全 文 ：　复旦学报(医学版)Fudan Univ J Med Sci 2006 Jul. , 33(4)
RP-HPLC法测定柘树根中四种
异戊烯基口山酮的含量
王枚博 　黄建明 　侯爱君△
(复旦大学药学院生药学教研室　上海　200032)
【摘要】　目的　建立高效液相色谱法(H PLC)测定柘树根中 4 种异戊烯基口山酮的含量。方法　采用 Hype r-
Clone BDS C18(4. 6 mm×250 mm , 5 μm)色谱柱 , 以甲醇-乙腈-0 . 2% 磷酸为流动相 , 梯度洗脱 , 流速 0 . 8 m L/
min ,检测波长 259 nm ,柱温 50 ℃。结果　4 种异戊烯基口山酮在一定范围内均呈良好线性关系 , 平均加样回收率
在 97 . 03%～ 103 . 25%范围内 , RSD < 3. 86%(n=6)。结论　本方法结果准确 、重复性好。
【关键词】　柘树;口山酮;高效液相色谱法
【中图分类号】　R 282. 5　　【文献标识码】　B
　上海市科委中药现代化专项(05DZ19718)项目;上海-SK 研究与发展基金(2004009-t)项目资助。
　△通讯作者　T el:(021)54237472 , Fax:(021)64170921 , E-mail:ajhou@shmu. edu. cn
Determination of four prenylated xanthones in the roots of
Cudrania tricuspidata by RP-HPLC
WANG Mei-bo , HUANG Jian-ming , HOU Ai-jun △
(Department of Pharmacognosy , School of Pharmacy , Fudan University , S hanghai 200032 , China)
【Abstract】　Purpose　To develop a RP-HPLC method for determination of f our prenylated xanthones
in the roots of Cudrania tr icuspidata(Carr.)Bur. 　Methods　The HPLC separation w as carried out
on a HyperClone BDS C 18(4. 6 mm×250 mm , 5 μm)column , using methanol-acetonit rile-0. 2%H 3PO4
as the mobile phase for g radient elution. T he flow rate was 0. 8 mL /min , the detection wavelength was
259 nm , and the temperature of column was 50 ℃. 　Results　Linearity was confirmed for the four pre-
nylated xanthones. T he average recoveries were in the range of 97. 03%-103. 25%with RSDs less than
3. 86%(n=6). 　Conclusions　The method is accurate , repeatable and applicable t o the determination
of f our prenylat ed xanthones in C. tr icuspidata.
【Key words】　Cudrania tricuspidata ;　xanthone;　high performance liquid chromatography
　　柘树 Cudrania tricuspidata(Carr. )Bur. 为桑
科柘属植物 ,其根与同属植物构棘的根入药为中药
“穿破石” ,具有祛风除湿 、活血通经 、健脾益胃及消
炎止痛等功效[ 1] ,临床上用于治疗风湿关节痛 、跌打
损伤 、脾虚泄泻及黄疸等症[ 2] ,近年来又用于治疗胃
癌等消化系统肿瘤[ 3 , 4] 。我们从中分离 、鉴定了多
种异戊烯基口山酮化合物 ,其中柘树口山酮乙 、maclu-
raxanthone B 、柘树口山酮己和柘树口山酮丁等部分化
合物对胃癌 、肝癌和结肠癌等人消化系统肿瘤细胞
株显示显著的细胞毒活性[ 5 , 6] 。我们首次建立了高
效液相色谱法(HPLC法)测定柘树根中 4种异戊烯
基口山酮类化合物的含量。
材 料和 方 法
仪器与材料　Agilent 1100型高效液相色谱仪
(美国惠普公司 ,包括 G1322A 在线脱气 、G1311A
四元泵 、G1316A 柱温箱 、G1315B DAD 紫外检测
器 、HP ChemStat ion 色谱工作站);Diaion HP-20
大孔吸附树脂(日本三菱)。
柘树根药材分别于 2001年 11月(sample A)和
2005年 1月(sample B)采于云南大理 。经中国科
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复旦学报(医学版)　2006 年 7 月 , 33(4)　
学院昆明植物研究所李锡文教授鉴定为桑科柘属植
物柘树 C. tricuspidata(Car r. )Bur.的干燥根。
试药　柘树口山酮乙 、macluraxanthone B 、柘树
口山酮己和柘树口山酮丁对照品均为自制 ,经 UV 、IR 、
MS 、1H-NMR 、13C-NMR确定其结构 ,采用 HPLC-
DAD-ELSD法测得其纯度均大于 98%。甲醇(色谱
纯 ,江苏汉邦科技有限公司),乙腈(色谱纯 ,美国
Merck公司),磷酸(分析纯 ,中国医药集团上海化学
试剂公司),纯净水(上海碧纯饮用水有限公司)。
色谱条件　固定相:HyperClone BDS C18(4. 6
mm×250 mm , 5 μm)色谱柱;流动相:甲醇-乙腈-
0. 2%磷酸 ,梯度洗脱 ,程序如表 1 所示;流速:0. 8
mL /min;检测波长:259 nm;柱温:50 ℃。该色谱条
件下混合对照品与柘树根样品色谱图见图 1。
表 1　流动相梯度洗脱程序
Tab 1　Gradient elution program of the mobile phase
Time(min) Methanol(%) Acetonit rile(%) 0.2%H3PO4(%)
0 30 30 40
30 35 30 35
35 55 30 15
40 55 20 25
60 55 20 25
图 1　混合对照品(A)和柘树根样品(B)的 HPLC色谱
Fig 1　HPLC chromatograms of mixed reference
standard(A)and C. tricus pidata(B)
1:cud rat ricu sxanthone B;2:maclu raxanthone B;
3:cudrat ricusxanthone F;4:cudrat ricusxanthone D
混合对照品溶液的制备　分别精密称取柘树
口山酮乙对照品 0. 012 81 g 、macluraxanthone B对照品
0. 011 79 g 、柘树口山酮己对照品 0. 010 30 g 和柘树口山
酮丁对照品 0. 011 51 g ,置于 100 mL 量瓶中 ,用起始
流动相溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,即得(含柘树口山酮乙
0. 128 1 mg /mL ,macluraxanthone B 0. 117 9 mg /mL ,
柘树口山酮己 0. 103 0 mg /mL ,柘树口山酮丁 0. 115 1
mg /mL)。
供试品溶液的制备　取柘树根粉末(过 60目
筛)1 g ,精密称定 ,置 50 mL 具塞锥形瓶中 ,加入
95%乙醇 30 mL ,浸泡过夜 ,超声处理(功率 250
W ,频率 20 kHz)1 h ,减压抽滤 ,用少量 95%乙醇
分次洗涤容器及残渣 ,合并滤液及洗液 ,减压浓缩至
干 ,用无水乙醇 5 mL 溶解 ,再加入 0. 56 mol /L 的
NaCl水溶液 45 mL ,通过已经预处理的大孔树脂柱
(约 5 g , 10 cm ×1 cm),以水 50 mL 预洗 ,弃去水
液 ,再用 95%乙醇 50 mL 洗脱 ,收集洗脱液 ,减压
浓缩至干 ,残渣用起始流动相溶解并转移至 25 mL
量瓶中 , 加起始流动相至刻度 , 摇匀 , 以微孔滤膜
(0 . 45 μm)滤过 ,作为供试品溶液 ,供 HPLC 分析 。
结　　　果
标准曲线和线性范围　分别精密吸取混合对照
品溶液 0. 1 、0. 5 、1 . 0 、2. 0 、4. 0 、5 . 0 mL 于 5 mL 量
瓶中 ,加起始流动相至刻度 ,各进样 20μL 作 HPLC
分析 ,以浓度(C)对峰面积(A)进行线性回归 ,结果
见表 2。
检测限和定量限　在选定的色谱条件下 ,将混合
对照品溶液用起始流动相稀释制成一定浓度进行测
定。结果柘树口山酮乙 、macluraxanthone B 、柘树口山酮
己和柘树口山酮丁 4种对照品的定量限分别为:0. 512
μg /mL ,0. 472μg /mL ,0. 412μg /mL和 0. 460 μg /mL
(S /N≥10);检测限分别为:0. 256μg /mL , 0. 236 μg /
mL ,0. 206μg /mL和 0. 230μg /mL(S /N≥3)。
精密度　取高 、中 、低 3个浓度的混合对照品溶
液 20 μL 作 HPLC分析。每个浓度天内测 3次 ,连
续测 3 d。结果见表 3。
表 2　标准曲线和线性范围
Tab 2　Standard curve and linearity range
Reference stan dard Regression equat ion r Linearity range(μg /m L)
Cudrat ricus xan th one B y = 107. 05 x+29. 755 0. 999 8 2. 56 ～ 128. 1
Macluraxanthone B y = 76. 105 x - 23. 820 0. 999 7 2. 36 ～ 117. 9
Cudrat ricus xan th one F y = 70. 699 x - 5. 8733 0. 999 9 2. 06 ～ 103. 0
Cudrat ricusxanthone D y = 90. 536 x+37. 827 0. 999 6 2. 30 ～ 115. 1
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　王枚博 ,等. RP-HPLC 法测定柘树根中四种异戊烯基口山酮的含量
表 3　精密度
Tab 3　Precision (n=3)
Reference
s tandard
C on cen t rat ion
(μg /m L)
In t ra-day
RSD(%)
Inter-day
RSD(%)
Cud rat ricu sxanthone B 2. 56 0. 18 0. 64
51. 20 0. 44 0. 03
128. 1 0. 19 0. 13
Maclu raxanthone B 2. 36 0. 97 0. 73
47. 20 0. 87 0. 18
117. 9 0. 60 0. 48
Cud rat ricu sxanthone F 2. 06 0. 73 0. 44
41. 20 0. 54 0. 82
103. 0 0. 49 0. 25
Cudrat ricus xan th on e D 2. 30 0. 65 0. 51
46. 00 0. 70 0. 77
115. 1 0. 25 0. 25
稳定性　取放置于室温的混合对照品溶液和供
试品溶液在 0 、24 、48 h 分别进样 20μL 作 HPLC 分
析 ,RSD < 0. 85%(n=3),表明对照品和供试品溶
液中的 4种异戊烯基口山酮至少在 48 h内稳定 。
重复性　取柘树根粉末 6份 ,按“供试品溶液的制
备”项下制备和测定 ,计算含量。结果柘树口山酮乙 、ma-
cluraxanthone B 、柘树口山酮己和柘树口山酮丁的 RSD分
别为 2. 34 %,4. 13%,3. 85%和 3.78%(n=6)。
加样回收率　精密称取混合对照品溶液适量 ,
分别减压浓缩至干 ,用 95%乙醇溶解转移至具塞锥
形瓶中 。取柘树根粉末 0. 5 g 6份 ,精密称定 ,分别
置于上述具塞锥形瓶中 ,依次按“供试品溶液的制
备”和“标准曲线”项下操作 ,计算加样回收率。结果
见表 4。
样品测定　按“供试品溶液的制备”项下操作 ,
制备供试品溶液 ,进行 HPLC 分析 ,结果见表 5。
表 4　4 种异戊烯基口山酮的加样回收率
Tab 4　Recovery of four prenylated xanthones
C om pound
Contained Added Determined
(mg)
Recovery Average recovery RSD
(%)
0. 099 8 0. 102 4 0. 198 7 96. 54 97. 03 1. 07
0. 100 2 0. 102 4 0. 200 2 97. 62
Cudrat ricu sxan th one B
0. 099 4 0. 102 4 0. 197 0 95. 27
0. 100 4 0. 102 4 0. 200 8 98. 07
0. 099 6 0. 102 4 0. 198 8 96. 83
0. 100 6 0. 102 4 0. 200 8 97. 83
0. 349 3 0. 354 0 0. 716 3 103. 67 100. 72 3. 86
0. 350 7 0. 354 0 0. 693 5 96. 82
Macluraxanthone B
0. 347 9 0. 354 0 0. 689 0 96. 34
0. 351 4 0. 354 0 0. 720 8 104. 36
0. 348 6 0. 354 0 0. 697 5 98. 57
0. 352 1 0. 354 0 0. 722 2 104. 54
0. 149 7 0. 154 5 0. 307 0 101. 80 103. 25 1. 69
0. 150 3 0. 154 5 0. 311 3 104. 21
Cudrat ricu sxan th one F
0. 149 1 0. 154 5 0. 304 2 100. 40
0. 150 6 0. 154 5 0. 311 3 104. 04
0. 149 4 0. 154 5 0. 310 3 104. 15
0. 150 9 0. 154 5 0. 312 9 104. 88
0. 149 7 0. 147 2 0. 292 4 96. 93 99. 31 3. 65
0. 150 3 0. 147 2 0. 299 9 101. 66
Cudrat ricusxanthone D
0. 149 1 0. 147 2 0. 289 7 95. 48
0. 150 6 0. 147 2 0. 301 7 102. 65
0. 149 4 0. 147 2 0. 290 4 95. 79
0. 150 9 0. 147 2 0. 303 0 103. 35
表 5　柘树根药材中 4 种异戊烯基口山酮的含量
Tab 5　Contents of Four Prenylated Xanthones in the roots of C. tricuspidata (n=3)
C om pound
Sample A
Con tent(%) RSD(%)
Sample B
Content(%) RSD(%)
Cudrat ricusxanthone B 0. 012 0.78 0. 017 1. 03
M acluraxan th one B 0. 051 0.80 0. 071 0. 74
Cudrat ricusxanthone F 0. 027 0.69 0. 025 2. 11
Cudrat ricusxanthone D 0. 031 0.58 0. 026 2. 19
讨　　　论
本实验选择的对照品均为含量较高的活性成
分[ 5 , 6] 。同时也对样品中峰面积比较大的其他色谱
峰与相应对照品进行了比对和指认 ,结果发现多为
无活性或活性较弱的黄酮类化合物。
异戊烯基口山酮化合物都有很强的紫外吸收 ,
190 ～ 400 nm 的紫外光谱图显示 , 4种对照品在该
波长范围内均有多个吸收峰 ,以 259 nm 附近的吸
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复旦学报(医学版)　2006 年 7 月 , 33(4)　
光度值较大。因为柘树口山酮乙的含量相对较低 ,故
选择该化合物的最大吸收波长 259 nm 为测定波
长 ,以提高其检测灵敏度 。
4种异戊烯基口山酮对照品的结构和极性较相
近[ 5 , 6] ,其中 macluraxanthone B 、柘树口山酮己和柘
树口山酮丁的极性尤为相似 ,因此色谱保留行为相
近 ,这给分离带来了一定的困难。
在流动相的选择中 ,首先对水相进行了摸索 。
由于 4种对照品的结构中均含有酚羟基 ,在酸性条
件下可以抑制酚羟基的离子化从而改善峰形 ,因此 ,
考察了多种酸性水溶液-甲醇系统的分离效果 ,结果
以 0. 2%磷酸或磷酸盐缓冲液(pH 2 ～ 3)为水相
时 ,对照品的峰形较尖锐 ,分离度相对较好。本实验
选择配制简便的 0. 2%磷酸为水相。其次 ,摸索了
单用甲醇或乙腈为有机相的分离效果 ,结果以恒配
比洗脱和梯度洗脱均未得到满意的分离条件 。根据
甲醇和乙腈对 4种对照品色谱行为影响的差异 ,优
化了甲醇-乙腈-0 . 2%磷酸系统的梯度洗脱程序 ,获
得了较好的分离效果 。最后 ,对柱温与流速进行了
优化 ,确定了本实验的色谱条件。在该条件下 ,各对
照品之间 ,对照品与杂质之间的分离度均大于 1. 5 ,
符合定量分析的要求 。
本实验同时测定 4种成分 ,为保证 4种成分都
能提取完全且杂质干扰少 ,比较了 70%、80%、95%
乙醇超声提取和加热回流提取 ,结果以 95%乙醇超
声 1 h提取完全 ,操作简便 。得到的提取液进一步
用大孔树脂纯化后 ,杂质干扰少 ,利于色谱分离 。
参　考　文　献
[ 1] 　江苏新医学院编. 中药大辞典[ M ] .上海:上海科学技术出版
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[ 2] 　国家中医药管理局《中华本草》编委会编.中华本草[ M] .上海:
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(1):131
(收稿日期:2006- 01- 27;编辑:刘忠英)
(上接第 558 页)
射防护与辐射安全基本标准为准则 ,运用辐射屏蔽
原理 ,根据拟安装医用加速器所具有的辐射物理特
点 ,并考虑到辐射防护发展的需求 ,即随着社会进步
生产力提高 ,年剂量限值在逐步降低 ,并且要做到尽
可能低的水平;而又随着肿瘤病人增加 ,工作负荷将
有所增加 ,对初级 X射线(有用射线束)、泄露 X 射
线 、散射 X射线 、漏射中子和中子门等屏蔽防护逐
一进行严谨的 、规范的和优化的屏蔽计算 ,得出拟安
装医用加速器室的所需的各辐射屏蔽结果。并将其
设计和计算出屏蔽结果委托具有评价资质的复旦大
学放射医学研究所进行放射屏蔽防护预评价 ,主防
护墙和各副防护墙屏蔽防护设计均符合辐射防护安
全要求。加速器机房建成后 ,由上海市环保局辐射
卫生监督所对该机房辐射屏蔽效果进行严格测试和
最后评价 ,评价结果各项屏蔽防护指标均符合国家
标准要求 。所以 ,加速器室屏蔽防护设计时 ,在满足
国家标准需要同时 ,又要考虑到辐射屏蔽的未来一
定的发展 ,既做到严格 、规范 、节约和优化 ,又不过度
屏蔽防护 ,并且不需要再重新进行辐射屏蔽建设就
能满足辐射屏蔽防护发展的需求 ,是优化的 、并且也
是经济的辐射屏蔽方法 。
参　考　文　献
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(收稿日期:2005- 09- 13;编辑:张秀峰)
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