全 文 ：食用菌学报 2007.14(2):77～ 80
收稿日期:2007-03-26 原稿;2007-05-16 修改稿
基金项目:武汉市市属高等学校 2006 年度科学研究项目“巴西蘑菇标准化生产体系的建立”[ 武教高(2006)5 号] 的
部分研究内容
作者简介:周　全(1971-), 男 , 1991 年毕业于华中农业大学植物保护专业 ,学士 ,工程师 , 主要从事植物组织培养
和食用菌研究与教学工作 , 发表主笔论文 2 篇。
文章编号:1005-9873(2007)02-0077-04
姬松茸液体菌种制备初探
周　全 , 唐兴国 , 姚志伟 , 高军伟
(武汉生物工程学院生物工程系 ,湖北武汉 430415)
摘　要:通过正交试验筛选出适宜培养姬松茸液体菌种的合成培养基(N6 Ⅰ 20.0%, N6 Ⅱ 30.0%,蔗糖5.0%,
酵母粉 0.3%),以此制备的一级摇瓶种和二级摇瓶种 ,其菌丝体生物量分别为 1.48±0.06 g/100 mL 和 2.64
±0.05 g/100 mL 。栽培试验表明 ,液体菌种的发菌时间比固体菌种缩短 13 d。
关键词:姬松茸;N6培养基;摇瓶培养;液体菌种
中图分类号:S646.150.4　　　　文献标识码:A
　　姬松茸(Agaricus blazei Murrill)又名巴西
蘑菇 、小松菇 ,属担子菌亚门 、层菌纲 、伞菌目 、蘑
菇科 、蘑菇属 ,是一种很有开发前途的食药用真
菌。其子实体含有多糖 、核酸和甾醇类等多种生
物活性物质以及人体必需的多种氨基酸等成分 ,
经常食用 ,可以降低血压和胆固醇 ,且对肿瘤 、痔
疮和神经痛等具有一定疗效[ 1] 。我国于 20世纪
90年代初从日本引进姬松茸菌种 ,近年来在福
建 、四川和湖北等地有一定规模的栽培 ,其生产
用种多为麦粒种。1997年以来 ,有关姬松茸深层
发酵的研究较多[ 2-7] ,然而在姬松茸液体菌种制
作的过程中 ,常出现一级摇瓶种子生物量较低 ,
二级摇瓶种子菌丝球数量少 、生长速度慢 、菌丝
球个体大和接种固体培养基萌发慢 、生长无优势
等问题 ,制约了姬松茸液体菌种在实际生产中的
应用 。因此 ,我们在以前姬松茸发酵研究的基础
上 ,探索了姬松茸液体菌种的制作工艺 ,以适应
工厂化制种及栽培的需要 。
1　材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌种
姬松茸 ABM-3号试管保藏种引自华中农业
大学菌种实验中心。
1.1.2 母种活化培养基
①PDA 培养基:马铃薯 200 g/L , 葡萄糖
20 g/ L ,琼脂 20 g/ L;②麸皮加富 PDA 培养基:麸
皮 100 g 煮沸 30 min ,浸提 ,取汁加入 PDA 中;
③加盐 PDA 培养基:PDA 中加入 MgSO4·7H2O
0.5 g/ L ,CaCl2 0.1 g/L , KH2 PO4 1.0 g/L , FeSO 4
0.1 g/L ,(NH4)2 SO4 3.0 g/ L。pH 均为7.0。
1.1.3 N 6贮备液
依据植物组织培养 N 6培养基配方[ 8] ,分别配
制无机大量元素贮备液 N6 Ⅰ和有机成分贮备液
N 6 Ⅱ ,贮备液 N 6 Ⅰ的成分为:KNO3 28300 mg/L ,
(NH 4)2SO4 4630 mg/L , CaCl2·2H2O 1660 mg/L ,
MgSO4·7H2O 1850 mg/L ,KH2PO4 4000 mg/ L;贮
备液 N6Ⅱ的成分为:烟酸 50 mg/ L , VB6 50 mg/L ,
VB1100 mg/L ,甘氨酸 200 mg/L。
1.1.4 原种及栽培培养料
原种及栽培培养料配方均为:发酵棉籽壳
84%,麸皮 10%、发酵牛粪粉 5%、石膏1%、碳酸
钙 1%、pH 值 7.0 、含水量 65%。
1.2 方法
1.2.1 母种活化培养
取 A BM-3试管保藏种 ,分别接到 3 种母
种活化培养基中 ,每管接入 0.5 ×0.5cm 菌种
块一块 ,每个处理 10 支试管 , 于 25 ℃恒温培
养箱中暗培养 , 观察菌丝的萌发时间 、满管天
数和菌丝生长势 。由此筛选出适宜的母种活
化培养基 , 并将优选出的 A BM-3 试管种作为
试验用母种 。
DOI :10.16488/j.cnki.1005-9873.2007.02.017
食　用　菌　学　报 第 14 卷
1.2.2 ABM-3菌液的制备
1.2.2.1 用于液体合成培养基筛选的一级摇瓶
种制备
将已活化 15 d的 ABM-3试管种接入培养液
[蔗糖 2%、黄豆粉 1%、玉米粉 2%、酵母粉0.2%、
(NH 4)2 SO 4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、CaCO 3
0.1%]中 ,每瓶接 0.5×0.5 cm的菌丝块 4块 ,25 ℃
静置培养 48 h ,再于150 rpm恒温摇床培养 8 d。
1.2.2.2 液体合成培养基筛选
选取 N 6 Ⅰ 、N 6 Ⅱ 、蔗糖 、酵母粉四因子 ,设计
L9(34)正交试验 ,试验因素与水平见表 1。每处
理 4 个重复 , 分装于 250 mL 锥形瓶中 , 每瓶
50 mL ,8层纱布封口 , 121 ℃灭菌 35 min 。接入
5 mL 制好的 ABM-3 一级摇瓶种子 , 于 25 ℃、
150 rpm 摇瓶培养 5 d ,发酵结束后 ,培养液经中
性滤纸过滤 ,过程中用蒸馏水冲洗数次 ,于 60 ℃
烘至恒重 ,测定菌丝体干重。并依此评定筛选适
宜 ABM-3的液体合成培养基。
表 1　正交试验 L9(34)因素和水平
Table 1 Factors and levels in the orthogonal test L9(34)
水平
Level
因素 Factor s(%)
A
N6Ⅰ
(v/ v)
B
N6Ⅱ
(v/v)
C 蔗糖
Sucro se
(w/v)
D酵母粉
Yeast powder
(w/ v)
1 10.0 10.0 2.0 0.2
2 20.0 20.0 3.0 0.3
3 30.0 30.0 5.0 0.5
1.2.2.3 液体静置培养
制备经正交试验筛选出的液体合成培养基 ,
分装于 250 mL 锥形瓶中 ,每瓶 50 mL ,共 2瓶 ,瓶
中各放入磁力搅拌子一个 ,灭菌后每瓶接入 4 块
(0.5×0.5 cm)已活化的 ABM-3试管种 ,25 ℃暗
室静止培养 5 d后 ,将锥形瓶置于磁力搅拌器上搅
拌培养 12 h ,获得含有菌丝片断的菌液 。
1.2.3 摇瓶培养
将液体静置培养得到的菌液 ,按 10%的接种
量接入筛选出的液体合成培养基中(250 mL 锥形
瓶 ,50 mL装量),于 25 ℃、150 rpm 摇瓶培养5 d ,
制得一级摇瓶种 10瓶;参照蔡德华等(2003)[ 6] 的
配方选用 250 mL 锥形瓶装量70 mL ,接入 10%一
级摇瓶种 ,25 ℃、190 rpm 培养 5 d ,得到二级摇瓶
种10瓶。分别随机抽样 3瓶测定一级摇瓶种和二
级摇瓶种的菌丝体生物量。
1.2.4 栽培试验
培养料采用 17×36 cm 聚乙烯折角袋分装 ,
装料高度为 12 cm , 121 ℃灭菌 2.5 h 。将二级摇
瓶种接入栽培袋的培养料中 , 每袋接种菌液
10 mL 。原种制备采用 250 mL 锥形瓶分装 ,装
料高度为 3 cm ,25 ℃培养 15 d。将固体原种接入
同样栽培袋的培养料中作为对照 ,每袋接入薄薄
一层原种覆盖料面。每处理接种 10 袋 ,于 25 ℃
恒温培养 ,比较菌丝满袋的时间。
2　结果与分析
2.1 母种活化培养试验结果
　　姬松茸菌丝在不同活化培养基上的生长见
表 2。①号培养基上菌丝稀疏;②号培养基上 ,菌
丝茂密 ,先端整齐 ,气生菌丝发达;③号培养基上
菌丝萌发快 ,但后期菌丝与①号培养基上的菌丝
生长势相当 ,明显差于 ②号培养基上的菌丝 ,这
可能是培养基中的小分子无机营养成分能更快
地被姬松茸利用所致 。由此可知 ,麸皮加富 PDA
培养基是适宜于 ABM-3 母种活化和扩繁的培
养基 。
2.2 液体合成培养基正交试验结果
　　N 6培养基提供 N 源 、矿质元素及生物因子 ,
蔗糖和酵母粉提供 C 源 、N 源 ,进行 L9(34)正交
试验 ,测定菌丝体干重。由表 3可知 ,7号组合的
菌丝体干重最高 ,达到 0.85 g/100 mL ,极差表
明 ,各因子的最优组合是 A2 B3 C3 D2 , 即 N 6Ⅰ
20.0%,N6Ⅱ30.0%,蔗糖 5.0%,酵母粉0.3%。
表 2　不同活化培养基对菌丝生长的影响
Table 2　Effect of dif ferent stock medium on mycelial growth
培养基编号
Medium
萌发天数
Germination time(d)
满管天数
Co lonization time(d)
菌丝长势
Mycelial vig or 1)
气生菌丝
Aeria l hyphae
① 3 12 + 较少 few
② 3 12 +++ 较多 many
③ 2 11 ++ 较少 few
1)“+”稀疏 spa rse mycelium;“ ++”一般 moderate mycelium ,“ +++”密集 vig orous mycelium
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第 2 期 周　全 , 等:姬松茸液体菌种制备初探
表 3　液体合成培养基正交试验 L9(34)结果
Table 3　Result from orthogonal test L9(34)
试验号
No. A B C D
菌丝平均干重
Ave rage myce lial weight(g/100mL)
1 1 1 1 1 0.35
2 1 2 2 2 0.47
3 1 3 3 3 0.77
4 2 1 2 3 0.77
5 2 2 3 1 0.69
6 2 3 1 2 0.80
7 3 1 3 2 0.85
8 3 2 1 3 0.53
9 3 3 2 1 0.64
K1 1.60 1.97 1.68 1.68
K2 2.26 1.69 1.87 2.12
K3 2.01 2.20 2.31 2.06
R1 0.53 0.66 0.56 0.56
R2 0.75 0.56 0.62 0.71
R3 0.67 0.73 0.77 0.69
R 0.22 0.17 0.21 0.15
　　由 R值的比较得出 A>C>B>D可知 ,四因
素中 N 6 Ⅰ对菌丝体生物量的影响最大 ,而酵母粉
的影响最小 。这与贾薇等[ 9] (2002)的报道相
一致 。
2.3 液体静置培养
　　姬松茸菌丝在液体合成培养基上静置培养
过程中 ,无论是在液面 ,还是在液内菌丝均能蔓
延生长 ,培养 5 d 可形成松散的菌絮 。将培养的
锥形瓶置于磁力搅拌器上 ,转动的磁力搅拌子将
菌絮打散 ,经过 12 h 即可获得含有大量菌丝片断
的菌液。
2.4 一级摇瓶种子
　　在制备用于液体合成培养基筛选的一级摇
瓶种的过程中观察到:原试管种小块很快结块成
团 ,很难得到分散的菌丝球;培养 6 d后 ,菌丝开
始挂附于瓶壁 ,继续培养 2 ～ 3 d才可见培养液中
有较为均匀的菌丝球 ,但数量较少 ,整个培养周
期为 9 ～ 12 d。而用液体静置培养后的菌液转入
一级摇瓶培养 , 5 d后即可见菌丝挂壁 ,合成培养
基醪液中含有大量直径约 2 ～ 3 mm 的白色菌丝
球 ,其菌丝体生物量为 1.48 ±0.06 g/100 mL。
但随培养时间的延长 ,菌丝球的颜色逐渐由白变
棕 、由棕而黑 ,失去活力。故宜选用培养 5 d 左右
的一级摇瓶种子转接二级摇瓶培养 。
2.5 二级摇瓶种子
　　二级摇瓶培养 5 d , 菌丝体生物量可达
2.64±0.05 g/100 mL ,菌液内充满菌丝球 ,直径
约2 ～ 3 mm ,大小均匀 ,是非常适合于生产用的
液体菌种 。
2.6 栽培试验
　　采用液体菌种接种袋装栽培培养料 ,菌丝一
般 20 ～ 22 d满袋;而用固体原种(对照)接种相同
培养料 ,菌丝 32 ～ 35 d才满袋。液体菌种发菌比
对照缩短 13 d 。
3　小结
3.1 试验表明 ,麸皮加富 PDA 培养基是适宜于
ABM-3母种活化和扩繁的培养基 。正交试验筛
选出适宜培养姬松茸菌液的液体合成培养基配
方为:N 6 Ⅰ20.0%, N 6 Ⅱ30.0%,蔗糖 5.0%,酵
母粉0.3%,以此液体培养基制备一级摇瓶种和
二级摇瓶种 , 其菌丝体生物量分别为 1.48 ±
0.06 g/100 mL和 2.64±0.05 g/100 mL。栽培
试验表明 ,液体菌种在培养料上发菌快 ,可缩短
生产周期 。
3.2 本试验采用由静置培养到摇瓶培养 、由合成培
养基到天然培养基的工艺制作姬松茸液体菌种 ,并
提出姬松茸液体菌种制作的工艺为:母种活化※液
79
食　用　菌　学　报 第 14 卷
体静置培养※一级摇瓶培养※二级摇瓶培养。对
于大规模生产液体菌种 ,还有待进一步研究。
参考文献
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[本文编辑] 　朱丽娜
Production of Agaricus blaze i Liquid Spawn
ZHOU Quan , TANG Xingguo , YAO Zhiwei , GAO Junwei
(Bioengineer ing Depar tment , Wuhan Bioengineer ing Institute , Wuhan , H ebe i 430415 , China)
Abstract:A synthetic liquid medium consisting of 20.0% N6Ⅰ(mine ral salt solution), 30.0%N6 Ⅱ(vitamin/
amino acid supplement), 5.0% sucrose , 0.3% yeast powder was selected by orthogonal testing for cultur ing
Agaricus blazei mycelium.Mycelial yields from sh aken primary cultur es(50 mL cultur e medium in 250 mL
cultur e bot tles)incubated at 25 ℃ for five days were 1.48 ±0.06 g/100 mL.Mycelial yields obta ined
following tr ansf er of mycelium from pr imary cultures to secondary cultures(70 mL in 250 mL culture bottles)
incuba ted at 25 ℃ for five days were 2.64±0.05 g/100 mL.Coloniz ation of cultivation substr ate using the
liquid spawn from secondary cultures occur red 13 d ear lier compared with normal stock spawn.
Key words:Agaricus blaze Murr ill;N6 cultur e medium;Shaking bottle cultivation;Liquid spawn
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