全 文 ：姬松茸原生质体的制备
叶勋艳 , 张　云
(西北大学生命科学学院 江苏省淮阴工学院生化系, 江苏 淮阴　223001)
摘　要　对姬松茸(Agaricus blazei Murrill)原生质体制备的最佳条件进行了研究 ,结果表明:采用液体发酵培
养第 7 d 的菌体 , 用 2%溶壁酶在 30 ℃下酶解 5 h , 原生质体产率达 9.08×106 个/mL 。
关键词　姬松茸;原生质体;发酵
中图分类号　Q939.5　　　文献标识码　B　　　文章编号　1005-7021(2005)06-0106-04
Protoplast Preparation of Jisongrong Mushroom(Agaricus blazei)
YE Xun-yan , ZHANG Yun
(Col l.of Li fe S ci.N W Univ.Dept.of Biochem .Huaiyin Inst.of Technol.Huaiyin 223001)
Abstract　The pro toplast prepara tion of Jisongrong mushroom (Agaricus blazei)was studied.The results show ed
that the optimum preparation conditions are treating mycelia cultivated in fermentation substrate for seven days w ith
2% of wallzyme at 30 ℃ for five hours , and the production rate of pro toplast was up to 9.08 million per milliliter.
Keywords　Jisongrong mushroom (Agaricus blazei);protoplast;fermentation
　　姬松茸又名巴西蘑菇(Agaricus blazei Mur-
rill),在分类学上属于担子菌纲 、伞菌目 、蘑菇科 、
蘑菇属 。姬松茸含有多种有效成分 ,如其提取物
中所含的多糖-β 葡聚糖具有抗癌 、抗凝血 、降血
脂 、安神等作用[ 1 ,2] 。但姬松茸液体培养生长缓
慢且易染菌 ,本文研究了其原生质体制备的最佳
条件 ,为获得优质的姬松茸诱变株打基础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　菌株　姬松茸(Agaricus blazei Murrill),
由陕西省微生物研究所提供。
1.1.2　培养基　①斜面培养基(PDA):马铃薯
200 g , 葡萄糖 20 g , 琼脂 20 g , MgSO4 0.5 g ,
CaCl2 0.1 g , KH2PO4 1 g , FeSO4 0.1 g ,
(NH4)2SO4 3 g ,水 1 000 mL , pH 自然;②发酵
培养基:马铃薯 200 g ,葡萄糖 20 g ,酵母膏 3 g ,
MgSO4 0.5 g , CaCl2 0.1 g , KH2PO4 1 g ,
FeSO4 0.1 g , (NH4)2SO4 3 g ,水 1 000 mL , pH
自然。
1.2　方法
1.2.1　原生质体制备的基本方法　①菌体培养:
将姬松茸的 PDA固体斜面接种于液体培养基中 ,
28 ℃, 240 r/min 摇床培养 7 d;②原生质体制
备:取菌丝培养液 5 mL 于无菌离心管中 ,离心收
集菌体 ,用 0.6 mol/ L MgSO4 洗涤 ,离心 2 遍 ,弃
去上清液 ,加入 1 mL 酶解液 ,置一定温度下恒温
培养 ,隔时摇动 ,并每隔 1 h取样 1 次 ,用无菌吸
管猛吸多次 ,促始原生质体从残余菌丝上释放 ,离
心弃去酶液 ,用稳渗液溶液洗涤 2 次即获得纯化
原生质体 。在 40 倍的光学显微镜下用血球计数
板计算原生质体形成量;③原生质体的活性检测:
配制 0.1 的中性红染液 。取 1 滴染液与血球计
数板上的原生质体悬液混合 , 25 min后在 40 倍
的光镜下检查原生质体是否着色并计数。呈粉红
色的为死原生质体 ,染不上色的为活原生质体 ,计
算活原生质体量 。
1.2.2　原生质体制备的最佳条件　①酶种类:本
　收稿日期:2004-12-02
　作者简介:叶勋艳　女 ,讲师,硕士。研究方向为微生物生理生化。
106 微生物学杂志　 2005年 11 月第 25 卷第 6 期　JOURNAL OF MICROBIOLOGY Nov.2005 Vol.25 No.6
实验对 4 种可能有脱壁作用的酶进行了酶解脱
壁实验 ,计算原生质体数(结果如图 1);②溶壁酶
浓度:取培养 7 d 的菌丝体 , 分别用 1.5%、
2.0%、2.5%、3.0%的溶壁酶制备原生质体 ,在
30 ℃,酶解 5 h的条件下进行实验(结果如图 2);
③稳渗剂种类及其浓度:选用 MgSO4 、KCl和甘
露醇作为稳渗剂 ,分别设置 0.4 、0.6 、0.8 mol/L
三种浓度 ,配制 2.0%溶壁酶酶液 ,取培养 7 d的
菌丝体 ,在 30 ℃的水浴中酶解 5 h ,计数(结果如
图 3);④pH 值:以 0.6 mol/L M gSO4 做稳渗液 ,
用 0.1 mol/L 的 HCl和 NaOH 调解 pH 值 ,分别
设置 pH 为 4.5 、5.0 、5.5 、6.0 、6.5 、7.0 、7.5 的酶
解液。取培养 7 d的菌丝体 ,在 30 ℃水浴中酶解
5 h ,计数(结果如图 4);⑤菌龄　以 0.6 mol/L
的 MgSO4 作稳渗剂 ,配制 2.0%的酶解液 ,分别
取培养 3 、5 、7 、9 、11 d的菌丝体 ,加入 3 倍体积的
2.0%的酶解液 ,在 30 ℃水浴中酶解 5 h ,计数
(结果如图 5);⑥酶解时间:将培养 7 d 的菌丝
体 ,在 3 倍量的 2.0%酶浓度下 ,30 ℃进行酶解 ,
每隔 1 h进行一次镜检 ,计数(结果如图 6);⑦酶
解温度:设置 25 、28 、30 、32 、35 ℃五种酶解温度 ,
取培养 7 d的菌丝体 ,加入 3 倍量的 2.0%的酶
解液 ,在上述条件下酶解 ,计数(结果如图 7)。
2　结果与讨论
2.1　释放原生质体的酶种类选择(图 1)
图 1　酶对原生质体释放量的影响
　　从图 1 可知 ,溶壁酶的效果最好 ,其次为纤
维素酶 、蜗牛酶 、溶菌酶。
2.2　溶壁酶浓度对原生质体形成的影响(图 2)
　　从图 2 可知 ,溶壁酶浓度并非与原生质体产
率成正相关 ,相反 ,酶液浓度过高会造成原生质体
变形 ,损伤原生质体膜 ,致使原生质体破裂 ,影响
原生质体活力 ,使得原生质体量下降 ,这与刘振钦
等[ 3]所得结果一致 ,此实验表明 ,当溶壁酶浓度
为 2.0%时 ,原生质体产率最高。
图 2　溶壁酶浓度对原生质体形成的影响
2.3　稳渗剂种类及其浓度对姬松茸原生质体形
成的影响(图 3)
图 3　移稳渗剂种类及其尝试对姬松茸
原生质体形成的影响
　　试验结果表明 ,用 KCl 、MgSO4 、甘露醇作稳
渗剂制备姬松茸原生质体时 ,总的来说 MgSO4的
效果最好 ,其次是 KCl ,而甘露醇效果较差 。不同
稳渗剂的适宜浓度不同 ,0.6 mol/L MgSO4 的原
生质体释放量最高 ,以下依次为 0.8 mol/L >0.4
mol/L;对 KCl来说 , 0.6 mol/L 浓度的释放量最
高 ,以下依次为 0.4 mol/ L >0.8 mol/L;而对甘
露醇来说 , 0.8 mol/ L>0.4 mol/L >0.6 mol/L。
1076 期　　　　　　　　　　　　　　　叶勋艳等:姬松茸原生质体的制备　　　　　
在全部组合中 , 0.6 mol/L MgSO4 释放量最高 ,
为 9.01×106个/mL ,其次是 0.6 mol/ L KCl ,为
5.95×106/mL。在真菌原生质体制备中 ,对稳渗
剂的选择有很多报道 ,大都认为无机盐作为稳渗
剂要好于有机物[ 4 ,5] 。
2.4　pH值对姬松茸原生质体形成的影响(图 4)
图 4　不同 pH 值对姬松茸原生质体形成的影响
　　酶解液 pH 值对姬松茸原生质体释放量也有
明显的影响 ,但表现并不一致 。当以 0.6 mol/L
M gSO4 为稳渗剂时 , pH 值 4.5 ～ 7.5 之间 ,原生
质体释放量呈现出高—低—高—低的趋势 ,其中
pH=6.0的释放量最高 ,以下依次为 6.5>4.5>
5.0>7.5>7.0。表明中性和偏酸的酶解条件较
适于姬松茸原生质体的分离。
2.5　菌龄对原生质体形成的影响(图 5)
图 5　不同菌龄对原生质体形成的影响
　　从图 5可看出 , 7 d 菌龄的原生质体释放量
最高 ,其次是 9>5>3。菌龄过长或过短均不利
于原生质体的形成 。培养时间过短 ,原生质体产
量较少 ,这与幼嫩菌丝体易断裂 ,菌丝碎片多有
关;培养时间过长 ,原生质体产量也下降 ,这可能
与菌体细胞老化以及细胞壁上不易被酶解物质的
沉积及发酵后期细胞活力下降 ,产生很大比例的
非活性个体有关[ 6] 。
2.6　酶解时间对原生质体形成的影响(图 6)
图 6　不同酶解时间对原生质体形成的影响
　　从图 6可看出 ,在相同的条件下 ,原生质体产
量随时间的延长而增加 ,当达到 5 h时 ,产量达最
高值 ,继续延长时间 ,原生质体产量反而降低 ,表
明酶解 5 h是较适宜的酶解时间。
2.7　酶解温度对原生质体产量的影响(图 7)
图 7　不同酶解温度对原生质体产量的影响
　　酶是一种蛋白质 ,它有最适作用温度 ,低于或
高于此温度 ,酶的活力均受影响 ,从而原生质体产
量也受影响 ,从图 7可看出 ,原生质体制备的最适
酶解温度为 30 ℃,低于或高于此温度 ,原生质体
108 　　　　　　　　　微　生　物　学　杂　志　　　　　　　　　　　　　　　　　25 卷
的产量均有下降 。
3　小　结
　　本研究对姬松茸菌株依次进行了固体斜面培
养和发酵培养 ,最终确定了其原生质体制备的最
佳条件:采用培养 7 d 的菌丝体 , 以 0.6 mol/L
MgSO4作稳渗剂 , 在 30 ℃, 用 2%溶壁酶酶解
5 h ,原生质体产率可达 9.08×106 个/mL 。所制
备的原生质体见图 8和 9。
图 8　酶解 2 h原生质体与菌丝残留片段　　　　　　　　图 9　酶解 5h经精制后纯原生质体
参考文献:
[ 1] 　江枝和 ,朱丹 ,杨佩玉 ,等.姬松茸生物学特征的研究[ J] .食
用菌学报 , 1996 , 4(1):5-12.
[ 2] 　杨梅.姬松茸菌丝深层培养及氨基酸分析研究[ J] .中国食
用菌 , 1997 ,(16)3:41-43.
[ 3] 　刘振钦.平菇和榆黄蘑原生质体分离与融合的研究[ J] .食
用菌学报 , 1996 ,(1):13-14.
[ 4] 　Dominique G &Michel F.protoplast production from S apro-
legmia Monoica[ J] .Microbiol , 1982 , 34(4):89-98.
[ 5] 　梁平彦.产黄青霉两株营养缺陷型原生质体的形成与再生
的研究[ J] .植物生理学报 , 1981 , 7(1):1-10.
[ 6] 　李东屏.丝状真菌原生质体技术研究[ J] .湖南师范大学(自
然科学版), 1997 , 20(2):82-86.
·写作常识·
本刊常用的计量单位
为了更好地执行国务院发布的《关于在我国统一实行法定计量单位的命令》的规定 , 根据国标(GB3100 ～ 3102-93)
标准 ,单位符号一般用英文小写(正体), 来源于人名的单位 ,其符号的首字母大写 ,只有体积单位升例外 , 它的符号用“ L ,
(l)” , 推荐采用 L 。现将本刊常用计量单位符号及与之容易混淆的符号介绍如下 , 希望作者参照执行。
时间:年用 a , 不用 y , y r;星期 、周(无符号), 不用 wk;月(无符号), 不用 mo;日用 d ,不用 day;小时用 h ,不用 hr;分钟
用 min ,不用 m;秒用 s , 不用 sec表示。
溶液浓度:用 mol/ L ,不用 M(克分子浓度)和 N(当量浓度)等非许用单位表示。
百分浓度:务必注明是重量百分浓度 , 还是体积百分浓度。
面积:公顷用 hm2 , 不用 ha ,亩或公亩 , 换算因数为 1hm2=15亩。
旋转速度:用 r/ min ,不用 rpm , ×g 。
蒸汽压力:用 Pa或 kPa、MPa表示 , 不用大气压 at , kg/ m2或 kg/ cm2 等。
光密度:用 OD(斜体)表示。
生物大分子的分子量:蛋白质用 u 或 ku ,核酸用 bp或 kb 表示。
1096 期　　　　　　　　　　　　　　　叶勋艳等:姬松茸原生质体的制备