全 文 ：学 报
Journal of China Pharmaceutical University 2014，45(1) :88 － 91
利用斑马鱼模型评价川续断皂苷Ⅴ和Ⅵ的抗骨质疏松活性
王长梅
1
，景莉君
1，2
，韦英杰
1，2* ，贾晓斌
1
(1中国中医科学院江苏分院 江苏省中医药研究院，南京 210028;2南京中医药大学附属江苏省中西医结合医院，南京 210028)
摘 要 为探讨斑马鱼模型评价中药微量成分在体抗骨质疏松活性的适用性与合理性，以 25 μmol /L 泼尼松龙诱导
的斑马鱼幼鱼骨质疏松模型考察川续断皂苷 V和川续断皂苷 VI抗骨质疏松活性。采用茜素红对斑马鱼幼鱼骨骼染色，并
以显微检测、数码成像方法定量分析骨骼染色区域。结果 25μmol /L泼尼松龙使斑马鱼骨量显著丢失，与模型组比较，川续
断皂苷 V和川续断皂苷 VI及依替膦酸二钠阳性药均能阻止泼尼松龙诱导的斑马鱼骨量丢失，提示斑马鱼模型成功评价了
微量川续断皂苷 V和川续断皂苷 VI的抗骨质疏松活性，具有在体化、微板化，简单、高效的特点。
关键词 斑马鱼;骨质疏松;川续断皂苷 V;川续断皂苷 VI;泼尼松龙
中图分类号 Ｒ965 文献标志码 A 文章编号 1000 － 5048(2014)01 － 0088 － 04
doi:10． 11665 / j． issn． 1000 － 5048． 20140116
Evaluation of antiosteoporotic activity for micro-amount asperosaponins V and
VI by on the osteoporosis model using zebrafish
WANG Changmei1，JING Lijun1，2，WEI Yingjie1，2* ，JIA Xiaobin1
1 Jiangsu Branch of China Academy of Chinese Medical Science，Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine，Nanjing 210028，
China; 2 Nanjing University of Chinese Medicine，Affiliated Jiangsu Provincial Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western
Medicine，Nanjing 210028，China
Abstract To explore the applicability and rationality of zebrafish model for the evaluation of in vivo anti-osteopo-
rosis activity of micro-amount of components from traditional Chinese medicine，zebrafish larvae osteoporosis model
induced by 25 μmol /L prednisolone was used to test the anti-osteoporosis activity of asperosaponins V and
VI. Zebrafish bones were stained with alizarin red，and quantitative analysis of the stained area was performed by
microscopic inspection and digital imaging methods to reflect the amount of zebrafish head skeleton mineraliza-
tion. The results indicated that 25 μmol /L prednisolone could make zebrafish bone lose significantly，and that
compared with the model group， asperosaponins V and VI and etidronate disodium could prevent such loss
induced by prednisolone. The results suggested that zebrafish model could be used in evaluating anti-steoporosis
activity of micro-amount of asperosaponins V and VI，which has advantages of being in vivo，micro plate，simple
and highly efficient.
Key words zebrafish; osteoporosis; asperosaponin VI; asperosaponin V; prednisolone
This study was supported by the Natural Science Foundation of Jiangsu Province ( No. BK2011866) ; the National Natural Science Foun-
dation of China ( No. 30973978) ; and the Foundation for High-Level Talent in Six Areas of Jiangsu Province ( No. 2013-YY006)
骨质疏松是一种骨密度低、微结构退化、导致
低创伤性骨折的风险增高的常见复杂疾病。我国
采用中草药防治骨质疏松的历史已有千余年。但
现有评价模型制约中药抗骨质疏松活性成分的高效
筛选。例如，传统在体动物实验存在工作强度大、耗
时长、灵敏度低、用样量大等缺点，不利于微量成分
的评价;体外细胞模型实验作用环节单一，难以体现
在体综合效应。近年来斑马鱼作为药效和毒性筛选
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* 收稿日期 2013-08-28 * 通信作者 Tel:025 － 85637809 E-mail:wyj970@ 163. com
基金项目 江苏省自然科学基金资助项目(No. BK2011866) ;国家自然科学基金资助项目(No. 30973978) ;江苏省“六大人才高峰”
资助项目(No. 2013-YY006)
第 1 期 王长梅等:利用斑马鱼模型评价川续断皂苷Ⅴ和Ⅵ的抗骨质疏松活性
模型得到广泛应用，斑马鱼骨骼的发育机制与哺乳
动物具有高度同源性，为建立斑马鱼骨质疏松、骨关
节炎等模型提供了生理及遗传学依据［1－ 3］。本课题
组前期借鉴 Fleming 等［1－ 2］研究用地塞米松和泼尼
松龙诱导并建立斑马鱼骨质疏松新模型，并用以验
证依替膦酸二钠(etidronate disodium，ED)、鲑鱼降
钙素的抗骨质疏松活性［4－ 5］。该模型能否有效用于
中药成分特别是微量成分的抗骨质疏松活性评价，
对实现中药抗骨质疏松活性成分的高效筛选具有重
要价值。
续断(Dipsacus asper Wall. ex Henry)是一种传
统的抗骨质疏松中草药，对骨质疏松症防治有确切
疗效，其中续断皂苷类成分是主要壮骨成分［6］，其
主要皂苷川续断皂苷Ⅵ具有促进大鼠骨髓间充质
干细胞向成骨细胞增殖和分化的作用，增加骨形态
发生蛋白-2(BMP-2)的合成来增加骨形成，并激活
p38 和细胞外信号调节激酶 1 /2(EＲK1 /2)信号转
导通路［7－ 8］。由于受化合物数量的限制，其他微量
川续断皂苷的抗骨质疏松活性尚未明确。本文采
用斑马鱼骨质疏松模型考察活性、机制明确的川续
断皂苷Ⅵ和活性尚不明确的川续断皂苷Ⅴ的活性，
探讨该模型评价中药微量成分抗骨质疏松活性的
合理性与适用性。
1 材 料
1. 1 试 剂
川续断皂苷 VI对照品(中国药品生物制品检
定所，批号:111685-200401) ，川续断皂苷Ⅴ为作者
从续断中分离、纯化得到，光谱数据与文献报道一
致［9－ 10］，纯度经 HPLC-ELSD 检测大于 98%(结构
式见图 1) ;依替膦酸二钠(中国药品生物制品检定
所) ;泼尼松龙(苏州亚科化学试剂股份有限公司，
批号 YK2012020101) ;二甲亚砜(DMSO，国药集团
化学试剂有限公司) ;多聚甲醛(成都市科龙化工
试剂厂，批号 20100504) ;MS-222 (美国 Acros
Organics公司，批号 A0288328) ;茜素红 S(郑州四季
化工产品有限公司) ;水为 Milli-Q system高纯水(美
国 Millipore公司) ;其余试剂均为市售分析纯。
1. 2 仪 器
Axioobserver. A1 荧光倒置显微镜(蔡司光学
仪器国际贸易有限公司) ;SPX-80 生化培养箱(宁
波海曙赛褔实验仪器厂) ;Image-Pro Plus 6. 0 专业
图像分析软件(美国 Media Cybernetics公司)。
Figure 1 Structural formula of asperosaponin V (Ｒ = CH3) and
asperosaponin VI (Ｒ = CH2OH)
1. 3 动 物
斑马鱼成鱼由南京大学模式动物研究所提供，
来自德国 tubingen品系。
2 方 法
2. 1 药物溶液的配制
泼尼松龙溶液配制:精密称取泼尼松龙
45. 3 mg，加入 DMSO 6. 5 mL，用培养基［11］稀释并
定容至 50 mL，即得 2. 5 mmol /L泼尼松龙储备液。
临用前用培养基稀释 100 倍，即得 25 μmol /L泼尼
松龙溶液。
含泼尼松龙的川续断皂苷Ⅵ(asperosaponin
VI)和川续断皂苷Ⅴ(asperosaponin V)溶液配制:
分别精密称取川续断皂苷Ⅵ 2. 32 mg和川续断皂苷
Ⅴ2. 28 mg，用适量 DMSO溶解定容至 10 mL，分别得
到 250 μmol /L川续断皂苷Ⅵ和Ⅴ储备液。取川续断
皂苷Ⅵ和Ⅴ储备液适量，各再加入 2. 5 mmol /L 泼尼
松龙储备液 100 μL至 10 mL量瓶，用培养基分别依
次稀释配制成含 25 μmol /L 泼尼松龙的 0. 008，
0. 04，1 μmol /L的川续断皂苷Ⅵ和Ⅴ溶液。
含泼尼松龙的依替膦酸二钠溶液配制:精密称
取依替膦酸二钠 15 mg，用超纯水溶解定容至
10 mL，即得 1 500 mg /L的储备液。取上述依替膦
酸二钠储备液适量，加入适量泼尼松龙储备液，并
用培养基稀释配制成含 25 μmol /L 泼尼松龙的
30 mg /L依替膦酸二钠溶液。
2. 2 斑马鱼幼鱼的固定、骨骼染色与分析方法
斑马鱼的胚胎收集与培养、鱼龄选择、给药方式
方法及其头部骨骼的茜素红染色方法参考前期研
究［4－ 5］，在斑马鱼幼鱼培养至受精后 10 d(10 dpf) ，
麻醉处死后用 4%多聚甲醛固定后，采用 1% KOH
配制的含 3% H2O2 的漂白剂将幼鱼漂白至眼部色
素清除后，采用茜素红对斑马鱼幼鱼头部骨骼染色，
98
学 报 Journal of China Pharmaceutical University 第 45 卷
再用梯度比分别为 3∶ 1、1∶ 1、1∶ 3的 1% KOH和甘油
的混合溶液将幼鱼透明化，最后将幼鱼保存于纯甘
油中。使用显微镜拍摄幼鱼头部腹面照，然后采用
图像分析软件 Image-Pro Plus 6. 0 将幼鱼头部骨骼
染色面积和累积光密度进行分析计算，以反映骨矿
化量。
2. 3 给药与数据处理
取受精后 5 天(5 dpf)的斑马鱼幼鱼分成 5 组
置 24 孔板，每组 2 孔，每孔 10 条幼鱼，1 组给予
0. 5%DMSO 阴性对照，其余 4 组给予 25 μmol /L
泼尼松龙模型药，置于恒温培养箱中 28. 5 ℃培养，
48 h后，将其中 3 组模型药分别换为含 25 μmol /L
泼尼松龙不同浓度川续断皂苷Ⅵ和川续断皂苷Ⅴ
溶液以及含 25 μmol /L 泼尼松龙的 30 mg /L 依替
膦酸二钠溶液(阳性药物组) ，每个浓度组做 3 份，
每天换药，培养至 10 dpf;然后将各组斑马鱼按照
“2. 2”项下方法进行骨矿化量分析。用 EXCEL 软
件计算平均值、标准偏差及变异系数(n = 5 ～ 7) ，
t-test比较各组差异。斑马鱼幼鱼体内卵黄囊含丰
富的营养可供培养 9 ～ 10 dpf无需喂食。
3 结 果
3. 1 川续断皂苷Ⅵ对抗泼尼松龙诱导的斑马鱼骨
质疏松的作用
与 DMSO组相比，25 μmol /L 泼尼松龙模型组
的矿化面积和累积光密度存在极显著性差异(P ＜
0. 001) ，提示泼尼松龙成功诱导斑马鱼骨质疏松。
与泼尼松龙模型组比，30 mg /L 依替膦酸二钠
(ED)可显著性阻止斑马鱼骨量丢失;川续断皂苷
Ⅵ组随着川续断皂苷Ⅵ浓度的增加，矿化面积和
IOD均呈增加的趋势，当川续断皂苷Ⅵ浓度为
0. 008 μmol /L和 0. 04 μmol /L时，矿化面积显著性
增加(P ＜ 0. 05) ，浓度增加至 1 μmol /L 时，矿化面
积极显著性增加(P ＜ 0. 01) ;累积光密度在川续断
皂苷Ⅵ浓度为 0. 04 μmol /L(图 2)和 1 μmol /L 时
均呈极显著性增加，提示川续断皂苷Ⅵ可防止并阻
止泼尼松龙诱导的斑马鱼骨量丢失。结果见图 3。
3. 2 川续断皂苷Ⅴ对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质
疏松的作用
与 DMSO组相比，25 μmol /L 泼尼松龙模型组
的矿化面积和累积光密度存在极显著性差异(P ＜
0. 001) ，提示泼尼松龙成功诱导斑马鱼骨质疏松。
Figure 2 Ventral view of zebrafish treated with 0. 5% DMSO，25
μmol /L prednisolone (P) ，30 mg /L etidronate disodium (ED) ，0. 04
μmol /L asperosaponin V and 0. 04 μmol /L asperosaponin VI in the
presence of 25 μmol /L prednisolone
Figure 3 Effect of asperosaponin VI on mineralized area (A)and
integrated optical density (IOD) (B)of zebrafish larval
Zebrafish larval treated with asperosaponin VI from 7 dpf to 10 dpf，fol-
l owing 48 h exposure to 25 μmol /L prednisone alone，at 10 dpf larval
was fixed and stained with alizarin red
###P ＜ 0. 001 vs 0. 5% DMSO control group;* P ＜ 0. 05，＊＊ P ＜
0 . 01，＊＊＊P ＜ 0. 001 vs 25 μmol /L prednisone group
与泼尼松龙模型组比，30 mg /L ED 可显著性阻止
斑马鱼骨量丢失;川续断皂苷Ⅴ在 0. 008 μmol /L
时，鱼矿化面积显著增加(P ＜ 0. 05) ，当浓度增加
到 0. 04 μmol /L时，矿化面积和累计光密度均极显
著性增加(P ＜ 0. 01) ，但当浓度继续增加到 1. 0
μmol /L时，矿化面积和 IOD 均低于 0. 04 μmol /L
川续断皂苷Ⅴ，但仍呈显著性(P ＜ 0. 05) ，说明川
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第 1 期 王长梅等:利用斑马鱼模型评价川续断皂苷Ⅴ和Ⅵ的抗骨质疏松活性
续断皂苷Ⅴ可防止并阻止泼尼松龙诱导的斑马鱼
骨量丢失。结果见图 4。
Figure 4 Effect of asperosaponin V on mineralized area (A)and IOD
(B)of zebrafish larval
Zebrafish larval treated with asperosaponin V from 7 dpf to 10 dpf，fol-
lowing 48 h exposure to 25 μmol /L prednisone alone，at 10 dpf larval
was fixed and stained with alizarin red
###P ＜ 0. 001 vs 0. 5% DMSO control group;* P ＜ 0. 05，＊＊ P ＜
0. 01，＊＊＊P ＜ 0. 001 vs 25 μmol /L prednisone group
4 讨 论
斑马鱼幼鱼头骨发育包含骨形成和骨吸收的
较完整体系［1］，斑马鱼骨质疏松模型是一种介于
单细胞和整体哺乳动物之间的在体模式动物模型，
可作为细胞实验和常规动物实验评价之间的桥梁，
体积小而有完整骨骼，可实现微量成分的在体、微
板形式的高效评价。这对开发我国丰富的中药资
源，尤其是从某些微量成分中发现结构新颖、活性
独特的抗骨质疏松先导化合物具有重要意义，值得
进一步研究和推广。
本研究用该模型评价了作用与机制研究相对
明确的川续断皂苷Ⅵ的抗骨质疏松活性，结果与现
有大鼠骨质疏松模型和细胞模型报道的结论具一
致性［7－ 8］，在此基础上，进一步应用该模型成功评
价了作用与机制尚不明确的川续断皂苷Ⅴ的抗骨
质疏松活性，提示该模型用于中药微量成分抗骨质
疏松评价具可行性与合理性。进一步对川续断皂
苷Ⅵ和川续断皂苷Ⅴ的抗斑马鱼骨质疏松作用进
行了比较，在 0. 04 μmol /L 浓度时，与川续断皂苷
Ⅵ相比，川续断皂苷Ⅴ对斑马鱼 IOD 的影响有显
著性增加作用(P ＜ 0. 05) ，提示斑马鱼骨质疏松模
型有望用于微量成分抗骨质疏松活性的构效关系
研究。
参 考 文 献
［1］ Fleming A，Sato M，Goldsmith P． High-throughput in vivo screen-
ing for bone anabolic compounds with zebrafish［J］． J Biomol
Screen，2005，10(8) :823 － 831.
［2］ Barrett Ｒ，Chappell C，Quick M，et al． A rapid，high content，in
vivo model of glucocorticoid‐ induced osteoporosis［J］． Biotech-
nol J，2006，1(6) :651 － 655.
［3］ Kim SN，Bae SJ，Kwak HB，et al． In vitro and in vivo osteogenic
activity of licochalcone A［J］． Amino Acids，2012，42(4) :1 455
－ 1 465.
［4］ Wei YJ，Wang CM，Cai XT，et al． Establishment of zebrafish
osteopenia model induced by dexamethasone［J］． Acta Pharm
Sin(药学学报) ，2013，48(2) :255 － 260.
［5］ Wang CM，Wei YJ，Jia XB，et al． The zebrafish model of osteopo-
rosis induced by prednisolone［J］． World Sci Tech-Modern Trad
Chin Med(世界科学技术-中医药现代化) ，2013，15(3) :509
－ 514.
［6］ Wei YJ，Jia XB，Fan HW，et al． Chromatographic fingerprint of
Dipsacus asper and analysis by HPLC-MS［J］． Chin J Chin
Mater Med(中国中药杂志) ，2011，36(2) :169 － 174.
［7］ Wu MS，Zhao SZ，Ｒen LZ，et al． Experimental study of akebia
saponin D on the differentiation of rat bone marrow derived mes-
enchymal stem cells to osteoblasts in vitro via induction［J］．
Chin Pharmacol Bull(中国药理学通报) ，2012，28(2) :222
－ 226.
［8］ Niu Y，Li Y，Huang H，et al． Asperosaponin VI，a saponin compo-
nent from Dipsacus asper Wall，induces osteoblast differentiation
through bone morphogenetic protein-2 /p38 and extracellular sig-
nal-regulated kinase 1 /2 pathway［J］． Phytother Ｒes，2011，25
(11) :1 700 － 1 706.
［9］ Zhang YW，Xue Z． Studies on the chemical constituents of Dipsa-
cus asper Wall［J］． Acta Pharm Sin(药学学报) ，1991，26(9) :
676 － 681.
［10］ Zhang YW，Xue Z． New triterpenoid glycosides from Dipsa-
cus asper Wall［J］． Acta Pharm Sin(药学学报) ，1991，26
(12) :911 － 917．
［11］ Brand M，Granato M，Nusslein-Volhard C． Keeping and raising
zebrafish［M］/ /Nusslein-Volhard C，Dahm，Ｒ． Zebrafish:A
Practical Approach． Oxford:Oxford University Press，2002:7
－ 37.
19