全 文 ： ·360· Chin JMAP, 2009 May Vol. 26 No. 5 中国现代应用药学杂志 2009 年 5 月第 26 卷第 5 期
组织的滞留时间较短；⑦PCV-MEho与PCV-ME6相
比，前者粒径为后者的4倍。二者处方组成相似，
主要区别是前者表面活性剂用量小，必须用均质方
法方可得到粒径小于100 nm的系统。PCV-ME6脑内
浓度比PCV-MEho高。
4 讨论
静脉注射后，PCV-ME6 和 PCV-MEde 均呈现
了较高的脑内浓度。PCV-ME6 增加喷昔洛韦脑内浓
度可能是由于所用表面活性剂 Cremophor EL 有明
显的趋脑性[1]。PCV-ME6 药代动力学特征与前文[1]
PCV-ME 相似, 可能由于微乳所含混合表面活性剂、
油相和水相相同，仅比例不同。PCV-MEde 脑内浓度
较高，则是由于静注后喷昔洛韦血药浓度较高，导致
脑内浓度相应增高。PCV-ME6 脑内浓度比 PCV-MEho
高，可能是由于两者表面活性剂含量不同导致粒径大
小与分布不同，从而导致体内过程的差异。
静注后，PCV-MEde 在小鼠血浆和组织均快速
消除，0.75 h 后药物浓度有所回升，并在 1 或 2 h
出现峰值。这可能是微乳进入体内后，在血液的稀
释作用下，部分微乳解体，重新结合成稳定的去氧
胆酸钠-磷脂脂质囊泡结构，将喷昔洛韦包裹在亲水
的内核。由于喷昔洛韦的释放特征的改变，最终使
喷昔洛韦微乳的体内特征发生改变。
已有大量的研究显示胆盐和磷脂间的相互作
用。脱氧胆酸钠能够使细胞膜稳定性下降, 流动性
增强, 膜结构的有序性降低[4-5]。王建国[6]采用循环
伏安(CV)和交流阻抗(EIS)技术对于脱氧胆酸钠与
磷脂双层膜相互作用以及其影响因素进行探讨。结
果发现，脱氧胆酸钠使磷脂双层膜的结构发生了明
显改变, 使其表面形成孔洞或缺陷，且有时间和浓
度依赖性。不带电荷的脱氧胆酸较易进入磷脂双层
膜并与其发生作用, pH 值较高时，形成脱氧胆酸
的分子数目较少, 进入磷脂双层膜的速度较慢。磷
脂双层膜与脱氧胆酸钠作用形成缺陷后在 KCl
溶液中是可以自我修复, 重新自组装，形成新的较
完整的磷脂双层膜。因此，PCV-MEde 注射后，在
血浆的稀释作用下，可能发生了微结构的改变，去
氧胆酸钠与磷脂由于分子间强的相互作用，发生了
结合，形成了类似脂质囊泡的结构。脂质囊泡的形
成，将一部分喷昔洛韦增溶在囊泡的亲水内核。改
变了药物的释放，继而导致了体内药代动力学的改
变。其相关的机理正在研究中。

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收稿日期：2008-12-12


小连翘内生放线菌YBL-02菌株的初步鉴定和发酵产物分离

袁保红 1，杜青平 2，胡立勇 1（1.广东药学院基础学院，广州 510006；2.广东工业大学环境科学与工程学院，广州 510006）

摘要：目的 对小连翘(Hyperioums Sampsonii Hance.) 内生放线菌 YBL-02 菌株的进行分类、发酵及产物的提取和初步鉴定。
方法 根据形态学，培养特征等初步鉴定 YBL-02 菌株，并采用薄层色谱和红外光谱等对 YBL-02 发酵产物进行分离和初步
鉴定。结果 根据菌株的形态学，培养特征等初步将 YBL-02 菌株归属为链霉菌属。对 YBL-02 菌株发酵产物进行分离纯化，
最后得到具有活性的片状白色结晶体，测其熔点为 117~119 ℃。对该物质进行红外光谱分析后可得出为一种酰胺类化合物。
结论 YBL-02 菌株是一种链霉菌，其发酵产物中活性成分为一种酰胺类化合物。
关键词：内生菌；小连翘；放线菌；发酵
中图分类号：R282.71; R284.2 文献标识码：A 文章编号：1007-7693（2009）05-0360-04
基金项目：广东省科技计划项目（2006A10601005）
作者简介：袁保红，男，讲师 Tel:（020）39352196 Email: yuanbh2002@yahoo.com.cn
DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2009.05.004
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Taxonomy, Fermentation and Products Characterization of Actinomycete Strain YBL-02 from Hyperioums
Sampsonii Hance

YUAN Baohong1，DU Qingping2，HU Liyong1(1.Guangdong College of Pharmacy,Guangzhou 510006,China；2.Faculty of
Environmental Science and Engineering, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006 ,China)

ABSTRACT:OBJECTIVE Taxonomy of strain YBL-02 isolated from the roots of Hyperioums Sampsonii Hance was studied.
And the fermentative products of strain YBL-02 were collected and identified primarily.METHODS The characteristics of sub-
strate mycelium , aerial mycelium and growth on the different culture media were used to identify the strain YBL-02. Some tech-
niques, such as thin-layer chromatography, infra-red spectrum, were used to collected and identified the products of fermentation of
strain YBL-02.RESULTS Strain YBL-02 was an actinomycete by the primary taxonomic study. The fermentative products of
strain YBL-02 were a kind of lamellar white crystalline form. The melting point of the crystalline form was 117-119 .It was ident℃ i-
fied as a kind of chemical compound containing amide groups. CONCLUSION Strain YBL-02 is an actinomycete，and its fer-
mentative products were a kind of chemical compounds containing amide groups.
KEY WORDS:endophytic fungi;hyperioums sampsonii hance; actinomyces;fermentation

近来研究表明某些药用植物中个别内生菌能
够产生与宿主相同或者相似药理活性的成分[1]，由
此对药用植物内生真菌的研究引起人们的广泛关
注。文献报道，小连翘中含有聚（异）戊二烯二苯
甲酮类衍生物、萘骈双蒽酮类和黄酮类等多种化学
成分，这些成分是小连翘药理作用的主要有效成
分，但是要提取和分离这些药物成分还有很多困难
[2]。如果在小连翘内生菌中能够发现类似的活性物
质，无疑找到了一种可替代小连翘植物的新型生物
资源。从笔者前期对小连翘内生菌研究中，发现小
连翘具有丰富内生真菌，并且代谢产物中具有潜在
活性物质[3]。菌株 YBL-02 是在研究小连翘内生菌
的过程中得到的一株放线菌。该菌株的发酵液对革
兰氏阳性菌和肿瘤 KB 细胞都有较强的杀伤抑制作
用，具有潜在的研究价值。本研究对小连翘内生放
线菌 YBL-02 菌株参照阎逊初[4]的放线菌分类和鉴
定标准，对 YBL-02 菌株从形态学方法，即观察基
内菌丝、气生菌丝在各种培养基上的形态特征，有
无可溶性色素产生及生长状况，其细胞壁生化类型
和生理生化特征等方面进行了初步分类、对YBL-02
的发酵产物的提取过程进行探索，并对提取物做了
初步鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
菌株来源 菌株 YBL-02 分离所用材料为小连
翘根内部，采自中国科学院华南植物园（广州）。
采集其健康的组织，无其他病虫害，放于密封袋中，
于 4 ℃存放，尽快进行内生菌的分离，分离平板为
葡萄糖-天冬素培养基。
1.2 方法
1.2.1 形态及培养特征观察 菌株 YBL-02 在改良
的高氏培养基上涂菌并插入盖玻片，28 ℃培养 7～
10 d，用光学显微镜观察孢子丝与孢子形态。
1.2.2 生理生化特征及碳源利用 采用国际链霉
菌计划(ISP)规定的培养基和方法[5]进行培养特征和
生理生化特性研究。分别用 4 种不同的培养基，观
察 YBL-02 在这 4 种培养基上的特征。碳源利用的
测定采用常规鉴定方法[6]，配制缺碳源培养基，添
加各种碳源以检测放线菌对碳源的利用情况。
1.2.3 细胞壁化学类型分析 细胞壁 LL-二氨基庚
二酸（DAP）和甘氨酸分析和糖的分析参照
Lechevalier 的方法[7-8]。
1.2.4 YBL-02 菌株的发酵培养基 种子培养基
(%)：葡萄糖 0.5，可溶性淀粉 2.4，酵母膏 0.5，蛋
白胨 0.5，牛肉膏 0.3，玉米浆 0.4，CoCl2 0.000 2，
CaCO3 0.3，pH 自然。
发酵培养基(%)：甘油 2，糊精 2，酵母膏 0.3，
大豆蛋白胨 1，(NH4)2SO40.2，CaCO30.3，pH 7.2。
1.2.5 发酵产物分离与提取 YBL-02 菌株的孢子
接种于种子培养基中，500 mL 三角瓶装 100 mL 培
养基。28 ℃旋转(220 r·min-1)培养 48 h，以 2%的接
种量转种至发酵培养基中，500 mL 三角瓶装 100
mL 培养基。28 ℃旋转(220)培养，96 h 后收获发酵
液。对发酵液进行产物分离摸索，获得最佳分离条
件，并利用红外技术、核磁共振氢谱、质谱仪等对
发酵产物进行初步鉴定。
2 结果与分析
2.1 形态及培养特征
发现菌株 YBL-02 菌丝呈少分枝状，气生菌丝直
形，成熟后形成孢子丝，孢子丝呈波曲状。基内菌丝
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无横隔，不断裂，没有观察到孢囊和孢核等结构。孢
子链直，带有 10 个左右圆柱形孢子，孢子表面光滑，
大小为（0.4～0.5）μm×（0.7～0.8）μm，见图 1。

图 1 菌株 YBL-02 的孢子丝形态（×400）
Fig1 Spore chains of strain YBL-02 (×400)
2.2 生理生化特征及碳源利用
YBL-02 在这 4 种培养基上均能生长，且均无
色素产生，各培养基的培养特征见表 1。
表 1 菌株 YBL-02 在不同鉴定培养基上的培养特征
Tab 1 Cultural characteristics of YBL-02 on different culture
media
培养基特征 葡糖天门冬素 蔗糖察氏琼脂 淀粉琼脂 马铃薯块
生长情况 良好 良好 一般 一般
气生菌丝 1） 灰白 浅灰 浅灰 浅灰
基内菌丝 白色 灰白色 灰白色 灰变皱，薯块变黑
可溶性色素 无 无 无 无
注：1)颜色以《链霉菌鉴定手册》[6]彩页为标准
Note:1)Mycelin colors identification compared with 《Taxonomic outline of
streptomyces strins》
菌株 YBL-02 具有较弱的液化明胶能力，在 27
℃下可使牛奶凝固且胨化，淀粉水解弱养性，不能
利用纤维素生长，不能利用酪氨酸产黑色素，也不
能在培养基上产生 H2S气体。该菌株可利用葡萄糖、
蔗糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、鼠李糖而不能利
用肌醇、果糖、棉子糖做为碳源生长，结果见表 2。
表 2 菌株 YBL-02 的生理生化特性
Tab 2 Physiological and biochemical characteristics of strain
YBL-02
生理生化试验 结果 碳源 利用情况
明胶液化 ＋（弱） 葡萄糖 ＋
牛奶凝固与胨化 ＋ 果糖 －
淀粉水解 ＋（弱） 蔗糖 ＋
纤维素水解 － 阿拉伯糖 ＋
产 H2S － 甘露糖 ＋
利用酪氨酸产色素 － 肌醇 －
木糖 ＋
鼠李糖 ＋
棉子糖 －
注：+代表可利用或阳性，-代表不能利用或阴性
Note:+ is available or positive result, - is unavailable or negative result
2.3 类型分析
菌株 YBL-02 的全细胞水解物中含 LL-二氨基
庚二酸(LL-DAP)和甘氨酸；无特征性糖；说明该菌
细胞壁属胞壁 I 型。
2.4 YBL-02 菌株发酵产物分离
YBL-02 菌株的发酵液 (96 h)经离心 (2 800
r·min-1)、减压抽滤后，呈灰白色，然后用 NaOH 调
至 pH 8.0，以乙酸乙酯提取。提取液经无水硫酸钠
脱水后减压浓缩，得到灰白色的 YBL-02 粗品。粗
品溶于氯仿-甲醇(10∶1)上硅胶柱(GF254)层析，用
氯仿-甲醇(30∶1，20∶1，10∶1，5∶1)梯度洗脱，
分部收集样品。浓缩后得 3 份样品，分别溶于甲醇，
进行 SephadexLH-20 柱层析，以甲醇洗脱，收集活
性组分。减压浓缩后再经反相中压液相柱层析
(YMC-ODS，50 cm×1.5 cm)，用乙腈-10 mmol 磷酸
盐缓冲液(pH 7.0)(45∶55，50∶50，55∶45，60∶40)
梯度洗脱，用高效液相色谱(HPLC)进行跟踪检测。
收集活性成分。HPLC 条件:层析柱为 InertislODS-2
(250 mm×4.6 mm)，流动相为乙腈-10 mmol·L-1磷酸
缓冲液(pH 7.0)(70∶30)，流速为 1 mL·min-1，检测
波长为 210 nm。经上述提取和分离得到 1 个活性组
分。再用乙酸乙酯洗提并收集到试管内，经反复结
晶纯化后得到片状白色晶体物质。
2.5 发酵产物的初步鉴定
取小片白色晶体置于测定溶点的仪器上，测得
其溶点约为 117~119 ℃。对其进行红外光谱测定和
分析。从红外图谱可知，3 525.2 cm-1为 OH 基团的
吸收峰，3 209.7 cm-1为NH基的吸收峰，1 720.0 cm-1
和 1 685.0 cm-1 为羰基的吸收峰(出现肩峰)，由于
3 209.7 cm-1 和 1 685.0 cm-1 有酰胺基团的特征吸收
峰，因此可推断此类化合物含有酰胺基团。从核磁
共振氢谱(1H-NMR)可知,化学位移 δH 7.884 可证实
此化合物含有一个 NH 基，δH 4.222 和 δH 4.201 可知
该化合物有一个亚甲基(-CH2-)，δH 0.980， δH 0.993
和 δH 1.228，δH 1.206 可知含有两个甲基(-CH3),另外
根据质谱仪测定该化合物的分子量为 281。因此获
得其分子式为：C16H27NO3。
3 讨论
从分离的内生真菌的发酵产物中寻找出与宿
主相同或相似的生理活性成分，毫无疑问对于解决
生态问题、开发新的药物资源具有重要的理论和现
实意义。近年来，已有多种药用植物内生真菌分离
出来，并且有些内生菌的药用活性成分已经能够鉴
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定和合成出来[9-11]。在前期研究中发现，小连翘内
生真菌中多数种类（约 54.32%）能够抑制一种或者
多种病原菌的生长，这表明小连翘内生真菌中存在
着广泛的抗菌生物活性资源，这些内生真菌及其代
谢产物在植物对抗病原菌的过程中占有一定的地
位[3]。因此，本研究对小连翘植株内一株有潜在研
究价值的内生放线菌进行了进一步研究。根据
YBL-02 的形态特征、培养特征及生理生化特征，
参考《放线菌的分类和鉴定》[4]，发现 YBL-02 菌
株的各项形态特征、培养特征和生理生化特征与链
霉菌很类似，因此可初步确定 YBL-02 为链霉菌。
在此基础上，对 YBL-02 菌株进行发酵，并获得发
酵产物白色片状结晶体。通过红外技术，确定该白
色结晶物质是一种带有酰胺集团的化合物，其分子
结构为 C16H27NO3。
植物内生菌作为一种新的微生物资源，从内生
菌中寻找和发现新的活性化合物是植物内生菌研究
的一个热点。植物内生菌狭义上是指生活在植物活
组织内而不引起植物病变的一大类真菌微生物[12]。
但是，近年的研究发现，植物内生菌种类不仅仅局
限于真菌，放线菌和细菌的研究也时有报道[13]；在
药用植物内生菌的利用方面，人们希望通过内生菌
发酵合成药用活性成分。目前已有多种药用植物内
生菌分离出来，其药用活性成分得到鉴定和合成的
报道[10-11,14]。药用植物内存在着广泛的内生菌，这
些内生菌可能成为生物防治和生物制药中有潜力
的生物因子，在生态农业和生物农药研制方面具有
重要的用途[15]。研究内生菌的各种次生代谢产物及
其作用机制，在农业和（或）医药业中具有重要的
应用潜力。因此从药用植物的内生菌的发酵液中发
现、开发出新一代高效低毒的药物不仅可能，而且
很有前途。对小连翘内生放线菌发酵产物的进一步
研究将为寻找新的活性物质开辟了新的途径，具有
诱人的研究前景。

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