全 文 ：文章编号:1001-4829(2007)05-1097-04
　　收稿日期:2007-04-28
　　作者简介:陈芳草(1979-), 四川彭州人 ,研究实习员 ,主要从
事菌类研究工作。
羊肚菌原生质体制备和再生
陈芳草 ,谭方河 ,刘兴蓉
(四川省林业科学研究院 ,四川 成都　610066)
摘　要:本文从菌丝培养 、菌丝酶解 、原生质体再生等方面研究了尖顶羊肚菌(Morchellaconica)A401和粗腿羊肚菌(M.crassieps)
一个菌株 E903的原生质体制备与再生条件 ,结果表明:两供试菌种在 20℃下于营养丰富的现配液体培养基③中匀速振荡培养 2
～ 4d可得菌龄一致、活力强 、量大的菌丝体 ,收集菌丝体洗涤吸干水分后在现配酶液①中于 30℃恒温下振荡酶解 3.5h原生质体
产量最高(A401为 3.8×106 个 /100mg· mL, E903为 3.6×106个 /100mg· mL),再将分离纯化的原生质体悬液单层涂布到新鲜
的③号再生平板上 , 20℃恒温培养 3 ～ 5d后可得大量再生菌落(最高再生率A401为 0.78%, E903为 0.8%)。
关键词:羊肚菌;原生质体;制备;再生;酶解;渗透压稳定剂
中图分类号:S567.3　　　文献标识码:A
PreparationandregenerationofprotoplastsfromMorchelasp.
CHENFang-cao, TANFang-he, LIUXing-rong
(ForestConservationResearchInstitute, SichuanProvincialAcademyofForestrySciences, SichuanChengdu610066, China)
Abstract:FortheMorchelasp., preparationandregenerationconditionsofprotoplastwerereportedinthispaper.Theresultsshowedthatthe
optimalliquidmediumandtimeforthemycelialgrowthoftwostrainswereNo.③liquidmediumand2-4days, respectively, theappropri-
ateliquidenzymes, enzymolysistimeandtemperatureforthemycelialdigestingwereNo.① liquidenzymes, 3.5hand30℃.Ontheother
hand, therewerealotofregenerationcolonyinNo.③ regenerationmediumafter3-5days.
Keywords:Morchela;protoplast;preparation;regeneration;enzymolysis;osmoticpressurestabilizer
　　羊肚菌是一种味道鲜美 、营养丰富的食 、药兼用
菌 ,具有极高的市场价值。许多年来 ,各国研究人员
除在生态 、生理 、分类 、发酵等方面投入大量研究外 ,
仍主要致力于突破羊肚菌的人工栽培技术 ,但至今
除美国一家公司能大规模人工栽培羊肚菌外 ,其他
仅停留于探索阶段或能栽培但重复性差 ,无法扩大
生产。目前已能人工栽培羊肚菌 ,但稳定性差 ,为寻
找优异的适栽品种 、丰富菌种资源 ,我们进行了大量
的菌种选育 ,除常规的育种手段外 ,采用了先进的原
生质体融合技术 。在前期原生质体制备与再生实验
中筛选出适宜供试菌株的制备与再生系统 ,为后步
的融合奠定了良好的基础 ,具体报道如下 。
1　材料与方法
1.1　供试菌株
尖顶羊肚菌(Morchelaconica)A401号 ,粗腿羊
肚菌(Morchelacrasieps)E903号 。
1.2　菌丝培养基
菌种培养基(MPDA):土豆 200 g+葡萄糖 18 g
+KH2PO41 g+MgSO4 0.5 g+琼脂 18 g+水 1000
mL。液体培养基①:土豆 200 g+蔗糖 15 g+酵母
粉 1 g+水 1000 mL。液体培养基②:土豆 200 g+
葡萄糖 18 g+KH2PO4 1 g+MgSO4 0.5 g+水 1000
mL。液体培养基③:土豆 200 g+蔗糖 10 g+葡萄
糖 10 g+酵母粉 4 g+KH2PO4 1 g+MgSO4 0.5g+
水 1000 mL。液体培养基④LCYM:葡萄糖 20 g+蛋
白胨 2g+酵母膏 1g+KH2PO4 0.46 g+MgSO4 0.5
g+K2HPO4 1 g+水 1000 mL。
1.3　酶解液
酶液①:蜗牛酶 4 mg/mL+纤维素酶 4 mg/mL
+溶壁酶 5 mg/mL+0.6 MKCl。酶液②:溶壁酶
15mg/mL+0.6MKCl。酶液③:蜗牛酶 4mg/mL+
纤维素酶 4 mg/mL+溶壁酶 5 mg/mL+0.6 MMg-
SO4。酶液④:溶壁酶 15 mg/mL+0.6 MMgSO4。
酶液⑤:蜗牛酶 4 mg/mL+纤维素酶 4 mg/mL+溶
1097
2007年 20卷 5期
Vol.20　　No.5　　　　　　　　　　　　　　
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences
DOI :10.16213/j.cnki.scjas.2007.05.048
壁酶 5 mg/mL+0.6 M蔗糖。酶液 ⑥:溶壁酶 15
mg/mL+0.6M蔗糖。
1.4　再生培养基
再生培养基 ①:土豆 200 g+葡萄糖 18 g+
KH2PO4 1 g+MgSO4 0.5g+琼脂 18 g+水 1000 mL
+0.6 M甘露醇;再生培养基②:土豆 200 g+葡萄
糖 18 g+KH2PO4 1g+MgSO4 0.5g+琼脂 18g+水
1000mL+0.6M蔗糖;再生培养基③:土豆 200g+
葡萄糖 18 g+KH2PO4 1g+MgSO4 0.5g+琼脂 18g
+水 1000 mL+0.3 M环己六醇 +0.3 MKCl;再生
培养基④:蔗糖 20 g+酵母粉 2 g+蛋白胨 2 g+
KH2PO4 1 g+MgSO4 0.5g+琼脂 18 g+水 1000 mL
+0.3 M环己六醇 +0.3 MKCl;再生培养基 ⑤:
LCYM+琼脂 20g+0.6M蔗糖。
1.5　方法
1.5.1　原生质体制备　菌丝培养:先转接活化菌株
A401、E903分别于 MPDA平板菌种培养基上 ,制成
平板菌种 ,用同一打孔器(Υ=8 mm)沿同一半径打
孔 ,将菌种块接种于 MPDA平板玻璃纸中央 ,或液
体培养三角瓶中(每瓶 100 mL/250 mL,接 10块),
然后置于 20 ℃恒温下静培或摇床轻微匀速振荡培
养(40 r/min), 3 ～ 4 d后分离活力强的菌丝到无菌
水中清洗 2 ～ 3次 ,用无菌滤纸吸干水分称取适量
(一般 0.1 g/mL酶液)菌丝置于酶解容器中备用 。
菌丝酶解:称取实验配方酶类于供试浓度的渗稳剂
中充分溶解 ,经无菌微孔滤膜(Υ=0.45 μm)过滤
除菌 ,然后注入盛放待酶解菌丝的容器内 ,于 25、30
和 35 ℃ 3种恒温下静置或摇床振荡酶解 (80 r/
min),一段时间后即可得游离原生质体。
1.5.2　原生质体再生　酶解完成后将酶解液通过
无菌擦镜纸过滤去除菌丝残片 ,然后将滤液以 2000
r/min的速度离心 15 min,直至镜检上清液无原生
质体后吸去上清夜 ,用渗稳剂洗涤定容。纯化的原
表 1　不同液体培养基对原生质体产量的影响
Table1　Theefectonprotoplastyieldindiferentliquidmedium
菌株
Strain
液体培养基
Liquidmedium
原生质体产量(个 /100mg· mL)
Protoplastyield
A401 ① 2.48×106
② 3.1×106
③ 3.8×106
④ 2.0×106
E903 ① 2.6×106
② 3.04×106
③ 3.6×106
④ 1.95×106
　　注:所有原生质体的分离在酶液①中进行。
Note:AlprotoplastisolationswereinNo①liquidenzymes.
生质体悬液用无菌移液管以 0.1mL/皿的量注入再
生培养基及对照培养基 ,然后用无菌的之字形玻棒
推匀于 20℃恒温下培养观测 ,双层平板培养则在推
匀原生质体悬液后在其上倒入适量的上层培养基
(琼脂量 0.2 % ～ 0.5%,成分同下层)覆盖 ,然后相
同恒温培养观测。
2　结果与分析
2.1　原生质体制备
2.1.1　菌丝培养对原生质体产量的影响　首先 ,进
行正规实验前我们通过预备实验得出结论:在培养
方式上 ,两菌株都以液体轻微匀速振荡的方式在 20
℃恒温下进行培养 2 ～ 4d可得活力强 、产量高的菌
丝 ,液体浅层静培其次 ,而用玻璃纸在平板上固培菌
丝产量最低 、菌龄不一致 、活力也差 ,所以菌丝培养
均采用液体摇床匀速振荡的方式进行。第二 ,从表
1和表 2所列结果看 ,两菌株在所有液体培养基中
生长都能分离出原生质体 ,但在不同培养基中所得
原生质体的产量差异极显著 ,液体培养基③中两菌
株都可得最高制备率的原生质体 ,培养基②其次 , ①
和④较差 。由上可知培养制备原生质体的供试菌丝
宜在液体培养基③中于 20 ℃恒温摇床培养箱中振
荡培养 ,培养时间(菌龄)以菌丝处于指数生长期(2
～ 4 d)为佳 。
2.1.2　菌丝酶解对原生质体产量的影响　同样 ,通
过预备实验可知:菌丝酶解利于原生质体释放 ,恒温
下轻微匀速振荡酶解效果优于静置酶解;酶解温度
以略高于供试菌丝生长适温(20 ～ 25℃)即 30℃时
最佳 ,偏高(35 ℃)菌丝易老化 ,制备的原生质体活
力不强影响后步再生 ,偏低(25 ℃)酶类活性不强 ,
不易发挥作用;酶解时间太短菌丝酶解不完全 ,原生
质体释放少 ,随时间推移产量增加 , 3.5 h达到较高
水平 ,后来虽有少量增加 ,但酶解时间如果太长 ,许
多原生质体及细胞壁受到严重破坏而影响后步再
生 ,甚至会造成原生质体的破裂或溶解使原生质体
表 2　不同培养基中原生质体产量的差异显著性
Table2　Significantdiferenceofdiferentmediumonprotoplastyield
培养基
Medium
原生质体产量
(个 /100mg· mL)
Protoplastyield
差异显著性
Significanceofdiference
0.05 0.01
③ 3.7×106 a A
② 3.07×106 b B
① 2.54×106 c C
④ 1.98×106 d D
　　注:小写和大写英文字母分别表示 P=0.05和 P=0.01水平上
的差异显著性,下同。
Note:Smalandcapitalletersindicatedthesignificantdiferencesat
P=0.05andP=0.01levelsrespectively, similarlyhereinafter.
1098 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　20卷
表 3　不同酶液对原生质体产量的影响
Table3　Efectonprotoplastyieldofdiferentliquidenzymes
菌株
Strain
酶液
Liquidenzymes
原生质体产量(个 /100mg· mL)
Protoplastyield
A401 ① 3.8×106
② 2.8×106
③ 3.12×106
④ 2.86×106
⑤ 2.6×106
⑥ 2.2×106
E903 ① 3.6×106
② 3.0×106
③ 3.04×106
④ 2.88×106
⑤ 2.32×106
⑥ 2.24×106
　　注:所有分离原生质体的菌丝在培养基③中培养。
Note:AlmyceliawereculturedinNo.③liquidmedium.
产量迅速下降 ,所以酶解时间以 3.5 h最佳 。而酶
液成分对原生质体产量的影响从表 3和表 4可知 ,
酶液①酶解菌丝所得原生质体产量最高 ,与其他酶
液差异极显著 , ③②④号酶液之间无显著差异 ,但与
⑤⑥号酶液差异显著或极显著 ,由此可见 ,两菌株在
复合酶类酶液中原生质体制备率高于单一酶 ,用
KCl、MgSO4等无机盐作渗透压稳定剂效果优于蔗
糖等糖类 。因此 ,供试菌株的最佳酶解条件为:在
30 ℃恒温下 ,以摇床匀速振荡的方式用酶液①酶解
菌丝 3.5 h可得最高原生质体制备率。
2.2　原生质体再生
通过原生质体再生预备实验得知:原生质体再
生除需适宜的再生培养基外 ,再生温度选择也非常
重要适宜供试菌株生长的温度有利于原生质体重新
长出细胞壁 ,形成菌落;再生方式有单层平板涂布和
夹层平板涂布两种方法 ,二者的再生率差异不明显 ,
相比而言 ,单层涂布法简便易操作 、不易污染 ,而夹
表 4　不同酶液中原生质体产量的差异显著性
Table4　Significantdiferenceofdiferentliquidenzymesonproto-
plastyield
酶液
Liquidenzymes
原生质体产量
(个 /100mg·mL)
Protoplastyield
差异显著性
Significanceofdiference
0.05 0.01
① 3.7 ×106 a A
③ 3.08×106 b B
② 2.9 ×106 b BC
④ 2.87×106 b BC
⑤ 2.46×106 c CD
⑥ 2.22×106 c D
表 5　不同再生培养基对原生质体再生率的影响
Table5　Efectofdiferentregenerationmediumontheregeneration
rateofprotoplast
菌株
Strain
再生培养基
Regenerationmedium
再生率(%)
Regenerationrate
A401 ① 0.62
② 0.68
③ 0.78
④ 0.49
⑤ 0.25
E903 ① 0.58
② 0.71
③ 0.8
④ 0.55
⑤ 0.22
层涂布虽有利于保护原生质体 ,但操作不便且易污
染 ,所以本研究选择单层平板涂布法接种原生质体;
培养时间最早 40 h左右即可见再生菌落 , 3 ～ 5 d后
大量发生 。再生培养基的选择从表 5和表 6所得结
果看 ,培养基⑤再生率最低 ,与其他培养基相比差异
极显著 ,其余各培养基间也差异显著 ,其中培养基③
最好 ,培养基②其次 , ①和④再次 。故进行供试菌株
原生质体再生培养的最佳条件为:在再生培养基③
中以单层平板涂布的方式接种原生质体于 20 ℃恒
温下培养 , 3 ～ 5d后可见大量再生菌落 。
3　讨论与结论
　　本实验在借鉴前人经验和大量预备实验的摸索
中 ,初步选择出适宜本课题保存的两重要商业菌种
的原生质体制备及再生系统 ,所得制备率和再生率
都达到了国内相同研究[ 1 ～ 5]的较高水平 ,也从中发
现许多问题:1)如菌丝培养方式上与李刚等 [ 6]研究
者的结论(静止培养优于振荡培养)有差异 ,我们实
验得出在低转速(40 r/min)的摇床上振荡培养菌丝
既给菌丝生长提供了更充足的氧气 ,短时间即可得
表 6　不同再生培养基中原生质体再生率的差异显著性
Table6　Significantdifferenceofdiferentregenerationmediumon
theregenerationrateofprotoplast
再生培养基
Regeneration
medium
再生率(%)
Regenerationrate
差异显著性
Significanceofdiference
0.05 0.01
③ 0.79 a A
② 0.695 b AB
① 0.6 c BC
④ 0.52 d C
⑤ 0.235 e D
10995期 　　　　　　陈芳草等:羊肚菌原生质体制备和再生
到大量菌龄一致 、粗壮 、活力强的菌丝 ,又不会形成
结构致密的菌丝球而影响与酶液接触面积降低制备
率 ,效果优于静止培养 。 2)在再生培养中 ,本实验
结果显示培养基成分以营养丰富的 MPDA最优 ,化
学合成的再生培养基④和⑤较差;渗透压稳定剂则
以 0.3MKCl和 0.3 M环己六醇配合使用再生率
高 、再生速度最快(40 h左右可见再生菌落)、再生
菌落形态好 ,而 0.6M蔗糖再生率虽其次 ,但因糖浓
度高再生培养极易出现污染 ,无菌操作要求严格 ,
0.6M甘露醇再生率再次 ,菌落形态较差 ,这一结果
也与崔宗强等[ 4]以蔗糖作渗透压稳定剂的 CYM平
板上再生率最高 、再生菌落出现最快有明显差异 。
3)几乎所有研究者在酶解完成将酶解液过滤去除
菌丝残片后都要对滤液进行离心再进行再生培养 ,
但李刚等指出过滤并离心进行纯化后 ,原生质体的
收获量显著降低 [ 6] ,我们知道过滤是为去除菌丝残
片以免影响原生质体计数和引起再生误差 ,而离心
前后所去除的成分为酶类 ,根据酶为活性物质在适
宜温度(溶壁酶为 20 ～ 40 ℃)范围外活性差 、一定
时间后会逐渐失活 ,本课题探索性地将酶解液过滤
后不进行离心直接涂布再生 ,通过观察再生效果较
好 2 d左右再生菌落出现 ,数量较多 ,只是为观察性
实验未进行数据统计和分析),从中可见酶对原生
质体再生的影响不是很大 ,如果在以后的实验中通
过数据比较离心前后再生率无显著差异就可以省去
离心这一步 ,这样既不损耗原生质体又减少操作步
骤避免污染。
综上所述 ,因原生质体制备与再生受许多因素
(菌种 、菌丝培养基组分 、菌丝培养方式 、培养温度 、
菌龄 、酶的种类及浓度 、酶解温度 、酶解时间 、渗稳剂
种类及浓度 、酶解 pH、再生培养基组分 、再生方式及
温度等)影响 ,不同的食用菌种以及时间 、浓度 、温
度等条件间的相互作用都会得到不同的实验结果 ,
羊肚菌原生质体技术的研究更与其室内基础研究和
人工栽培进展息息相关 、相辅相成 ,所以对于羊肚菌
原生质体的制备和再生还有待进一步探索研究。
参考文献:
[ 1]张鉴铭 ,郑玉萍 ,陈梅英 ,等.尖顶羊肚菌原生质体的分离及再生
[ J] .云南植物研究 , 1989, 11(4):449-452.
[ 2] 刘士旺 ,梁宗琦 ,刘爱英.羊肚菌原生质体制备及其再生 [ J].
西南农业学报 , 1997, 10(4):75-80.
[ 3] 刘士旺 ,梁宗琦 ,刘爱英.羊肚菌原生质体诱变筛选高生物量高
氨基酸含量菌株 [ J] .菌物系统 , 1999, 18(2):168-171.
[ 4] 崔宗强 ,罗信昌.羊肚菌原生质体制备与再生 [ J].菌物系统 ,
2003, 22(3):498-501.
[ 5] 陈　军 , 曾家豫 ,唐思伟 , 等.黑脉羊肚菌培养条件选择与原生
质体制备 [ J] .西北师范大学学报(自然科学版), 2003, 39(4):
74-75, 79.
[ 6]李　刚 ,李宝健.灵芝原生质体分离与再生研究 [ J] .菌物系统 ,
1999, 18(1):79-88.
(责任编辑　陈　虹)
1100 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　20卷