全 文 ：［收稿日期］ 20150526(012)
［基金项目］ 陕西省教育厅重点实验室科研计划项目(14JS017) ;陕西理工学院 2014 年大学生创新创业训练计划项目(UIＲP14057) ;陕
西省 2014 年春笋计划项目
［通讯作者］ * 周天华，博士，讲师，从事从事植物分子生物学研究，Tel:13488097060，E-mail:zhou3687@ 126. com
开口箭 DNA提取方法比较
周天华1* ，陈征1，李康1，肖瑛1，吴阳阳1，王新红2，陈雨杰2
(1. 陕西理工学院 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001;2. 陕西省汉中中学，陕西 汉中 723000)
［摘要］ 目的:筛选从开口箭不同类型材料中提取 DNA 的最佳方法。方法:采用十二烷基磺酸钠(SDS)法，改良 SDS
法，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和改良 CTAB法 4 种方法分别对开口箭的新鲜茎、硅胶干燥茎、烘干茎、新鲜叶片和硅胶
干燥叶片这 5 类材料进行 DNA提取。从 DNA的完整性、纯度、得率等方面对 DNA进行比较，确定开口箭不同材料 DNA提取
的最适方法。结果:采用改良 CTAB法提取的硅胶干燥茎和叶片的 A260 nm /A280 nm均在 1. 8 ～ 1. 9，纯度最高，且完整性较高，提取
效果较其他方法更佳;其余材料则均有不同程度的污染，新鲜叶片的 A260 nm /A280 nm普遍很低。结论:从硅胶干燥叶片和茎的开
口箭材料中更容易提取出纯度高、完整度好的 DNA。改良 CTAB法是适合开口箭 DNA提取的有效方法，通过改良 CTAB法从
硅胶干燥叶片和茎的开口箭中更容易提取纯度高、完整度好的基因组 DNA。
［关键词］ 开口箭;DNA提取;纯度;新鲜块茎;完整性;改良 CTAB法
［中图分类号］ Ｒ282. 5;Ｒ931. 5;Ｒ284. 1;Ｒ284. 2 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2015)19-0010-04
［doi］ 10. 13422 / j． cnki． syfjx． 2015190010
［网络出版地址］ http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /11． 3495． Ｒ． 20150824． 1004． 016． html
［网络出版时间］ 2015-08-24 10:04
A Comparative Study on DNA Extraction Methods for Tupistra chinensis Tubers and Leaves
ZHOU Tian-hua1* ，CHEN Zheng1， LI Kang1， XIAO Ying1， WU Yang-yang1， WANG Xin-hong2，
CHEN Yu-jie2 (1. School of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong
723001，China;2. Hanzhong Middle School in Shaanxi Province，Hanzhong 723000，China)
［Abstract］ Objective:To choose the best DNA extraction method for different kind of Tupistra chinensis
materials． Method:Sodium dodecyl sulfate (SDS) ，improved SDS，hexadecyl trimethyl ammonium bromide
(CTAB)and improved CTAB methods were used to extract DNA from five different materials of T． chinensis tubers
and leaves，including fresh tubers，silica gel dried tubers，baked tubers，fresh leaves and silica gel dried leaves．
Integrity，purity and yield of extracted DNA was compared in order to determine which method was the best one for
different T． chinensis materials． Ｒesult:Extracting DNA from silica gel dried tubers and silica gel dried leaves
with improved CTAB method performed the highest purity and good integrity，not only its value of A260 nm /A280 nm was
between 1. 8-1. 9，but also with a better integrity． These remaining materials had different levels of pollution，
A260 nm /A280 nm of fresh leaves was generally low． Conclusion:Improved CTAB is the most effective method for DNA
extraction from silica gel dried leaves and tubers materials． Genomic DNA extracted from silica gel dried leaves and
tubers using improved CTAB method performs a better integrity and better purity．
［Key words］ Tupistra chinensis;DNA extraction;purity; fresh tubers; integrity; improved CTAB
method
开口箭别称牛尾七、岩七、竹根七，主要分布于
我国湖北、湖南、江西等地，生长在海拔 1 000 ～
2 000 m林下荫湿处、溪边或路旁［1］，有效成分包括
甾体皂苷、甾体皂苷元等，是秦巴山区重要的植物药
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材资源［2］。开口箭的根状茎可入药，味甘、微苦，性
寒，中医理论认为其具有滋阴泻火、活血调经、散瘀
止痛之作用，可用于治疗风湿关节痛、腰腿疼痛、跌
打损伤、月经不调、骨蒸劳热等［3］。开口箭在彝族
药、瑶族药、壮族药等民族药中均有记载［4］。
近年来，分子生物学技术在药用植物资源研究、
药材药理学研究及药材质量鉴别方面得到了广泛应
用，为药材引种栽培、品种改良、品种鉴定及药材质
量监控提供了良好的手段，对中药材的理论研究及
生产实践具有重要意义［5］。目前提取植物基因组
DNA 的方法很多，最常用的有十二烷基磺酸钠
(SDS)法与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法。这
2 种 DNA提取方法的原理基本一致，均涉及到细胞
裂解破碎，DNA释放，杂质的去除及 DNA 纯化等步
骤［6］。CTAB是一种去污剂，可破碎细胞壁和细胞
膜，并能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶
的，当溶液的盐浓度降低到一定程度时，DNA 从溶
液中沉淀，通过离心，可获得含 DNA的上清液，再用
三氯甲烷和异戊醇混合液使蛋白质变性、分层，同时
除去脂类，可达到提取和纯化 DNA 的目的［7］;SDS
可与蛋白质、多糖等形成复合物，经离心后与 DNA
分开。但植物细胞质中含有的糖类、酚类物质及蛋
白质等都会影响 DNA 的提取效果;植物的种类、部
位不同所含有的糖类、酚类及蛋白质也有差异［8］，
但常规的方法并不能将所有植物材料的 DNA 完整
而又高效地提取出来。此外，实验材料的不同保存
方法对材料中 DNA 的影响很大。例如高温会使材
料中 DNA结构被破坏，而新鲜材料若不及时处理其
DNA会降解［9］。实验过程中常见的开口箭材料有
块茎、叶片，保存方法有硅胶干燥等。因此，实际操
作中常需要对 DNA提取方法进行改良和改进，探究
不同材料 DNA提取的最佳方案。
本实验通过 CTAB法，SDS法以及在这 2 种方法
基础上改良而产生的另外 2种方法来进行探究，同时
根据开口箭不同干燥程度存在的活性差异和不同部
位有效成分含量的差异，将材料分为新鲜、阴干和风
干 3种不同的干燥类型和叶片、块茎 2 种不同的部
位，寻找适合开口箭 DNA提取的方法，以构建完整的
开口箭基因组 DNA提取的改良技术体系。
1 材料
MM400 型生物组织研磨机(德国 Ｒestch 公
司) ，Biophotomeper plus 6132 型核酸测定仪和
Centrifuge 5415Ｒ型离心机(德国 Eppendor 公司) ，
DYY-6C型电泳仪(北京六一) ，UP H-II-40 型超纯
水机(优普) ，ML204 型电子天平(瑞士梅特勒-托利
多公司) ，KG-SX-500 型灭菌锅(Chamber 公司) ，Gel
DocTM XＲ +型凝胶成像系统(BIO-ＲAD 公司)。十
六烷基三甲基溴化铵(CTAB，天津科密欧化学试剂
有限公司) ，十二烷基磺酸钠(SDS，天津市光复精细
化工研究所) ，聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40T，上海蓝季
科技发展有限公司) ，抗坏血酸(天津市福晨化学试
剂厂) ，乙二胺四乙酸(EDTA，天津市百世化工有限
公司) ，DNA Marker(D2000，北京天根生化科技有限
公司)。
开口箭采自陕西省汉中市留坝县火烧店的自然
种群，经陕西理工学院杨培君教授鉴定为百合科植
物开口箭 Tupistra chinensis，在野外采集生长旺盛的
开口箭植株，移栽至实验室种植，对材料进行处理。
取幼嫩叶片和根茎置干净自封袋中，加入硅胶干燥，
常温保存，得硅胶干燥叶片和硅胶干燥茎。取少量
茎在烘箱中烘干，使其失水后常温保存，得烘干茎。
新鲜叶片和新鲜茎材料在实验前不做任何处理，在
提取 DNA 时只需将其从移栽植物上取下并处理干
净即可。
2 方法与结果
2. 1 DNA的提取方法 开口箭材料共有 5 类，分别
为新鲜块茎、硅胶干燥块茎、烘干块茎、硅胶干燥叶片
和新鲜叶片。每类材料各取 24 份样品，分别称取每
份样品的质量，各类样品材料进行组织粉碎和研磨。
2. 1. 1 CTAB法 取 5 类开口箭样品各 6 份，采用
朱威龙等［10］的 CTAB法提取各样品基因组 DNA。
2. 1. 2 改良的 CTAB 法 取 5 类开口箭样品各 6
份，采用吴凯旋等［8］的改良 CTAB 法提取各样品基
因组 DNA。
2. 1. 3 SDS法 取 5 类开口箭样品各 6 份，采用王
关林等［11］的 SDS法提取各样品基因组 DNA。
2. 1. 4 改良 SDS 法 由于传统 SDS 法步骤繁多、
操作时间长且得率较低的问题，拟对传统 SDS 法做
相应改良。改良的过程主要包括在加入 SDS 进行
裂解之前先用预处理液［8］对已经研磨破碎的材料
进行预处理，以除去细胞质中的一些杂质;去掉传统
SDS法中再次溶解、加 ＲNA 酶和乙酸钠等步骤，可
提高得率。具体步骤为 ①取开口箭材料置于 2 mL
离心管中;②加入提取缓冲液［100 mmol·L －1三羟甲
基氨基甲烷(Tris)-HCl(pH 8. 0) ，50 mmol·L －1
EDTA(pH 8. 0) ，500 mmol·L －1 NaCl，10 mmol·L －1
β-巯基乙醇］1 mL，混匀，静置 10 min，于 8 000
r·min －1离心 2 ～ 3 min，去上清;③重复步骤②，提取
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缓冲液加入 900 μL;④向离心管中加入 10% SDS
提取液［2% SDS，100 mmol·L －1 Tris-HCl(pH 8. 0) ，
50 mmol·L －1 EDTA(pH 8. 0) ，500 mmol·L －1 NaCl，
10 mmol·L －1 β-巯基乙醇］100 μL，充分混匀，于
65 ℃水浴中保温 30 min(间隔摇晃 2 ～ 3 次) ;⑤取
出离心管凉至室温，加入 5 mol·L －1乙酸钾 160 μL，
充分混匀，冰浴中放置 30 min;⑥上清液转入新离心
管中，加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(24∶ 1) ，轻轻
颠倒离心管数次，放置片刻;⑦于 4 ℃ 下 8 000
r·min －1离心 10 min;⑧上清液转入另一离心管中，
加入 2 倍量于 － 20 ℃预冷的无水乙醇，混匀，放置
30 min，观察 DNA 沉淀生成;⑨于 4 ℃下 8 000 r·
min －1离心 10 min，倾去上清液，用 80%乙醇洗涤沉
淀;⑩将离心管倒置于吸水纸上，控干上清液。
采用上述 4 种方法对 5 类实验材料提取出的
DNA经低温风干，各加入 0. 1 × TE［含有 10 mmol·L －1
Tris-HCl(pH 8. 0) ，1 mmol·L －1 EDTA(pH 8. 0) ］
200 μL溶解 DNA，放入冰箱备用。
2. 2 基因组 DNA的检测
2. 2. 1 DNA纯度及得率 采用紫外分光光度法检
测，运用核酸测定仪检测 DNA 浓度和纯度。取
0. 1 × TE 50 μL作为空白对照，依次加入 DNA 样品
100 μL，置于比色皿中，记录各样品的浓度，计算
DNA得率。同时记录各样本在 260，280 nm 处的吸
光度 A260 nm与 A280 nm。当 A260 nm /A280 nm在 1. 7 ～ 1. 9，
表示 DNA较为纯净;A260 nm /A280 nm ＜ 1. 7 则有蛋白质
污染;A260 nm /A280 nm ＞ 1. 9 则有核糖核酸(ＲNA)污
染。计算 DNA的含量和纯度，见表 1。结果发现采
用改良 CTAB法提取的硅胶干燥茎和叶片的 A260 nm /
A280 nm均在 1. 8 ～ 1. 9，纯度最高;其余材料则均有不
同程度的污染。新鲜叶片的 A260 nm /A280 nm普遍很低，
原因可能是新鲜材料活性较高，各种代谢产物和后
含物含量也高，在提取过程中不易去除干净。
通过对各种方法提取 DNA的得率进行比较，发
现 CTAB法提取硅胶干燥叶片所得 DNA得率较高，
从叶片提取 DNA的得率普遍比从茎中提取 DNA的
高，且改良 CTAB法和改良 SDS 法的得率普遍比未
改良的要低。改良 SDS 法是在文献［11］中 SDS 法
的基础上，省去一些步骤以减少 DNA的损耗。在提
取前用预处理液处理，可减少杂质等其他物质的干
扰，原理是参考改良 CTAB法加了预处理液，预处理
液与提取液成分相似，只是没有加裂解剂，因此是在
细胞核中 DNA 释放出来之前预先去除植物组织及
细胞质基质中的的蛋白质、多糖、酮类等杂质，这样
可提高 DNA纯度，但也会带走一些植物样品组织，
影响到提取 DNA的得率。
表 1 不同方法对开口箭 DNA提取效率的影响
Table 1 Purity and yield of DNA extracted with four different methods from five kinds of Tupistra chinensis materials
提取方法
A260 nm /A280 nm 得率 /μg·g － 1
新鲜茎 硅胶干燥茎 烘干茎 硅胶干燥叶片 新鲜叶片 新鲜茎 硅胶干燥茎 烘干茎 硅胶干燥叶片 新鲜叶片
CTAB 1. 45 1. 42 1. 23 1. 45 1. 21 353. 63 1 181. 63 623. 71 3 491. 56 1 518. 55
改良 CTAB 1. 64 1. 86 1. 30 1. 84 1. 32 95. 74 690. 19 329. 29 1 041. 63 488. 94
SDS 1. 66 1. 41 1. 41 1. 37 1. 11 120. 15 249. 41 249. 41 793. 55 1 806. 66
改良 SDS 1. 97 2. 22 1. 54 1. 64 1. 28 82. 10 276. 54 710. 97 1 055. 07 533. 60
2. 2. 2 DNA完整性检测 采用 1%琼脂糖凝胶电
泳检测。电泳条件为电压 90 V，电泳时间 50 min，
DNA marker为 D2000，分析 DNA的完整性，见图 1。
结果显示新鲜茎、硅胶干燥茎、硅胶干燥叶片和新鲜
叶片均有明显大片段的存在，完整性都很高，只有烘
干茎的完整性不高，说明烘干燥材料中 DNA 降解
较多。
2. 3 数据分析 运用改良 CTAB 法提取开口箭硅
胶干燥茎和硅胶干燥叶片的 DNA，其 A260 nm /A280 nm
均在 1. 8 ～ 1. 9，数据集中，且琼脂糖凝胶图像中也
有明亮的大片段的条带，完整性较高，说明改良
CTAB法适合开口箭硅胶干燥茎和叶片 DNA 的提
取。对于开口箭新鲜块茎而言，改良 SDS 法虽适合
其 DNA的提取，但 A260 nm /A280 nm略 ＞ 1. 9。4 种方法
提取开口箭新鲜叶片的 DNA时，各方法都能提出大
片段的 DNA，但 DNA 均含有较多杂质，纯度不高。
原因主要是由于提取的 DNA 样品中含有较高的蛋
白质，或含有多酚氧化的褐色物等。烘干茎 DNA降
解严重，其 A260 nm /A280 nm均 ＜ 1. 7，且完整性较差，不
适合提取。
对于 5 种不同类别材料，从 DNA 纯度的角度
看，用改良 CTAB 法提取的硅胶干燥茎和干燥叶片
的 A260 nm /A280 nm均在 1. 8 ～ 1. 9，纯度较其他方法要
高，适合其 DNA的提取;从 DNA 完整性角度来看，
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A． CTAB法;B．改良 CTAB法;C． SDS法;D．改良 SDS 法;1 ～ 6. 样品
编号;Ⅰ． 新鲜茎;Ⅱ． 硅胶干燥茎;Ⅲ． 烘干茎;Ⅳ． 硅胶干燥叶片;
Ⅴ．新鲜叶片
图 1 开口箭 DNA的琼脂糖凝胶电泳效果
Fig． 1 Electrophoretic effect on agarose gel for DNA from
Tupistra chinensis
硅胶干燥茎和干燥叶片的完整性最高，烘干茎的完
整性最低;从 DNA 得率的角度来看，CTAB 法提取
的干燥叶片和新鲜叶片的得率都很高;另由于茎不
易完全研碎，因此其得率误差较大。
3 讨论
本文结果表明相对于其他方式保存的开口箭材
料，用硅胶干燥的茎和叶中提取出的 DNA 完整性
好、纯度高。从开口箭新鲜材料提取的 DNA纯度比
硅胶干燥材料的 DNA纯度低，原因可能是新鲜材料
活性较高，各种代谢产物和后含物含量也高，在提取
过程中不易去除干净;而烘干茎由于烘干过程时间
长、温度高，造成 DNA 大量降解，因此得率低，完整
性差。因此，在分子生物学操作中应避免选用此类
材料提取 DNA。由于植物组织如叶片中含有较高
的多酚、蛋白质、脂类、糖类等不利于 DNA提取的干
扰物质，利用常规的 CTAB 方法等难以获得高质量
DNA［12］，而改良 CTAB法是在 CTAB 法的基础上加
了预处理，有利于杂质的清除，可得到更纯的 DNA。
本文中改良 CTAB法是 4 种方法中最适合用于开口
箭 DNA提取的方法。
CTAB法和改良 CTAB 法相比，CTAB 法所提取
的 DNA得率普遍较高，但其 DNA 纯度并不如改良
CTAB法;SDS法和改良 SDS 法相比较，改良 SDS 法
提取的 DNA的纯度较高，说明对传统方法的改良是
有一定效果的。综合分析，利用硅胶干燥的材料或通
过改良 CTAB法均可得到降解少、杂质少、高质量的
DNA，并且可以将其用于分子生物学实验研究。随着
分子生物学技术的不断发展，将植物的总基因组 DNA
提取出来进行 DNA杂交或基因组克隆的实验需求越
来越多。本文通过对开口箭基因组 DNA的提取方法
进行探究，建立了适合于开口箭 DNA 提取的方法体
系，为该药材的进一步研究工作提供了实验依据。
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［责任编辑 刘德文］
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