuclear accepter
-parent with a genetic similarity index of about 85%, and that more genetic diversity exsisted between the non-
symmetrical crossing filial generation and the binuclear donor parent with a genetic similarity index of about 61%.
Key Word　Lentinula edodes;Nonsymmetrical crossing;RAPD;Genetic analysis
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