全 文 ：·研究报告·
姬松茸原生质体形成和再生的研究
张　卉 ,刘长江
(沈阳农业大学食品学院 ,辽宁沈阳　110161)
摘　要　报道了溶壁酶系统 、酶浓度 、不同菌龄 、脱壁促进剂 、渗透压稳定剂和酶解温度对姬松茸原生质体释
放率及不同再生培养基 、渗稳剂种类 、菌丝酶解时间和单双层平板对原生质体再生的影响。结果表明 ,菌龄为
3 ～ 5 d 的菌丝以 1.5 %溶壁酶 、0.5 %蜗牛酶和 0.5 %纤维素酶组成的酶系统在 30 ℃以 KCl为渗透压稳定
剂时 , 形成率为 1.4 ～ 1.5ⅸ107/ mL酶液;以蔗糖为渗透压稳定剂 , 菌丝酶解 1.5 ～ 3 h , 以 SMY 和 M YP 为再
生培养基 ,姬松茸原生质体再生率为 1.1 ‰～ 1.3 ‰。
关键词　姬松茸;原生质体;再生
中图分类号　S646-1+1　　　文献标识码　A　　　文章编号　1005-7021(2003)03-0018-03
　　姬松茸(Agaricus blazei Murill),又名巴西蘑
菇 ,是一种珍稀的食药兼用真菌 。姬松茸子实体
中含有多种生理活性物质 ,如多糖 、甾醇类物质
等 ,动物实验表明这些生理活性物质对于提高机
体免疫力 、抗肿瘤有一定的作用 。姬松茸引入我
国较晚 ,种质资源单一 ,通过原生质体诱变或融合
是菌种改良的有效方法。由于尚无关于姬松茸原
生质体研究的报道 ,我们对此进行了探索性研究。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　菌种　姬松茸(Agaricus blazei Murill)一
号 ,由辽宁省农业科学院菌种试验场陈大金先生
惠赠;姬松茸(Agaricus blazei Murill)二号 ,购于
福建三明真菌研究所 。
1.1.2　培养基 　①斜面培养基(PSA , 质量分
数 , %):马铃薯 20 ,蔗糖 2 , KH2PO4 0.15 , MgSO4
·7H2O 0.075 , 琼脂 2;②发酵培养基(质量分
数 , %):PSA+蛋白胨 0.2 ,不加琼脂;③再生培养
基:1)PDA(质量分数 , %):马铃薯 20 ,葡萄糖 2 ,
琼脂 1.5 ,加渗稳剂;2)SMY(质量分数 , %):蔗糖
1 ,麦芽糖 1 ,酵母膏 0.4 ,琼脂 1.5 ,加渗稳剂;3)
MYP(质量分数 , %):麦芽糖 2 ,酵母膏 0.2 ,蛋白
胨 0.2 , 琼脂 1.5 , 加渗稳剂;4)MS(质量分
数 , %):玉米粉 4 ,蔗糖 2 ,琼脂 1.5 , 加渗稳剂;
双层平板的上层培养基除琼脂为 0.5 %外 ,其他
成分与单层平板相同 。
1.1.3　酶制剂　溶壁酶(Lyw allzyme)购于广东
省微生物研究所 ,蜗牛酶(Snailase)北京百泰生化
技术公司 ,纤维素酶(cellulase)中科院上海东风生
化技术公司。
1.1.4 　渗透压稳定剂 　0.6 mol/L 甘露醇 ,
0.6 mol/ L蔗糖 ,0.6 mol/ L KCl。
1.2　方法
1.2.1　菌丝培养方法　①菌种活化;②液体种子
培养:将新鲜斜面培养基上的菌丝接种于液体种
子培养基中 ,装液量 50 mL/瓶 ,每支斜面菌种接
一瓶 ,25 ℃静止培养 4 ～ 6 d。 ③制备原生质体的
菌丝培养:将液体种子接种于 PDA 液体培养基
中 ,(25±1)℃恒温培养 ,装液量 20 mL/瓶 ,接种
量 25 %(体积与体积比)。④原生质体制备纯化:
将菌丝过滤或离心 ,分别用无菌水 、高渗缓冲液洗
涤数次 ,取 200 ～ 300 mg 菌丝 ,加入 2 mL酶液中
酶解。酶解液经玻璃棉柱或脱脂棉过滤离心。
1.2.2　原生质体再生　经纯化的原生质体稀释
至适当浓度 ,分别取 0.1 mL 涂于低渗和高渗再
生培 养基 , 并用 血球 记数 板记 数作对 照 ,
(25±1)℃恒温培养 10 ～ 15 d ,计算再生率 。
再生率=高渗培养基上的再生菌落数-高渗
培养基上的再生菌落数/原生质体总数×100%
2　结果与讨论
2.1　原生质体释放率的研究
2.1.1　酶系统的选择　比较了溶壁酶 、蜗牛酶和
纤维素酶单独作用和复合作用对姬松茸原生质体
释放率的影响(表 1)。从表 1 可见 ,制备姬松茸
原生质体时溶壁酶 、蜗牛酶和纤维素酶单独作用
的效果均不理想 ,而复合酶作用效果较好 ,其中以
1.5 %溶壁酶与 0.5 %蜗牛酶和 0.5 %纤维素酶
组成的酶系统效果最好 ,菌丝酶解 1 h即开始有
原生质体释放(图 1)。观察到的原生质体释放方
式有 2种 ,即顶端释放(图 2)和原位释放(图 3)。
收稿日期:2003-01-04
作者简介:张卉　女 ,博士研究生。现从事食品生物技术 、生物活性物质研究。
18 微生物学杂志 2003年 5月第 23卷 第 3期　JO URNAL OF MICROBIOLOGY May 2003 Vol.23 No.3
图 1　酶解 1.5h的菌丝和原生质体
图 2　原生质体从顶端释放(1 000×)
图 3　原生质体原位释放(1 000×)
　表 1　不同酶系统对姬松茸原生质体释放率的
　　　　影响
酶系统 原生质体释放率
(×107/mL)
2.5%溶壁酶 -
2.5%蜗牛酶 -
2.5%纤维素酶 -
2.0%溶壁酶+0.5%蜗牛酶 0.21±0.10
2.0%溶壁酶+0.5%纤维素酶 0.16±0.04
1.5%溶壁酶+0.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶 1.42±0.48
　注:pH5.8 , 30℃, 0.6mol/ L 蔗糖作渗透压稳定剂 ,酶解 3h , 液体培养 4d菌丝
　　溶壁酶是担子菌原生质体释放的有效酶 。其
本身是复合酶 ,对于一些担子菌单独使用即可获
得大量原生质体[ 1 ～ 4] 。但就本实验结果 ,其单独
作用对姬松茸原生质体释放效果不佳 ,与低浓度
的蜗牛酶 、纤维素酶组合则效率大为提高。
2.1.2　溶壁酶浓度对释放率的影响　根据酶系
统选择的结果 ,我们对姬松茸原生质体释放的主
酶溶壁酶的浓度进行研究 。由表 2 可见 ,在蜗牛
酶和纤维素酶的浓度不变的条件下 ,当溶壁酶的
浓度由 1.5 %降至 1.0 %,姬松茸原生质体释放
率急剧下降至 0.82×107/mL;当溶壁酶的浓度由
1.5 %升至 2.0 %,姬松茸原生质体释放率并未
成比例上升 ,所以 ,酶系统中的溶壁酶的浓度以
1.5 %为最佳 。
　表 2　溶壁酶浓度对姬松茸原生质体释放率的
　　　　影响
酶系统 原生质体释放率
(×107/mol/ L)
1.0%溶壁酶+0.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶 0.82±0.17
1.5%溶壁酶+0.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶 1.39±0.32
2.5%溶壁酶+0.5%蜗牛酶+0.5%纤维素酶 1.47±0.45
　注:pH5.8 , 30℃, 0.6mol// L蔗糖作渗透压稳定剂 ,酶解 3h , 液体培养 4d菌丝
2.1.3　菌丝培养时间对释放率的影响
　　资料显示 ,菌丝培养时间对原生质体释放率
有很大的影响 ,一般幼嫩的菌丝原生质体释放率
较高 ,本研究证明了这一观点 。由表 3 可以看
出 ,液体培养 2 ～ 4 d的姬松茸菌丝在上述条件下
原生质体释放率无显著差异 ,但 5 d以后原生质
体释放率开始下降。由于液体培养 2 d的姬松茸
菌丝较少 ,故以培养 4 d左右的菌丝最为适宜。
　表 3　菌丝培养时间对姬松茸原生质体释放率
　　　　的影响
菌丝培养时间/ d 原生质体释放率
(×107/mL)
2 1.54±0.31
3 1.44±0.43
4 1.49±0.19
5 1.40±0.34
6 1.31±0.60
　注:pH5.8 , 30℃, 0.6mol/ L蔗糖作渗透压稳定剂 ,酶解 3h
2.1.4　脱壁促进剂对原生质体释放率的影响　
β-巯基乙醇 、2-硫苏糖醇是常用的真菌脱壁促进
剂[ 5] ,根据报道 , L-甘氨酸对一些真菌脱壁也有促
进作用 ,我们以不用脱壁促进剂预处理的菌丝作
对照 ,研究脱壁促进剂对原生质体释放率的影响 ,
结果见表 4。由表 4 可见 ,已知的脱壁促进剂对
姬松茸原生质体释放无促进作用 ,故以不用脱壁
促进剂处理为好 。同时发现 ,用 β-巯基乙醇处理
的菌丝比未经处理的菌丝产生的原生质体小 。
2.1.5　渗透压稳定剂对原生质体释放率的影响
　渗透压稳定剂不仅是溶壁酶作用的介质 ,也是
原生质体形成 、存活的环境条件 ,因此 ,渗透压稳
定剂对原生质体释放有较大的影响 。常用的渗透
压稳定剂有糖类 、糖醇和无机盐类。本研究对蔗
糖 、甘露醇和 KCl对原生质体释放率的影响进行
研究 ,结果见表 5。由表 5 可见 , KCl是姬松茸原
193期　　　　　　　　　　　　　　　　张卉等:姬松茸原生质体形成和再生的研究　　　　　
生质体释放的较好渗透压稳定剂 ,与蔗糖 、甘露醇
相比释放率有较大的提高 。
　　目前 ,尚未完全弄清渗透压稳定剂对真菌原
生质体释放率影响的机理。据李刚等学者报道 ,
其可能机理是渗透压稳定剂对细胞壁溶解酶活性
有一定的影响及对生成的原生质体有保护 、稳定
作用 。
　表 4　脱壁促进剂对姬松茸原生质体释放率的
　　　　影响
　脱壁促进剂 原生质体释放率
/(×107/mL)
β-巯基乙醇 1.01±0.31
2-硫苏糖醇 1.24±0.43
L-甘氨酸 1.39±0.19
CK 1.30±0.29
　注:pH5.8 , 30℃, 0.6mol/ L 蔗糖作渗透压稳定剂 ,酶解 3h , 培养 6d的菌丝
　表 5　渗透压稳定剂对姬松茸原生质体释放率
　　　　的影响
渗透压稳定剂 原生质体释放率
/(×107/mL)
蔗糖 1.41±0.31
甘露醇 1.34±0.43
KC l 1.59±0.19
　注:pH5.8 , 30℃, 0.6mol/ L 蔗糖作渗透压稳定剂 ,酶解 3h , 培养 6d的菌丝
2.1.6　酶解温度的选择　溶壁酶的作用温度在
20 ～ 40 ℃,蜗牛酶和纤维素酶的作用温度也基本
在此范围内 ,本研究对上述 3 种酶的共同作用温
度区间进行研究 ,以找到酶系统的最佳作用温度。
结果见表 6。
　表 6　酶解温度对姬松茸原生质体释放率影响
酶解温度/ ℃ 原生质体释放率
/(×107/mL)
25 1.21±0.31
30 1.44±0.43
35 1.39±0.19
　注:pH5.8 , 30℃, 0.6mol/ L KCl作渗透压稳定剂 ,酶解 3h ,培养
6d的菌丝
2.2　姬松茸原生质体再生率的研究
2.2.1　再生培养基种类的影响　本实验研究了
4种再生培养基对于姬松茸原生质体的再生率的
影响 ,结果见表 7 。Sonnenberg 等报道了蘑菇属
原生质体再生率低[ 6] 。本研究的姬松茸也是蘑
菇属真菌 ,与其他真菌比其再生率很低[ 7 , 8] 。
2.2.2　渗透压稳定剂对再生率的影响　本研究
采用 MYP 再生培养基分别加入 0.6 mol/L 蔗
糖 ,甘露醇和 KCl作为渗透压稳定剂 ,再生率见
表 8。由表 8 可见 ,蔗糖是姬松茸原生质体再生
的最佳渗透压稳定剂 ,这一结果与一些担子菌原
生质体再生实验结果一致[ 9] 。
　表 7　再生培养基种类对于原生质体再生率的
　　　　影响
培养基种类 原生质体再生率/ ‰
PDA 0.01±0.31
SMY 1.14±0.40
M YP 1.19±0.19
MS 0.54±0.11
　注:渗透压稳定剂为 0.6mol/ L蔗糖
　表 8　渗透压稳定剂对姬松茸原生质体再生率
　　　　的影响
渗透压稳定剂 原生质体再生率/ ‰
蔗糖 1.11±0.17
甘露醇 1.04±0.23
KCl 0.69±0.19
　注:再生培养基为 MYP ,渗透压稳定剂浓度均为 0.6mol/ L
2.2.3　酶解时间对再生率的影响　据文献报道 ,
原生质体再生率与菌丝酶解时间有关 ,本研究对
此进行实验 ,结果见表 9。
　表 9　酶解时间对姬松茸原生质体再生率影响
酶解时间/ h 原生质体再生率/ ‰
1.5 1.30±0.20
2.5 1.24±0.23
3.5 0.69±0.19
4.5 0.11±0.09
　注:再生培养基为 MYP ,渗透压稳定剂浓度均为 0.6mol/ L
　　由表 9 可以看出 ,对于姬松茸以酶解 1.5 ～
2.5 h 的原生质体的再生率较高 ,这可能与细胞
膜受酶破坏的程度有关。
2.2.4　单层平板培养法与双层平板培养法的影
响　有文献显示 ,在双层平板的培养基中担子菌
的原生质体再生率较单层平板高 ,本研究对此进
行比较 ,结果见表 10。
　表 10　单层与双层平板培养法对姬松茸原生
　　　　质体再生率的影响
平板层数 原生质体再生率/ ‰
1 1.10±0.16
2 1.15±0.13
　注:再生培养基为 MYP ,渗透压稳定剂为 0.6mol/ L 蔗糖
　　由表 10 可见 ,单层与双层平板培养法对于
姬松茸原生质体再生率的影响无显著性差别 ,因
此可采用简单方便的单层平板培养法。
3　结　语
　　原生质体诱变和融合是真菌遗传改良的有效
方法 。影响真菌原生质体形成再生的因素错综复
杂 ,而且酶解条件因菌种而异。本文首次较系统
地研究了姬松茸原生质体形成和再生的条件 。
3.1　原生质体释放条件
(下转 23页)　　
20 　　　　微　生　物　学　杂　志　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷
　　在本研究中 ,对酒类酒球菌的苹果酸-乳酸酶
基因进行了克隆测序 ,这是将 mle 向酵母菌中转
移的基础 。Labarre 等(1996)对酒类酒球菌和乳
酸乳球菌 mle 的测序分析表明 ,二者具有较高的
同源性 ,这也表明 mle 在进化过程中较为保守。
进一步的研究表明 , mle 与真核生物或原核生物
的苹果酸酶基因也有较高的同源性 ,它们都属于
苹果酸酶基因家族成员[ 6] 。
酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶(MLE)是完成苹
果酸-乳酸发酵的关键酶 ,相关的还有苹果酸通透
酶(malate permease),该酶负责苹果酸向胞内跨
膜运输 。利用 PCR技术从酒类酒球菌的基因组
DNA中特异性地扩增出 MLE 的编码基因 ,为下
一步将 MLE基因向酿酒酵母(Saccharomyces)和
粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces)中转移奠定
了基础。
参　考　文　献
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crobiol., 1996 , 62:1274～ 1282.
Malolactic Enzyme Gene(mle)Cloning from Oenococcus oeni
ZHANG Chunhui1 , XIA Shuangmei2 , LIU Tianming3
(1.Food S cience and Engineering Postdostoral Programme , Shinew ay g roup-Southern Yangtz University , Luohe , Henan , 462000;
2.Department of plant science , Xinyang Agricultural College , Xinyang , Henan 464000;
3.College of Life Sciences and Technology , Huazhong Agricultural University , Wuhan , 430070)
Abstract　A DNA fragment about 530bps was amplified from geneme DNA of Oenococcus oeni using PCR technique.The
f ragment was then cloned into pCU19 vecto r and subsequently transformed into E.coli JM109.The sequencing result demon-
strated that the cloned DNA fragment w as malolactic enzyme gene(mle).I t is an ORF of 527bp including signal peptide en-
conding region , and it has the same sequence as described in literature.
Keywords　Oenococcus oeni , gene cloning , malolactic enzyme gene(mle).
　　(上接 20页)　　菌龄为 3 ～ 5 d 的菌丝以 1.5 %溶壁酶 ,
0.5 %蜗牛酶和 0.5 %纤维素酶组成的酶系统在
30℃以 KCl为渗透压稳定剂时 ,形成率为 1.4 ～
1.5×107/mL 酶液 。
3.2　原生质体再生条件
以蔗糖为渗透压稳定剂 ,菌丝酶解 1.5 ～ 3
h , 以 SMY和 MYP 为再生培养基 ,姬松茸原生
质体再生率为 1.1 ‰～ 1.3 ‰。
参　考　文　献
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Studies on the Protoplasting and Regeneration of Agaricus blazei Murrill
ZHANG Hui , LIU Changjiang(Shenyang Agaricultural University Shenyang , 110161)
Abstract　This paper repor ts the influence of Lyw allzyme sy stem , concentation ,mycelia age, dewall promoter , osmo tic sta-
bilizer and temperature on Agaricus blazei Murr.protoplasting and different regeneration media , osmo tic stabilizer , mycelia
dialysis time and single , double lay er media on the regeneration rate.The results showed the protoplasting rate for Agaricus
blazei Murr.w as 1.4～ 1.5ⅸ107/m L under the conditons of 1.5% Lywallzyme+0.5% Snailase+0.5% Cellulase 3 ～ 5 days
cultured mycelia at pH5.8 , 30℃ and 0.6mol/ L sugar used as osmo tic stabilizer after 1.5～ 3 hrs degestion.The regeneration
ration w as 1.1‰～ 1.3‰under the conditions of SM Y and M YP as media and sucrose as osmotic stabilizer.
Keywords　Agaricus blazei Murrill , protoplast , regeneration.
233期　　　　　　　　　　　　　　　　张春晖等:酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的克隆